張林, 周劍光, 張濤, 何力

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部淡水魚類種質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，武漢 430072)

細(xì)鱗斜頜鲴 (Xenocyprismicrolepis)，俗稱沙姑子、黃尾刁、板黃魚、黃條、黃片等，隸屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鲴亞科(Xenocyprininae)、斜頜鲴屬(Plagiognathops)[1]。主要攝食腐殖質(zhì)、有機(jī)碎屑、藍(lán)藻、綠藻、硅藻等，享有“環(huán)保魚”的美譽(yù)[2]，飼養(yǎng)簡(jiǎn)便。在不增加飼料的情況下，能提高單位面積產(chǎn)量，且不與鰱、鳙等爭(zhēng)食，可以與其混養(yǎng)。由于其具有肉味鮮美、體型中等、生長(zhǎng)速度快、養(yǎng)殖病害少，可改善水質(zhì)等特點(diǎn)，近年來，許多地區(qū)開展了細(xì)鱗斜頜鲴的苗種繁育、人工養(yǎng)殖及增殖放流等工作[3-6]。目前有關(guān)細(xì)鱗斜頜鲴的報(bào)道主要集中在養(yǎng)殖技術(shù)與模式[3,7]、乳酸脫氫酶[8-9]、線粒體DNA基因[10-11]的研究。對(duì)其種質(zhì)資源研究報(bào)道不多見，對(duì)長(zhǎng)江水系細(xì)鱗斜頜鲴群體生物學(xué)性狀及生化遺傳特性分析的研究未見報(bào)道。因此，本研究采用傳統(tǒng)的可數(shù)性狀和可量性狀遺傳學(xué)方法，描述其生物學(xué)性狀，研究其細(xì)胞遺傳特性及生化遺傳特性，旨在為其種群鑒定、種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)制定、種質(zhì)資源保護(hù)及利用提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)鱗斜頜鲴(Xenocyprismicrlepis)取自湖北省丹江水庫，樣本數(shù)量為30尾，體長(zhǎng)為23.7～29.6 cm，體重為228.84～457.94 g。

1.2　形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)測(cè)量

采用量魚板、游標(biāo)卡尺、直尺、三角板等測(cè)量工具，精確到0.01 cm。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的獲得，參照殷名稱方法[12]，包括可數(shù)性狀和可量性狀兩類?？蓴?shù)性狀分別為側(cè)線鱗數(shù)、側(cè)線上鱗數(shù)、側(cè)線下鱗數(shù)、左側(cè)第一鰓弓外側(cè)鰓耙數(shù)、背鰭不分支鰭條數(shù)、背鰭分支鰭條數(shù)、臀鰭不分支鰭條數(shù)和臀鰭分支鰭條數(shù)，共計(jì)8項(xiàng)指標(biāo)?？闪啃誀畎ㄈL(zhǎng)、體長(zhǎng)、體高、頭長(zhǎng)、吻長(zhǎng)、眼徑、眼間距、尾柄長(zhǎng)和尾柄高，共計(jì)9項(xiàng)指標(biāo)。

1.3　染色體的制備

取雌雄魚各3尾，經(jīng)腹腔注射5 μg/g植物血球凝集素(PHA)，繼續(xù)飼養(yǎng)24 h后，腹腔注射2 μg/g秋水仙素，2.5 h后剪鰓放血，取出頭腎。在生理鹽水中將頭腎剪成1 mm3，靜置10 min，取上層細(xì)胞懸液1 000 g離心6 min，沉淀加入0.037 5 mol/L的KC1 5 mL，室溫低滲45 min。加少許卡諾氏固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1,V∶V)預(yù)固定2～3 min 后1 000 g離心6 min，沉淀加入預(yù)冷的卡諾氏固定液，吹打均勻后室溫下靜置30 min使其固定，然后置于離心機(jī)中以1 000 g離心6 min，離心后倒去上清液。如此重復(fù)3次后，空氣干燥法制作涂片，15%Giemsa染色。

1.4　染色體檢查與形態(tài)測(cè)量

中期分裂相用16倍目鏡和100倍油鏡在顯微鏡(Olympus CX41，日本)下觀察拍攝，選擇拍攝了100張清晰的染色體中期分裂相，進(jìn)行染色體個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)，確定染色體眾數(shù)。染色體大小形態(tài)用Photoshop Software 7.0測(cè)量(精度0.01 μm)。挑選具有代表性的5張有絲分裂中期相，給染色體按照著絲點(diǎn)分割點(diǎn)位置進(jìn)行排號(hào)(1～48)，測(cè)量每條染色體的長(zhǎng)臂長(zhǎng)、短臂長(zhǎng)和總長(zhǎng)，計(jì)算相對(duì)長(zhǎng)度、著絲粒指數(shù)和臂比等。每對(duì)同源染色體取短臂與長(zhǎng)臂均值。所有的測(cè)量數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，而后按照組型歸類。

1.5　染色體配對(duì)

著絲粒指數(shù)(CI)指每對(duì)染色體短臂均值長(zhǎng)與此對(duì)染色體總長(zhǎng)之比。相對(duì)長(zhǎng)度指每對(duì)染色體總長(zhǎng)和所有染色體總長(zhǎng)之比。根據(jù)同源染色體總長(zhǎng)及著絲粒位置的最大相似性進(jìn)行配對(duì)。臂比指長(zhǎng)臂長(zhǎng)與短臂長(zhǎng)之比。按臂比及著絲粒指數(shù)將染色體分為4組：中部著絲粒染色體M組，臂比為1.00～1.70，著絲粒指數(shù)(CI)為0.375～0.500；亞中部著絲粒染色體SM組，臂比為1.71～3.00，著絲粒指數(shù)(CI)為0.250～0.375；亞端部著絲粒染色體ST組，臂比為3.01～7.00，著絲粒指數(shù)(CI)為0.125～0.250；端部著絲粒染色體T組，臂比為7.01～∞，著絲粒指數(shù)(CI)為0.000～0.125[13]。在每組內(nèi)根據(jù)同源染色體長(zhǎng)度逐漸下降的順序排列。

1.6　同工酶電泳分析

選取20尾健康魚，首先剪斷鰓絲放血，在低溫條件下迅速解剖，取出腦、心、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉和眼睛7種組織，并在玻璃勻漿器中勻漿(冰上操作)，組織和提取緩沖液質(zhì)量體積比為1∶3，提取液為0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.1)，4 ℃下8 000 g離心20 min后取上清液，離心2次，置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

采用7%聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，以溴酚藍(lán)作指示劑，4 ℃條件下，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑至凝膠底部時(shí)停止電泳。電泳結(jié)束后將凝膠板取下，在乳酸脫氫酶染色液中避光染色至帶出現(xiàn)，顯色至出現(xiàn)清晰條帶后固定[14]。

1.7　數(shù)據(jù)分析

每個(gè)可數(shù)性狀用SPSS 11.0單因素方差分析(One-way ANOVA)，然后采用Duncan法作群體間差異顯著性分析,P<0.05為差異性顯著。

2　結(jié)果分析

2.1　主要生物學(xué)特征

鲴體側(cè)扁，背鰭起點(diǎn)處較高，體稍厚，腹部稍圓。鰓蓋后邊緣有明顯的橘黃色斑塊。腹部從腹鰭基至肛門間有明顯腹棱。頭小，吻鈍，口下位，橫裂，略呈弧形。下頜的角質(zhì)邊緣比較發(fā)達(dá)。背鰭有光滑硬刺，硬刺長(zhǎng)度較頭長(zhǎng)大。背部灰褐色，腹部銀白色，臀鰭淺黃色，尾鰭桔黃色，后緣黑灰色。鱗片細(xì)小，排列緊密(圖1)。有鰾管，2室。咽喉齒3行，齒式為2·4·6/6·4·2。

圖1　細(xì)鱗斜頜鲴外形圖Fig.1 The outside view of Xenocypris microlepis

側(cè)線鱗數(shù)為70～78，側(cè)線上鱗數(shù)為13～14，側(cè)線下鱗數(shù)為7～8，左側(cè)第一鰓弓外側(cè)鰓耙數(shù)為33～41，背鰭不分支鰭條數(shù)為3，背鰭分支鰭條數(shù)為7，臀鰭不分支鰭條數(shù)為3，臀鰭分支鰭條數(shù)為11～12。細(xì)鱗斜頜鲴背鰭鰭式：D.ⅲ-7；臀鰭鰭式：A.ⅲ-11～12。細(xì)鱗斜頜鲴可數(shù)性狀及可量性狀比值見表1。

2.2　細(xì)胞遺傳學(xué)性狀

在拍攝的100張染色體照片中，有90張為有絲分裂中期相屬于二倍體，染色體個(gè)數(shù)范圍為42～52，眾數(shù)為48的有72張(圖2)，占有絲分裂中期相的80%；其余10張為減數(shù)分裂期(細(xì)胞處于濃縮期)，染色體個(gè)數(shù)在23～24，而染色體個(gè)數(shù)為24的有7張(占減數(shù)分裂相的70%)；由此推斷長(zhǎng)江水系細(xì)鱗斜頜鲴屬于二倍體，染色體個(gè)數(shù)為48, 減數(shù)分裂期時(shí)屬于單倍體；此外，未發(fā)現(xiàn)與性別有關(guān)的異形染色體。

挑選眾數(shù)為48的5張具有代表性的有絲分裂相，測(cè)量時(shí)取其平均值，總長(zhǎng)度范圍為50.30～90.15 μm。有10對(duì)中部著絲粒染色體，其長(zhǎng)臂長(zhǎng)、短臂長(zhǎng)和總長(zhǎng)度范圍分別為33.05～43.4、26.45～36.65和60.80～80.05 μm；相對(duì)長(zhǎng)度、著絲粒指數(shù)、臂比范圍分別為3.74%～4.92%、0.413～0.466和1.145～1.420。有12對(duì)亞中部著絲粒染色體，其長(zhǎng)臂長(zhǎng)、短臂長(zhǎng)和總長(zhǎng)度范圍分別為34.50～64.20、15.65～28.4和50.30～90.15 μm；相對(duì)長(zhǎng)度、著絲粒指數(shù)和臂比范圍分別為3.09%～5.54%、0.288～0.357和1.803～2.474。有2對(duì)亞端部著絲粒染色體，其長(zhǎng)臂長(zhǎng)、短臂長(zhǎng)和總長(zhǎng)度范圍分別為12.05～15.70μm、40.9～54.45和52.95～70.15 μm；相對(duì)長(zhǎng)度、著絲粒指數(shù)和臂比范圍分別為3.26%～4.31%、0.224～0.228和3.394～3.468(表2)，但本觀察中未見端部著絲粒染色體。

表1　30尾細(xì)鱗斜頜鲴可量性狀比值及可數(shù)性狀Tab.1　Comparatives of measurable characters and countablecharacters of 30 Xenocypris microlepis　n=30

表2　細(xì)鱗斜頜鲴染色體有絲分裂中期相核型分析相關(guān)參數(shù)Tab.2　Numeral characteristics of the karyotype of Xenocypris microlepis showing the mean values of measurements from mitotic metaphases

注：M表示中部著絲點(diǎn)染色體，SM表示亞中部著絲點(diǎn)染色體，ST表示亞端部著絲點(diǎn)染色體。

每組中的同源染色體按總長(zhǎng)逐漸減小的順序排列，細(xì)鱗斜頜鲴染色體中期分裂相及核型圖(圖2、圖3)，核型公式為2N=20M+24SM+4ST，臂數(shù)NF=92。

圖2　細(xì)鱗斜頜鲴腎臟細(xì)胞染色體中期分裂相Fig.2 The kidney mitotic metaphase of Xenocypris microlepis (2N=48,Bar=5μm)

圖3　細(xì)鱗斜頜鲴腎臟細(xì)胞染色體核型圖Fig.3 Karyotype of Xenocypris microlepis(2N=48,Bar=5μm)

2.3　生化遺傳學(xué)性狀

為制定細(xì)鱗斜頜鲴種質(zhì)遺傳鑒定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，隨機(jī)選取分析了20尾健康細(xì)鱗斜頜鲴心、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、腦和眼睛7種組織中乳酸脫氫酶(LDH)、乙醇脫氫酶(ADH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、酯酶(EST)、谷氨酸脫氫酶(GDH)和山梨醇脫氫酶(SDH) 6種常見的同工酶的表達(dá)模式，并對(duì)各同工酶的酶譜進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)腎臟和肌肉中的乳酸脫氫酶(LDH)為均為單態(tài)，觀察到5個(gè)基因座，顯示5條清晰的同工酶譜帶?？勺鳛榧?xì)鱗斜頜鲴區(qū)別其他魚類特有的生化遺傳學(xué)特性，其他不同組織同工酶可供細(xì)鱗斜頜鲴群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，將不再此文中贅述。

2種組織乳酸脫氫酶酶型相似，活性均較強(qiáng)，且均為單態(tài)。由Ldh-A、Ldh-B兩個(gè)基因編碼的四聚體酶，分別為A4、A3B、A2B2、AB3和B4。選擇有代表性的5尾魚肌肉與腎臟組織中LDH做電泳。由圖4和圖5可見，在遷移率和某些酶帶的著色濃度上存在細(xì)微差別，顯示同種酶在同種魚類上的組織特異性。腎臟LDH1～LDH2表達(dá)豐度略高于肌肉組織。兩種組織中均是LDH3(A2B2)、LDH4(A3B)和LDH5(A4)占明顯優(yōu)勢(shì)。

圖4　細(xì)鱗斜頜鲴肌肉組織乳酸脫氫酶Fig.4 The lactate dehydrogenase(LDH) of Xenocypris microlepis muscle

圖5　細(xì)鱗斜頜鲴腎臟組織乳酸脫氫酶Fig.5 The lactate dehydrogenase(LDH) of Xenocypris microlepis kidney

3　討論

細(xì)鱗斜頜鲴主要分布于長(zhǎng)江水系，本研究以30尾長(zhǎng)江水系細(xì)鱗斜頜鲴為研究對(duì)象，采用傳統(tǒng)的魚類度量方法，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與喬德亮等[15]報(bào)道的梁子湖細(xì)鱗斜頜鲴生物學(xué)性狀基本吻合，8個(gè)可數(shù)性狀參數(shù)差異不顯著(P>0.05)；與淮河細(xì)鱗斜頜鲴生物學(xué)性狀不一致(表3)，側(cè)線鱗、側(cè)線下鱗和鰓耙數(shù)3個(gè)參數(shù)差異顯著(P<0.05)，說明存在著群體差異性，環(huán)境因素可能對(duì)其形態(tài)產(chǎn)生影響。楊干榮[16]報(bào)道，其體長(zhǎng)為體高的3.4～4.0倍，為頭長(zhǎng)的4.9～6.1倍，頭長(zhǎng)為吻長(zhǎng)的3.0～4.0倍，為眼間距的2.4～2.6倍，為眼徑的4.0～4.8倍，其可量性狀之比與本研究一致。本研究數(shù)據(jù)可為長(zhǎng)江水系細(xì)鱗斜頜鲴種質(zhì)資源保護(hù)及種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供基礎(chǔ)資料。

表3　細(xì)鱗斜頜鲴3個(gè)群體可數(shù)性狀均值及標(biāo)準(zhǔn)差Tab.3　Means andstandard eviations of countable characters of three populations of Xenocypris microlepis

注：*表示與本研究相比差異顯著(P<0.05)。

對(duì)魚類的種質(zhì)的評(píng)估，應(yīng)結(jié)合形態(tài)特征、細(xì)胞遺傳學(xué)特征和生化遺傳學(xué)等特征進(jìn)行研究。從細(xì)鱗斜頜鲴染色體照片和對(duì)其分析的結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)在同一分裂相中最大的一對(duì)染色體的兩條同源染色體屬于亞中部(圖2和圖3)。這與李康等[17]報(bào)道銀鲴等4種鲴科魚類最大一對(duì)亞中部染色體特征相似。表明鲴科魚類中這一對(duì)最大染色體的相對(duì)長(zhǎng)度和臂比可能不會(huì)因羅伯遜易位、倒位、缺失或重復(fù)等改變，反映了鲴科魚類核型的同源性。

鲴亞科魚類染色體與鯉科魚類染色體數(shù)目在進(jìn)化上的保守性也可能相同，二倍數(shù)基本都是48，其共同的核型公式可歸納為(18～20)M+26SM+(2～4)ST，染色體臂數(shù)變化也相當(dāng)保守：NF=(92～94)[18]。本研究中長(zhǎng)江水系細(xì)鱗斜頜鲴核型公式：2N=48=20M+24SM+4ST，臂數(shù)NF=92，與報(bào)道的鲴亞科魚類[17]在染色體分組上具有基本一致的特征。

LDH是一種催化乳酸和丙酮酸相互轉(zhuǎn)化伴同發(fā)生輔酶NAD的氧化與還原的酶，存在于有機(jī)體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，以腎臟含量最高。此外，魚類肌肉活動(dòng)較頻繁，糖的代謝旺盛，LDH酶質(zhì)量濃度較大，酶活性較高。LDH同工酶電泳圖譜的特征反映了基因的活動(dòng)與調(diào)控，即反映了遺傳表達(dá)的本質(zhì)。因此我們又針對(duì)性地研究了細(xì)鱗斜頜鲴腎臟和肌肉組織的乳酸脫氫酶的生化遺傳特性。

LDH為四聚體酶，魚類的LDH同工酶最少有3個(gè)基因編碼，其中A、B基因所編碼的酶出現(xiàn)在魚類的多種組織中，本研究在5尾細(xì)鱗斜頜鲴腎臟與肌肉組織中檢測(cè)到Ldh-A、Ldh-B基因編碼的經(jīng)典5種酶帶，且在每種組織中LDH均為單態(tài)性，可用于種質(zhì)鑒定。而在腎臟與肌肉組織中未見Ldh-C基因的表達(dá)，說明細(xì)鱗斜頜鲴LDH同工酶的遺傳多樣性處于中等地位。有研究認(rèn)為，第3個(gè)基因所編碼的酶在鯉形目中只存在于肝臟中[19-20]，細(xì)鱗斜頜鲴肝臟中也存在Ldh-C基因編碼的酶帶，將在另文中報(bào)道。

同一物種不同組織中LDH同工酶譜存在差異，即具有組織特異性，不同亞基組成的LDH同工酶作用不同，這一特征與該組織所處的生理?xiàng)l件和機(jī)能相關(guān)[19]。肌肉和腎臟中側(cè)重于無氧酵解，LDH4與LDH5活性較高，富含A亞基，催化丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗峒癗AD+[19]，而本研究結(jié)果恰好印證了這一理論。

由于LDH同工酶數(shù)量與動(dòng)物生活環(huán)境含氧量的狀況相關(guān)[21]。本研究中在細(xì)鱗斜頜鲴的肌肉和腎臟組織中能檢測(cè)到經(jīng)典的5條酶帶，數(shù)量處于中等，由此推斷，細(xì)鱗斜頜鲴適宜在含氧量適中、比較穩(wěn)定的水域環(huán)境中生長(zhǎng)，這可能與細(xì)鱗斜頜鲴在水體中下層活動(dòng)生活習(xí)性有關(guān)。

4　結(jié)論

通過對(duì)長(zhǎng)江水系的細(xì)鱗斜頜鲴的形態(tài)特征和遺傳學(xué)特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)江水系細(xì)鱗斜頜鲴形態(tài)特征與梁子湖細(xì)鱗斜頜鲴群體生物學(xué)性狀吻合，與淮河水系細(xì)鱗斜頜鲴生物學(xué)性狀不一致，存在著群體差異性。長(zhǎng)江水系細(xì)鱗斜頜鲴的體細(xì)胞染色體數(shù)為2N=48，核型公式為20M+24SM+4ST，臂數(shù)(NF)為92，未發(fā)現(xiàn)性染色體；其腎臟和肌肉組織乳酸脫氫酶各有5條同工酶譜帶，由Ldh-A、Ldh-B兩個(gè)基因編碼，且腎臟LDH1～LDH2表達(dá)豐度略高于肌肉組織。本研究可為細(xì)鱗斜頜鲴種質(zhì)評(píng)估及種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)制定提供理論參考。

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