許海燕，熊海平，蘇　婧，湯　敏

（南通市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科，江蘇226007）

彎曲菌（Campylobacter）是一類微需氧、不分解糖、氧化酶陽性、菌體彎曲呈弧形、S形或螺旋狀，有動(dòng)力的革蘭陰性菌。彎曲菌屬包括16個(gè)種和8個(gè)亞種，其中12個(gè)種可引起人類疾病。空腸彎曲菌是人類腹瀉最常見的病原菌之一，其次是結(jié)腸彎曲菌，其它彎曲菌偶爾致病[1]。彎曲菌是重要的人獸共患病原菌，人通過接觸動(dòng)物或食入被污染的牛奶、水等食物而感染。彎曲菌進(jìn)入腸道后侵入、定居和繁殖于宿主的腸黏膜上皮細(xì)胞而導(dǎo)致人類疾病[2]。彎曲菌引起的腸炎以散發(fā)的急性、自限性腸炎為主，對嬰幼兒、老人或AIDS病等免疫力低下者危害較大，嚴(yán)重者可致死。樓金吐等[3]曾報(bào)道，23 431例嬰幼兒腹瀉患兒的糞便標(biāo)本中共檢出2 424份空腸彎曲菌陽性標(biāo)本，陽性率高達(dá)10.3%。由此可見，嬰幼兒空腸彎曲菌感染率較高，本調(diào)查采集2013—2016年南通市兩家醫(yī)院門診5歲以下腹瀉患兒的糞便樣品1 257份應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合細(xì)菌分離鑒定，對該人群腹瀉患者的空腸彎曲菌感染及耐藥狀況進(jìn)行監(jiān)測分析，為制定本地區(qū)嬰幼兒空腸彎曲菌病防治措施提供數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1標(biāo)準(zhǔn)菌株：空腸彎曲菌CICC22936、大腸埃希菌ATCC29213（中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心）。

1.1.2檢測試劑：空腸彎曲菌熒光定量PCR檢測試劑盒（北京卓誠惠生生物科技有限公司），密封培養(yǎng)罐、微需氧產(chǎn)氣袋（MGC公司），彎曲菌培養(yǎng)基mCCDA瓊脂（含SR0155E）、布氏肉湯（含SR0208E）和藥敏紙片（OXOID公司），常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純試劑。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.1.3檢測設(shè)備：HS-200B恒溫?fù)u床（上海和呈儀器制造有限公司），ABI7500熒光PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.1.4樣品信息：共采集南通市A、B兩家醫(yī)院門診5歲以下腹瀉患兒的糞便樣品1 257份，其中A醫(yī)院366份，B醫(yī)院891份，A醫(yī)院為縣級(jí)醫(yī)院，B醫(yī)院為地市級(jí)醫(yī)院，兩家醫(yī)院的選擇采取隨機(jī)的方式。第一季度256份，第二季度326份，第三季度394份，第四季度281份。腹瀉病例定義：每日排便3次或3次以上，且糞便性狀異常（稀便、水樣便、粘液便或膿血便等）。在發(fā)病早期及使用抗生素之前采集腹瀉患兒肛拭子樣本，采集后將肛拭子直接放入1～2mL布氏肉湯中，室溫或冷藏運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，所有樣品均于24 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室并完成檢測。

1.2　檢測方法

1.2.1樣品處理：取2mL已混有標(biāo)本的布氏肉湯加入4mL含抗生素和生長促進(jìn)劑的布氏肉湯中充分混勻，置微需氧環(huán)境（5%O2、10%CO2和 85%N2）下，（42±1）℃振搖培養(yǎng) 24h。

1.2.2DNA制備：取上述增菌培養(yǎng)液1 mL，13 000g離心2 min棄上清，加入200μL DNA提取液，混合均勻，煮沸10 min，冷卻后16 000g離心2 min，取上清液作為空腸彎曲菌鑒定PCR模板。

1.2.3熒光定量PCR：嚴(yán)格按照空腸彎曲菌核酸測定試劑盒說明書操作。

1.2.4細(xì)菌分離鑒定：在進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的同時(shí)參照GB4789.9-2014分離鑒定空腸彎曲菌[4]。取PCR陽性增菌液分別劃線接種于mCCDA平板，微需氧條件下（42±1）℃培養(yǎng)48h。觀察菌落形態(tài)，挑取扁平、濕潤、有光澤和邊緣整齊的菌落，再次接種于mCCDA平板，直至得到純的培養(yǎng)物后進(jìn)行鑒定。

1.2.5藥敏試驗(yàn)：采用2012年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）推薦使用的瓊脂擴(kuò)散法。將相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊募兙鷳乙河脺缇奘米泳鶆蛲坎荚? mm厚的MH平板上，放置5min，用滅菌鑷子將抗生素紙片貼附在瓊脂表面，42℃孵育24h后觀察有無抑菌環(huán)及其大小，抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細(xì)菌明顯生長為限。分別測量各紙片抑菌環(huán)直徑（mm），敏感、中敏或耐藥按CLSI/NCCLS或ROSCO標(biāo)準(zhǔn)判定。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1空腸彎曲菌熒光定量PCR檢測結(jié)果1 257份腹瀉病例糞便樣品中42份空腸彎曲菌陽性，陽性率為3.34%。（1）不同醫(yī)院檢測結(jié)果：A醫(yī)院366份糞便樣品中11份空腸彎曲菌陽性，陽性率3.01%；B醫(yī)院891份糞便樣品31份空腸彎曲菌陽性，陽性率3.48%。A、B兩醫(yī)院陽性率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（2）不同季度檢測結(jié)果：第一、二、三和四季度空腸彎曲菌陽性率分別為1.56%、2.15%、5.58%和3.20%，第三季度空腸彎曲菌陽性率高于第一和第二季度陽性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他季度之間陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1　空腸彎曲菌熒光定量PCR檢測結(jié)果

2.2空腸彎曲菌細(xì)菌分離鑒定結(jié)果對1 257份樣品進(jìn)行空腸彎曲菌分離鑒定，共分離鑒定出32株空腸彎曲菌，檢出率為2.55%，低于熒光定量PCR的3.34%陽性率，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果對32株空腸彎曲菌對臨床常用的8大類19種抗生素進(jìn)行敏感試驗(yàn)，僅有3種抗生素的敏感率超過80%，分別為慶大霉素81.25%、紅霉素84.38%和阿齊紅霉素90.63%。而耐藥率在80%以上的有9種，分別為阿莫西林96.88%、頭孢拉定100.00%、頭孢哌酮100.00%、頭孢克羅96.88%、諾氟沙星84.38%、環(huán)丙沙星87.50%、左旋氧氟沙星84.38%、萘啶酸84.38%、復(fù)方新諾明100.00%。見表2。

表2　空腸彎曲菌分離株32株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2　空腸彎曲菌分離株32株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3空腸彎曲菌耐藥菌株的耐藥狀況32株空腸彎曲菌均為多重耐藥菌，對19種抗生素的耐藥主要集中同時(shí)耐8種（簡稱8耐或8R）、11耐和12耐，占56.25%，其中11耐的菌株最多，占31.25%。

3　討　論

彎曲菌廣泛分布于自然界，可通過食物、水等傳播。彎曲菌感染引起的腹瀉病例數(shù)甚至超過沙門氏菌、志賀氏菌以及大腸桿菌O157:H7，成為常見的腹瀉致病菌之一。發(fā)達(dá)國家的監(jiān)測顯示彎曲菌的易感人群為嬰幼兒和成年初期[5]。2013年Tsoni等[6]報(bào)道出生15天的嬰兒因感染空腸彎曲菌而引起腦膜炎的罕見病例。世界衛(wèi)生組織已將彎曲菌病列為最常見的食源性傳染病之一。本次監(jiān)測的結(jié)果顯示，南通市嬰幼兒腹瀉糞便中空腸彎曲菌的總體陽性率為3.34%，表明該人群存在空腸彎曲菌病的流行風(fēng)險(xiǎn)。

本調(diào)查共采集了1 257份5歲以下腹瀉患兒的糞便標(biāo)本，其中42份空腸彎曲菌陽性，陽性率為3.34%，而樓金吐等[3]在23 431例嬰幼兒腹瀉糞便標(biāo)本中檢測出2 424份空腸彎曲菌陽性標(biāo)本，陽性率高達(dá)10.3%，與本結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），可能由于衛(wèi)生狀況、飲食結(jié)構(gòu)以及飲食習(xí)慣不同所致。本次調(diào)查中336份標(biāo)本來自縣區(qū)A醫(yī)院，891份標(biāo)本來自市區(qū)B醫(yī)院，空腸彎曲菌陽性率分別為3.01%、3.48%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示南通地區(qū)空腸彎曲菌感染的情況較為一致；但在不同季度均有空腸彎曲菌腹瀉患兒，提示應(yīng)加強(qiáng)空腸彎曲菌流行病學(xué)監(jiān)測和相應(yīng)的防治工作。

本研究結(jié)果顯示，熒光定量PCR的陽性率3.34%，與細(xì)菌分離鑒定檢出率2.55%的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但熒光定量PCR具有特異性強(qiáng)、操作簡便、實(shí)驗(yàn)周期短的優(yōu)勢，因此可用于大規(guī)模實(shí)驗(yàn)流行病學(xué)調(diào)查。

空腸彎曲菌的耐藥譜呈現(xiàn)出多樣化和復(fù)雜化的趨勢，多重耐藥菌株的不斷出現(xiàn)已成為現(xiàn)代社會(huì)所面臨的公共健康問題之一[5]。本次調(diào)查選用臨床上常用的8大類19種抗生素，對32株分離的空腸彎曲菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示空腸彎曲菌對9種抗生素的耐藥率在84.38%～100%，所分離菌株均為多重耐藥菌，從4耐到11耐不等，其中11耐的菌株最多，占31.25%，該結(jié)果與Pan等[7]分離自5歲以下嬰幼兒腹瀉患者的110株彎曲菌的部分耐藥結(jié)果一致。如此嚴(yán)重的耐藥性可能與臨床及畜禽養(yǎng)殖業(yè)大量濫用抗生素有關(guān)，加強(qiáng)對抗生素使用的監(jiān)管刻不容緩。

總之，南通地區(qū)5歲以下人群存在空腸彎曲菌病的流行風(fēng)險(xiǎn)，耐藥狀況嚴(yán)重，應(yīng)采取包括抗生素監(jiān)管等綜合措施加以防控。

[參考文獻(xiàn)]

[1]許海燕，熊海平，蘇婧，等.腹瀉患者空腸彎曲菌三種檢測方法比較［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，23（13）：2758-2759，2763.

[2]Kashoma IP，Kassem II，John J，et al.Prevalence and antimicrobial resistance of campylobacter isolated from dressed beef carcasses and raw milk in Tanzania［J］.Microb Drug Resist，2016，22（1）：40-52.

[3]樓金吐，張世新.嬰幼兒腹瀉病原體檢測結(jié)果分析［J］.浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，20（4）：10-11.

[4]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).GB 4789.9—2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)空腸彎曲菌檢驗(yàn)［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

[5]Allos BM.Campylobacter jejuni Infections：update on emerging issues and trends［J］.Clin Infect Dis，2001，32（8）：1201-1206.

[6]Tsoni K，Papadopoulou E，Michailidou E，et al.Campylobacter jejuni meningitis in a neonate:A rare case report［J］.J Neonatal Perinatal Med，2013，6（2）：183-185.

[7]Pan H，Ge Y，Xu H，et al.Molecular characterization，antimicrobial resistance and caco-2 cell invasion potential of campylobacter jejuni/Coli from young children with diarrhea［J］.Pediatr Infect Dis J，2016，35（3）：330-334.