程楠 韓詠竹

肝豆狀核變性（hepatolenticular degeneration，HLD）又稱Wilson?。╓ilson's disease，WD），是一種主要累及肝臟和大腦基底神經(jīng)節(jié)的常染色體隱性遺傳銅代謝障礙疾病，血清銅藍蛋白減低、24 h尿銅和肝銅含量增高是其主要生化改變［1］。包括筆者在內(nèi)的多項WD流行病學研究表明，中國人WD的患病率明顯高于歐美人群，尤應受到臨床醫(yī)師的關(guān)注和重視［2?3］。

作為可治性神經(jīng)遺傳病，早期診斷和及時干預治療對WD的病情和預后至關(guān)重要。由于WD患者與雜合子之間的銅代謝檢查結(jié)果存在部分重疊，在判斷WD家系成員和臨床表現(xiàn)不典型的WD疑診患者是否患病抑或是雜合子時存在困難，而基因診斷有著不可比擬的價值，其重要性日益凸顯，與之相關(guān)的基因治療研究也方興未艾［4?6］?，F(xiàn)根據(jù)文獻將應用于WD分子診斷的各種基因診斷方法、適應范圍及近年來基因治療的研究進展進行簡要概括，以期對WD患者的臨床診療有所裨益。

1 WD基因及其發(fā)病機制

WD基因（ATP7B基因）位于13q14.3，全長約80 kb，含有21個外顯子和20個內(nèi)含子，其cDNA編碼一種由1 465個氨基酸殘基組成的P型銅轉(zhuǎn)運ATP酶（ATP7B蛋白）。目前已發(fā)現(xiàn)超過500種ATP7B基因的突變類型，多為復合雜合突變，純合突變少見，不同種族和人群的突變特征存在明顯差異［5，7］。

研究表明，WD患者因ATP7B基因突變，位于反面高爾基網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（trans Golgi network，TGN）的ATP7B蛋白功能缺陷，不能將肝細胞中的銅離子與銅藍蛋白前體結(jié)合而出現(xiàn)銅藍蛋白合成障礙，同時位于膽管膜側(cè)的ATP7B蛋白不能將細胞內(nèi)多余的銅離子隨膽汁排出，導致過量的銅在肝臟、大腦和角膜等部位沉積而發(fā)病，患者以急慢性肝炎、肝硬化、錐體外系癥狀及角膜K?F環(huán)等為主要臨床表現(xiàn)，嚴重者可危及生命［8］。

2 WD的基因診斷

基因診斷可對無臨床表型的癥狀前期WD患者或雜合子作出準確診斷，特別對有家族史的個體或產(chǎn)前的胎兒是否攜帶WD致病基因具有指導意義?，F(xiàn)簡要介紹各種先后應用于WD基因診斷的技術(shù)方法。

2.1 限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）?家系連鎖分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation polymor?phism，SSCP）、變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）和實時熒光定量 PCR（quantitative real?time PCR，QPCR）分析

自上世紀80年代以來，國內(nèi)外學者先后探索采用RFLP?家系連鎖分析、SSCP、DHPLC和QPCR分析等各種用于遺傳病基因診斷的技術(shù)開展了WD基因診斷的研究，并嘗試將其用于WD疑診患者、無臨床癥狀的WD家系成員及WD雜合子的診斷［9?12］。受當時技術(shù)條件限制，這些方法均存在明顯的缺陷：RFLP?家系連鎖分析需與同一家系的先證者進行比較，不能對無WD家族史或家系中先證者已死亡的可疑WD患者進行診斷；SSCP、DHPLC和QPCR分析雖然操作簡便、靈敏度較高，但均不能明確ATP7B基因突變的部位和性質(zhì)。隨著DNA Sanger測序技術(shù)的應用和普及，這些方法已較少用于WD的基因診斷。

2.2 DNA Sanger測序分析

由于能明確ATP7B基因突變的具體部位和性質(zhì)，采用DNA Sanger測序?qū)D基因各外顯子進行序列分析是最為準確可靠的方法，被公認為WD基因診斷的“金標準”。自Thomas等首先采用該技術(shù)檢測WD患者基因突變以來，針對不同種族和人群WD患者的研究積累了大量的研究資料并用于 WD 的臨床診斷［4?5，12］。

筆者等［13］采用Sanger測序?qū)碜晕覈A中和華東地區(qū)的139例非同源家系的WD患者ATP7B基因第13號外顯子進行DNA序列檢測，結(jié)果共檢出6種ATP7B基因的突變類型和1種多態(tài)，其中p.Gly988Val雜合突變?yōu)槭状螆蟮?，總的檢出率為29.49%（41/139），染色體突變頻率為16.19%（45/278），證實了第13號外顯子是中國人WD基因的突變熱區(qū)之一。Dong等［14］應用DNA直接測序技術(shù)在632例無血緣關(guān)系的中國人WD患者中共檢出161種ATP7B基因的突變，其中58種為新的發(fā)現(xiàn)，總檢出率超過90%（569/632），其中有14種突變類型占所有檢出突變患者的94%（537/569）。該研究不僅得到較為完整的中國人WD基因突變譜，且進一步證實了WD基因呈少數(shù)高頻突變類型較為集中而罕見突變類型散在分布的特點。

DNA Sanger測序雖然準確性和可靠性均較高，但對人員、設備要求高，難在一般醫(yī)院中推廣。由于WD基因全長約80 kb，各外顯子突變形式多種多樣，對所有外顯子逐一測序分析花費高、周期長，且不能對其非編碼區(qū)進行逐一檢測，因此，WD的基因診斷亟需各種高通量且費用相對低廉的檢測方法。

2.3 DNA微陣列芯片突變分析

DNA微陣列芯片突變分析技術(shù)因其固相雜交而具有的并行性和高通量等特點，在生物分子信息獲取、基因多態(tài)性檢測和基因表達譜監(jiān)測等方面具有明顯優(yōu)勢［15］，與WD基因高度遺傳異質(zhì)性的特點相契合，一度被認為是極具潛力的WD基因檢測方法。如Gojová等［16］開發(fā)了一種可檢測87種ATP7B基因突變的DNA微陣列芯片，在97例捷克和斯洛伐克的WD患者中檢出43種突變。Mathur等［17］則應用一種可用于檢測ATP7B基因突變的低密度DNA微陣列芯片技術(shù)，在印度裔WD患者中檢出62種突變，其敏感性超過80%。但由于該技術(shù)固有的假陽性或假陰性率高等缺陷，目前已被更高通量和準確性且更具性價比的Mas?sARRAY和二代測序技術(shù)（next?generation sequenc?ing，NGS）替代。

2.4 MassARRAY突變分析

MassARRAY是將多重PCR技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)和芯片技術(shù)以及生物信息學方法結(jié)合于一體的新一代分子生物學檢測平臺，具有高通量、高質(zhì)量、低成本、簡單、靈活等優(yōu)勢，目前已廣泛用于基因分型、表觀遺傳學、拷貝數(shù)變異、病原體分型和產(chǎn)前診斷等研究［18］。由于WD的基因突變以點突變形式為主，MassARRAY是進行大樣本、高通量WD基因突變檢測的有力工具。筆者等［19］基于該技術(shù)平臺篩查了來自800個不同家系的1 222例WD確診患者的ATP7B基因突變，結(jié)果在1 084例患者檢出63種已知的突變類型，其中超過80%患者的突變位于第8、13、18、16和12外顯子?；蛐团c臨床表現(xiàn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢出p.Arg778Leu突變的患者發(fā)病年齡更低，且其銅代謝指標（銅藍蛋白和血清銅）的水平也顯著低于未檢出該突變的患者；檢出p.Arg919Gly突變的多為腦型患者（以神經(jīng)系統(tǒng)癥狀起?。?，而檢出p.Thr935Met突變的患者則多為腦?內(nèi)臟型患者（神經(jīng)系統(tǒng)和肝、腎等臟器均明顯受損）。該研究證實了MassARRAY用于檢測WD患者基因突變的優(yōu)勢和價值。

2.5 NGS突變分析

NGS作為新興的高通量測序技術(shù)，一次可以對幾十萬甚至幾百萬條DNA分子進行序列測定，使得一次性對一種物種的基因組或轉(zhuǎn)錄組進行細致全貌分析成為可能，是對傳統(tǒng)測序技術(shù)的一次革命，被廣泛應用于生命科學特別是基因組學研究的方方面面，例如基因組從頭測序（de novo）、重測序（re?sequencing）、基因組結(jié)構(gòu)分析、轉(zhuǎn)錄組測序、表達譜分析、小RNA及非編碼RNA測序、表觀遺傳學研究等［20?21］。

由于NGS的高通量檢測特性與WD基因的結(jié)構(gòu)復雜性和突變的高度異質(zhì)性相契合，近年來將其應用于WD基因診斷的研究倍受關(guān)注，相關(guān)的報道呈增多趨勢。如Poon等［22］采用了MiSeq平臺的NGS靶向技術(shù)檢測了12例WD患者ATP7B基因的部分啟動子區(qū)和全部編碼區(qū)序列，深度測序（＞100X）結(jié)果共檢出13種已知突變和一種未曾報道的c.1332delC缺失突變，其結(jié)果與Sanger測序的符合率為100%。筆者等［19］在前述研究中則應用NGS檢測了在MassARRAY平臺未檢出ATP7B基因突變的138例WD患者，結(jié)果共檢出25種突變類型，其中9種為未曾報道的突變類型。在此基礎(chǔ)上，筆者等與相關(guān)單位合作，采用AmpliSeq方案設計了包含303個擴增子的ATP7B基因全外顯子檢測Panel，在平均測序深度約1000X的情況下，其編碼區(qū)的覆蓋率約99.5%，利用Ion Torrent高通量NGS平臺完成了2 853例WD患者DNA樣本的檢測，已初步分析檢測到435種與WD相關(guān)的致病突變或疑似致病突變（未發(fā)表）。這些研究結(jié)果展示了NGS在WD基因診斷中所具有的廣闊應用前景。

3 WD的產(chǎn)前診斷和植入前診斷

產(chǎn)前診斷可以在出生前即可診斷胎兒是否為WD患者，決定是否繼續(xù)妊娠，從而防止WD患兒的出生，對降低WD的發(fā)病率、提高出生人口的素質(zhì)有決定性意義。

早于WD基因克隆前，Cossu等［23］于1992年即報道采用RFLP?家系連鎖分析方法對WD家系成員進行產(chǎn)前診斷的研究。在WD基因克隆后，有學者采用直接分析ATP7B基因突變的方法對WD家系成員實施產(chǎn)前診斷。如杜娟等［24］采用DHPLC技術(shù)對6個WD家系的父母親、先證者和胎兒行ATP7B基因突變的篩查，經(jīng)Sanger測序驗證在2個家系中發(fā)現(xiàn)存在ATP7B基因突變的異常胎兒，證實了DHPLC在WD突變檢測和產(chǎn)前診斷中應用價值。

由于常規(guī)的產(chǎn)前診斷方法均需在妊娠過程中從孕婦羊膜腔抽取羊水提取胎兒的基因組DNA，系有創(chuàng)性的侵入性檢查，有可能影響孕婦和胎兒的安全，因此有學者探索采用各種無創(chuàng)性檢測技術(shù)開展WD產(chǎn)前診斷的研究。如Lv等［25］采用外周血單分子擴增和重測序技術(shù)（circulating single?molecule amplification and resequencing technology，cSMART）這一無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)對4個WD家系進行了研究。該研究首先采用Sanger測序和全外顯子組測序技術(shù)檢測了WD家系父母親和先證者ATP7B基因的突變，然后采用cSMART從孕婦外周血分離胎兒基因組并檢測是否發(fā)生ATP7B基因的突變。經(jīng)羊膜腔抽取羊水后的產(chǎn)前診斷證實，有1個WD家系的胎兒與先證者基因型相同，為發(fā)生WD基因突變的患者，從而驗證了無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷應用于WD的可行性。

胚胎植入前遺傳學診斷（preimplatation genet?ic diagnosis，PGD）可利用分子生物學檢測技術(shù)選擇無遺傳性疾病的胚胎植入子宮，使有遺傳病史的夫婦獲得健康的嬰兒，避免生出有病的后代以及反復人工流產(chǎn)或者引產(chǎn)導致的身體、精神上的創(chuàng)傷和經(jīng)濟上的損失［26］。雖然到目前為止尚未見WD家系行PGD的報道，但隨著單細胞基因組測序［27］以及基于NGS靶向測序技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，WD家系行PGD已逐漸成為可能。

4 WD的基因治療

目前以青霉胺為代表的金屬絡合劑驅(qū)銅治療和硫酸鋅或葡萄糖酸鋅等鋅劑為主的競爭抑制銅吸收等治療方法均可在不同程度上糾正WD患者體內(nèi)銅的“正平衡”而具有改善病情的作用，但這些方法均為對癥治療，且有相當一部分患者不能耐受青霉胺等藥物的不良反應，使其治療范圍和效果嚴重受限。原位肝移植治療雖能挽救一部分以暴發(fā)性肝功能衰竭起病的腹型WD患者的生命，但受器官移植后免疫排斥反應、費用昂貴及肝源獲取困難等限制，難以作為常規(guī)治療方法［4，6，28］。作為單基因遺傳病，且其致病基因的定位、結(jié)構(gòu)和功能均較為明確，WD最理想的治療方法當屬基因治療。

基因治療是指以遺傳學原理及基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)，在分子水平進行修補、矯正、替代缺陷基因或調(diào)控其表達的治療方法。由于目前WD的基因治療均以動物模型為研究對象，選擇符合WD遺傳背景的動物模型是判定基因治療能否成功的重要環(huán)節(jié)。但目前應用于WD基因治療的LEC大鼠、TX小鼠及atp7b（?/?）小鼠的表型雖然與WD類似，但其遺傳背景、生化特征與WD患者存在較大差異［29］。基于此，Jiang 等［30］應用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)獲得了p.Arg778Leu基因型（中國人WD患者的高頻突變位點）的ATP7B基因點突變兔子，發(fā)現(xiàn)其肝銅含量逐漸增高（最高超過對照組9倍），從而得到了最接近于中國人WD遺傳背景的動物模型，為下一步WD基因治療的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

為了解決替代基因的靶向性和載體的安全性等問題，Murillo等［31］以改造的腺相關(guān)病毒8（adeno?associated vector serotype 8，AAV8）為載體，將人全長ATP7B基因通過靜脈注射的方法導入atp7b?/?小鼠的肝臟，發(fā)現(xiàn)其能在肝臟組織中長期表達，并能部分糾正銅代謝的異常。Roybal等［32］則將含有人野生型ATP7BcDNA和肝臟特異性啟動子的重組慢病毒（lentivirus）載體采用羊膜腔注射的方法進行atp7b?/?小鼠基因治療的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)出生后的模型小鼠肝組織出現(xiàn)較長時間的重組人ATP7B蛋白的表達，且銅代謝異常也有明顯改善。盡管這些研究尚處于實驗室探索階段，走向臨床應用尚有待時日，但這些研究結(jié)果顯現(xiàn)出基因治療應用于WD的誘人前景。

5 小結(jié)

綜上所述，目前各種應用于WD的基因診斷方法中，DNA Sanger測序的重要性不言而喻，NGS靶向測序等高通量測序技術(shù)的應用被認為是近年來WD分子診斷領(lǐng)域最重要的進展。而基于WD基因診斷技術(shù)之上的產(chǎn)前診斷特別是非侵入性的PGD可使有家族史或存在遺傳風險的WD家系成員避免生出有病患兒，在真正意義上阻斷WD的發(fā)生，對優(yōu)生優(yōu)育和提高出生人口的素質(zhì)有重要意義。但由于產(chǎn)前診斷和PGD涉及生殖醫(yī)學與遺傳學、分子生物學、組織胚胎學等領(lǐng)域，技術(shù)門檻高且涉及“胎兒設計”和非醫(yī)學的性別選擇等醫(yī)學倫理問題，因此，除了在診斷技術(shù)上實現(xiàn)高靈敏度和準確度外，嚴格的準入制度、成熟的技術(shù)流程以及醫(yī)學倫理學的支持是其在臨床中規(guī)范化推廣應用的前提保證。雖然基因治療作為WD的根治方法尚處于實驗室研究階段，但隨著CRISPR/Cas9等新一代基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)和逐漸成熟，在分子水平精確修正WD的突變基因在不久的將來有可能成為現(xiàn)實。