劉茜桐，田莉，解晉琳，師娟子

(西北婦女兒童醫(yī)院，西安 710003)

輔助生殖領(lǐng)域中，胚胎植入前遺傳學篩查(PGS)已廣泛應用于篩查整倍體胚胎，改善妊娠結(jié)局。近年，隨著細胞遺傳學方法的改進，可以對單細胞進行全染色體的篩查，因此，嵌合體胚胎的診斷率提高。但是，關(guān)于嵌合體胚胎的文獻報道較少，本文就嵌合體胚胎的發(fā)生機制、發(fā)生率，以及移植后臨床結(jié)局做一綜述。

一、嵌合體胚胎的發(fā)生機制

嵌合體胚胎包含兩種及以上不同染色體成分的細胞系，是因減數(shù)分裂中染色體分離錯誤所致。在兩細胞期就可以出現(xiàn)嵌合體，但是臨床上多見于在囊胚期進行滋養(yǎng)外胚層細胞活檢，因為在這一時期可以活檢的細胞數(shù)更多[1]。滋養(yǎng)外胚層細胞活檢是否能代表整個胚胎受諸多因素影響，例如嵌合的類型和程度、活檢細胞數(shù)量、活檢部位，以及操作方法等。種植前遺傳學診斷國際協(xié)會(PGDIS)規(guī)定異常細胞占比20%～80%為嵌合體胚胎，>80%為非整倍體胚胎，<20%為整倍體胚胎。染色體嵌合導致染色體增加和/或丟失主要有三種機制：染色體不分離、后期延遲和核內(nèi)復制。

1. 染色體不分離：染色體不分離是姐妹染色單體在有絲分裂過程中沒有分離。因此整個染色體(包括兩條染色單體)被牽引到一個細胞內(nèi)，導致一個細胞是單體性而另一個細胞是三體性。如果不分離發(fā)生在細胞分化之前，例如在種植前的胚胎，將形成普遍嵌合。如果不分離發(fā)生在分化之后，例如滋養(yǎng)層，胎盤將包含嵌合細胞系，而胚胎可以是整倍體。

種植前染色體不分離的概率無統(tǒng)一結(jié)論，主要和發(fā)育的階段和涉及的染色體有關(guān)。例如，導致常染色體第一次和第二次減數(shù)分裂形成非整倍體的機制和染色體不分離的可能性最小，但是染色體不分離卻是性染色體在第一次卵裂期分裂中的主要機制。因此，染色體在不同發(fā)育階段對不分離的敏感性不同。

2.后期延遲：后期延遲是有絲分裂后期，單個染色單體沒有進入子代細胞核隨后丟失，導致一個細胞里該染色體是單體性而另一個細胞里是二體性。如果染色單體沒有附著于紡錘體，或者染色單體雖然附著于紡錘體但是后來沒有進入細胞核，即為后期延遲。如果后期延遲發(fā)生在分化前，將包含兩種細胞系，導致普遍嵌合。如果后期延遲發(fā)生在分化后的滋養(yǎng)層細胞，胎盤將包含正常和單體性細胞系，例如限制性胎盤嵌合體(confined placental mosaicism，CPM)。

Loannou等[2]利用丟棄的第5天的胚胎進行檢測，發(fā)現(xiàn)單體性發(fā)生率是三體性的7倍。這一發(fā)現(xiàn)提示后期延遲是人類種植前胚胎嵌合體的主要原因。Coonen等[3]和Capalbo等[4]發(fā)現(xiàn)后期延遲比不分離的發(fā)生率高3～5倍。

3. 核內(nèi)復制：核內(nèi)復制是有絲分裂后，子代細胞內(nèi)某一條或幾條染色體再次發(fā)生復制，導致一個細胞里有三體性染色體而另一個細胞里是二體性染色體。染色體增加有兩種可能機制：一種是由于細胞周期功能障礙，一個染色體復制但是隨后沒有細胞質(zhì)分裂，另一種是有絲分裂開始后很快結(jié)束，導致染色體復制。無論發(fā)生機制如何，結(jié)果都會導致一條染色體的增加。核內(nèi)復制又稱為多倍體。多倍體可以出現(xiàn)在血液、腸道、皮膚和大腦中[5]。

二、嵌合體胚胎發(fā)生率

既往研究報道胚胎嵌合體發(fā)生率不一，從30%到90%不等[5-6]，歐洲人類生殖與胚胎學會指南(ESHRE)給出的嵌合體發(fā)生率為40%～60%。報道的差異可能和應用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)有關(guān)。FISH技術(shù)可以檢測每個細胞的細胞遺傳學信息，因此很多文獻應用該技術(shù)進行檢測。但是FISH技術(shù)本身存在局限性，例如需要細胞固定，該操作難以掌握，且方法多樣，部分方法出錯率很高，并且診斷胚胎異常的標準不一[7]。檢測的材料對結(jié)果也有影響，如果檢測的是發(fā)育阻滯的胚胎，則出現(xiàn)嵌合體的幾率比形態(tài)正常的胚胎高。實驗室培養(yǎng)環(huán)境(溫度、pH值、培養(yǎng)液成分等)也會影響嵌合體胚胎的診斷。無論是卵裂期胚胎或囊胚應用合適的FISH方法，嵌合體的檢出率都可控制在30%左右。

單核苷酸多態(tài)性(SNP)、比較基因組雜交(aCGH)、定量PCR(qPCR)和二代測序(NGS)等分子細胞學技術(shù)比FISH更具有優(yōu)勢，可以同時對24對染色體進行檢測。但是由于對每個細胞都進行檢測費用昂貴，因此很少用于診斷胚胎是否為嵌合體。很多新的研究應用全面染色體篩查(CCS)技術(shù)，通過囊胚活檢，一次活檢約5個細胞作為一個整體進行分析。由于正常細胞和非整倍體細胞混合檢測，難以準確診斷嵌合體。不同檢測方法得出卵裂期胚胎活檢嵌合體發(fā)生率在15%到75%[8-9]。

由于卵裂期胚胎嵌合體發(fā)生率高，目前學界傾向于對第5天或第6天囊胚進行滋養(yǎng)外胚層活檢，同時應用CCS技術(shù)，對胚胎進行更全面的評估[10]。囊胚期活檢的優(yōu)點在于比起卵裂期胚胎，可以活檢更多的細胞(大約5～10個)，對非整倍體篩查更加全面。嵌合體囊胚的多細胞活檢容易檢出不同細胞系來源的細胞，單次活檢即可以做出診斷。文獻報道卵裂期嵌合體發(fā)生率最高，在15%～90%，囊胚活檢嵌合體發(fā)生率在3%～24%之間[11-13]。

和非整倍體不同，嵌合體發(fā)生率不會隨著年齡增大而增加，不同年齡的女性囊胚嵌合體發(fā)生率均約為30%。但是，由于高齡女性更容易出現(xiàn)減數(shù)分裂錯誤，囊胚活檢細胞全部為整倍體細胞的幾率降低，文獻報道35歲以下的女性整倍體細胞占48.2%，42歲以上的女性僅占10.6%[7]。有絲分裂錯誤導致嵌合體的發(fā)生，減數(shù)分裂錯誤導致非整倍體發(fā)生，而有絲分裂錯誤可伴隨減數(shù)分裂錯誤從而導致胚胎嵌合體，因此對這部分人群可進行胚胎植入前非整倍體篩查(PGS-A)。目前應用非常廣泛的是NGS技術(shù)，由于測序深度和平臺的不同，檢測細胞的敏感性也不同，因此導致PGS-A的結(jié)果也可能出現(xiàn)不同。

三、如何檢測出嵌合體胚胎

NGS有多個平臺，檢測嵌合體的敏感性也不同。國際上最廣泛應用的高分辨NGS(hr-NGS)方法是Illumina公司的VeriSeq PGS。利用MiSeq臺式測序儀，對短片段DNA序列進行讀取。不需要對每一個染色體片段都進行測序，為了降低檢測費用，只需要同時檢測部分DNA“條形碼”，以判斷被檢測標本是否為嵌合體[14]。hr-NGS可以檢測出異常細胞占20%～80%的嵌合體，由于每個囊胚平均活檢5～10個細胞，hr-NGS可以檢測出1/5(20%)至4/5(80%)的嵌合性。但是，也有觀點質(zhì)疑hr-NGS診斷嵌合體的準確性。有研究認為hr-NGS不能區(qū)別低比例嵌合和背景噪音[15]，還有觀點認為嵌合體檢測存在缺陷，如果三體和單體細胞數(shù)目相等，檢測結(jié)果將會是整倍體[16]。但是一項初步研究[17]通過對同一胚胎進行多次活檢，然后應用hr-NGS進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)28個胚胎中僅有兩個胚胎同時有單體和三體細胞系，提示這種現(xiàn)象很少發(fā)生，因為當胚胎發(fā)育到囊胚期時一個異常細胞系已經(jīng)替代另一異常細胞系。

aCGH應用Illumina公司的Bluefuse分析軟件，也用于嵌合體胚胎的診斷，但是相比hr-NGS，其對多細胞樣本的檢測動態(tài)范圍窄(異常細胞約占40%～60%)、錯誤率高[18]，難以區(qū)分背景噪音和嵌合。Maxwell 等[19]進行了驗證性研究，對aCGH診斷為整倍體胚胎但移植后流產(chǎn)，用NGS對囊胚滋養(yǎng)外胚層細胞DNA樣本擴增產(chǎn)物重新檢測，發(fā)現(xiàn)其中31.6%的胚胎為嵌合體，5.2%為多倍體。也有文獻報道第3天胚胎行aCGH活檢，再用FISH重新檢測，發(fā)現(xiàn)aCGH的假陽性率是2%～3%[11]。由于aCGH也是將整倍體細胞和非整倍體細胞混合檢測，當樣本中≥35%的細胞是非整倍體細胞aCGH才能檢測出來[20]，敏感性和準確性較差。

細胞活檢技術(shù)本身也會影響結(jié)果。雖然沒有完全證實，但是觀察發(fā)現(xiàn)應用激光或機械牽拉進行細胞活檢可能導致人為的染色體丟失或增加。如果活檢的細胞中有已經(jīng)死亡或凋亡的細胞，會導致樣本污染，影響DNA擴增，從而將正常胚胎誤診為嵌合體。還有一種比較極端的情況是當異常細胞局限于胚胎的某一區(qū)域，容易造成將嵌合胚胎誤認為整倍體或非整倍體。但是，目前證據(jù)證實嵌合體胚胎的異常細胞一般是均勻隨機分布的，因為受精后的前幾次有絲分裂容易出錯，從而導致嵌合體的異常細胞分散分布。

四、嵌合體胚胎移植后流產(chǎn)率和生育健康孩子的幾率

當PGS檢測結(jié)果同時有整倍體和嵌合體時，應優(yōu)先選擇整倍體胚胎進行移植。但是如果檢測結(jié)果僅有嵌合體胚胎，是否應該移植嵌合體胚胎仍然有爭議。Bolton等[21]通過構(gòu)建小鼠嵌合體模型，發(fā)現(xiàn)非整倍體細胞的結(jié)局取決于細胞譜系。胎兒譜系的非整倍體細胞可通過凋亡清除，胎盤譜系的非整倍體細胞出現(xiàn)嚴重的生長缺陷。Fiorentino等[22]研究發(fā)現(xiàn)，移植18個嵌合體胚胎(嵌合細胞占35%～50%)，其中6個最終正?；町a(chǎn)。文獻報道約40%的嵌合體胚胎移植后可以獲得妊娠[11，23-24]，但是與滋養(yǎng)外胚層細胞活檢正常的囊胚相比，嵌合體胚胎種植率低，流產(chǎn)風險高，且復雜嵌合體(約占總胚胎的4.5%)比僅有一兩條染色體嵌合的胚胎明顯種植率低[24]。PGS診斷為嵌合體的胚胎有自我糾正的機制，學說包括以下幾種：整倍體細胞優(yōu)勢生長、異常細胞自我糾正、正常細胞向內(nèi)細胞團聚集。三體細胞群可通過后期延遲或染色體不分離以丟失多余的染色體達到自我糾正[25]，但是這種情況可能性很小，因為在囊胚檢測中很少發(fā)現(xiàn)單親二體[26]。研究發(fā)現(xiàn)非整倍體細胞生長慢，可在細胞凋亡過程中死亡，在胚胎發(fā)育過程中數(shù)量逐漸減少，最終健康胎兒出生。嵌合發(fā)生的染色體號數(shù)和持續(xù)種植率無關(guān)，除了17號染色體外，幾乎所有出現(xiàn)嵌合的染色體都有最終妊娠。染色體的大小和持續(xù)種植率也無關(guān)，但是大染色體的嵌合部分顯著比小染色體多。

對于活檢滋養(yǎng)外胚層的5～10個細胞能否準確代表整個胚胎仍不清楚，因此這就可以解釋為什么異常細胞>40%的嵌合胚胎移植后也有著床的。胎兒或新生兒的嵌合型可導致先天畸形，自閉癥和精神發(fā)育遲緩。每條染色體的嵌合型都可能導致異常表型。異常表型可能胎兒發(fā)育正常，也可能受到嚴重影響，基因型與表型的關(guān)系很難判斷。因此，理論上所有移植嵌合體胚胎的妊娠和活產(chǎn)都應該檢查胎兒染色體核型，并且對孩子的發(fā)育進行長期隨訪。PGDIS指南建議，對于移植嵌合胚胎妊娠的女性需做羊水穿刺進行產(chǎn)前診斷。僅進行無創(chuàng)產(chǎn)前檢查和絨毛活檢是不夠的，因為它們只檢查滋養(yǎng)外胚層(形成胎盤)，并不能檢測內(nèi)細胞團(形成胎兒)。

五、如何處置嵌合體胚胎

是否移植嵌合體胚胎需要考慮多方面因素[27]，例如PGD的檢測方法、嵌合程度、嵌合發(fā)生在哪條染色體、患者的要求等。一些實驗室用截點值來區(qū)分嵌合型胚胎是正?；虍惓?，通常把異常細胞的截點值定為40%或50%，但是這樣容易出現(xiàn)假陽性(浪費正常胚胎)和假陰性(導致誤診和可能的并發(fā)癥)[28]。嵌合體是除了整倍體和非整倍體以外的第三種胚胎類型，在移植級別中次優(yōu)于整倍體胚胎。如果沒有整倍體胚胎，根據(jù)患者的需求，進行遺傳咨詢，在充分了解風險和知情同意的情況下，可以考慮移植嵌合體胚胎[29-30]。對于移植嵌合體胚胎妊娠的患者，建議行產(chǎn)前診斷。

六、展望

隨著科技的發(fā)展，未來有望能準確診斷嵌合體胚胎，這樣可以避免丟棄可用胚胎，對于卵巢儲備功能差、無整倍體胚胎的患者可以增加移植機會。為了了解嵌合體的真實發(fā)生率，需要對全面染色體篩查實驗室制定標準化流程和共識。同時，也需要進一步研究和長時間隨訪以了解嵌合體胚胎移植后的結(jié)局。

【參考文獻】

[1] Vera-Rodriguez M，Rubio C. Assessing the true incidence of mosaicism in preimplantation embryos[J].Fertil Steril，2017，107：1107-1112.

[2] Loannou D，F(xiàn)onseka KG，Meershoek EJ，et al. Twenty-four chromosome FISH in human IVF embryos reveals patterns of post-zygotic chromosome segregation and nuclear organisation[J]. Chromosome Res，2012，20： 447-460.

[3] Coonen E，Derhaag JG，Dumoulin JC，et al. Anaphase lagging mainly explains chromosomal mosaicism in human preimplantation embryos[J]. Hum Reprod，2004，19： 316-324.

[4] Capalbo A，Bono S，Spizzichino L，et al. Sequential comprehensive chromosome analysis on polar bodies，blastomeres and trophoblast： insights into female meiotic errors and chromosomal segregation in the preimplantation window of embryo development[J]. Hum Reprod，2013，28： 509-518.

[5] Taylor TH，Gitlin SA，Patrick JL，et al. The origin，mechanisms，incidence and clinical consequences of chromosomal mosaicism in humans[J]. Hum Reprod Update，2014，20： 571-581.

[6] Colls P，Escudero T，Cekleniak N，et al. Increased efficiency of preimplantation genetic diagnosis for infertility using “no result rescue”[J]. Fertil Steril，2007，88： 53-61.

[7] Munne S，Wells D. Detection of mosaicism at blastocyst stage with the use of high-resolution next-generation sequencing[J]. Fertil Steril，2017，107： 1085-1091.

[8] Mertzanidou A，Wilton L，Cheng J，et al. Microarray analysis reveals abnormal chromosomal complements in over 70% of 14 normally developing human embryos[J]. Hum Reprod，2013，28： 256-264.

[9] Wells D，Delhanty JD. Comprehensive chromosomal analysis of human preimplantation embryos using whole genome amplification and single cell comparative genomic hybridization[J]. Mol Hum Reprod，2000，6： 1055-1062.

[10] Weissman A，Shoham G，Shoham Z，et al. Chromosomal mosaicism detected during preimplantation genetic screening： results of a worldwide Web-based survey[J]. Fertil Steril，2017，107： 1092-1097.

[11] Greco E，Minasi MG，F(xiàn)iorentino F. Healthy Babies after Intrauterine Transfer of Mosaic Aneuploid Blastocysts[J]. N Engl J Med，2015，373： 2089-2090.

[12] Ruttanajit T，Chanchamroen S，Cram DS，et al. Detection and quantitation of chromosomal mosaicism in human blastocysts using copy number variation sequencing[J]. Prenat Diagn，2016，36： 154-162.

[13] Capalbo A，Wright G，Elliott T，et al. FISH reanalysis of inner cell mass and trophectoderm samples of previously array-CGH screened blastocysts shows high accuracy of diagnosis and no major diagnostic impact of mosaicism at the blastocyst stage[J]. Hum Reprod，2013，28： 2298-2307.

[14] Kung A，Munne S，Bankowski B，et al. Validation of next-generation sequencing for comprehensive chromosome screening of embryos[J/OL]. Reprod Biomed Online，2015，31： 760-769.

[15] Capalbo A，Ubaldi FM，Rienzi L，et al. Detecting mosaicism in trophectoderm biopsies： current challenges and future possibilities[J]. Hum Reprod，2017，32： 492-498.

[16] Scott RT Jr，Galliano D. The challenge of embryonic mosaicism in preimplantation genetic screening[J]. Fertil Steril，2016，105： 1150-1152.

[17] Garrisi J，Walmsley RH，Bauckman K，et al. Discordance among serial biopsies of mosaic embryos[J]. Fertil Steril，2016，106(Suppl)：e151.

[18] Fiorentino F，Biricik A，Bono S，et al. Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos[J]. Fertil Steril，2014，101： 1375-1382.

[19] Maxwell SM，Colls P，Hodes-Wertz B，et al. Why do euploid embryos miscarry? A case-control study comparing the rate of aneuploidy within presumed euploid embryos that resulted in miscarriage or live birth using next-generation sequencing[J]. Fertil Steril，2016，106： 1414-1419 e1415.

[20] Mamas T，Gordon A，Brown A，et al. Detection of aneuploidy by array comparative genomic hybridization using cell lines to mimic a mosaic trophectoderm biopsy[J]. Fertil Steril，2012，97： 943-947.

[21] Bolton H，Graham SJ，Van der Aa N，et al. Mouse model of chromosome mosaicism reveals lineage-specific depletion of aneuploid cells and normal developmental potential[J]. Nat Commun，2016，7： 11165.

[22] Fiorentino F. Clinical outcome derived after transfer of embryos with chromosomal mosaicism[J].Hum Reprod，2016，31(suppl 1)：513.

[23] Fragouli E，Alfarawati S，Spath K，et al. Analysis of implantation and ongoing pregnancy rates following the transfer of mosaic diploid-aneuploid blastocysts[J]. Hum Genet，2017，136： 805-819.

[24] Munne S，Blazek J，Large M，et al. Detailed investigation into the cytogenetic constitution and pregnancy outcome of replacing mosaic blastocysts detected with the use of high-resolution next-generation sequencing[J]. Fertil Steril，2017，108： 62-71 e68.

[25] Bazrgar M，Gourabi H，Valojerdi MR，et al. Self-correction of chromosomal abnormalities in human preimplantation embryos and embryonic stem cells[J]. Stem Cells Dev，2013，22： 2449-2456.

[26] Gueye NA，Devkota B，Taylor D，et al. Uniparental disomy in the human blastocyst is exceedingly rare[J]. Fertil Steril，2014，101： 232-236.

[27] Munne S，Grifo J，Wells D. Mosaicism： “survival of the fittest” versus “no embryo left behind”[J]. Fertil Steril，2016，105： 1146-1149.

[28] Capalbo A，Rienzi L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass[J]. Fertil Steril，2017，107： 1098-1106.

[29] Harton GL，Cinnioglu C，F(xiàn)iorentino F. Current experience concerning mosaic embryos diagnosed during preimplantation genetic screening[J]. Fertil Steril，2017，107： 1113-1119.

[30] Besser AG，Mounts EL. Counselling considerations for chromosomal mosaicism detected by preimplantation genetic screening[J/OL]. Reprod Biomed Online，2017，34： 369-374.