張維嘉　林小娟　劉愛(ài)國(guó)　付士紅　劉桂芳　邵楠　王倩瑩　陶澤新　何英　雷雯雯

梁國(guó)棟　徐愛(ài)強(qiáng)　趙麗　王環(huán)宇

乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)是一種可引起人類嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾病傳染病的蟲(chóng)媒病毒。 JEV引起的乙型腦炎(Japanese encephalitis, JE)，主要流行在亞洲、西太平洋地區(qū)及澳洲北部地區(qū)，每年報(bào)告約50 000腦炎病例，病死率高達(dá)20%～30%，中國(guó)報(bào)告病例數(shù)幾乎占世界范圍病例總數(shù)的一半[1]。乙腦是我國(guó)法定乙類傳染病之一，是我國(guó)重要的病毒性腦炎疾病，隨著乙腦疫苗納入計(jì)劃免疫，發(fā)患者數(shù)顯著下降。

山東省歷史上是乙腦流行大省，自1986年將乙腦疫苗納入兒童計(jì)劃免疫后，發(fā)病數(shù)逐年下降，但部分地區(qū)仍然發(fā)生乙腦的暴發(fā)疫情[2]，2013年山東省出現(xiàn)乙腦大規(guī)模暴發(fā)流行，并曾從蚊蟲(chóng)標(biāo)本中分離得到多株JEV[3-4]。為掌握目前當(dāng)?shù)匚孟x(chóng)中攜帶乙腦情況及目前乙腦毒株變化情況，于2016年在山東省三個(gè)地區(qū)采集蚊蟲(chóng)標(biāo)本并分離病毒，對(duì)病毒分子特征進(jìn)行深入分析，結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1蚊蟲(chóng)標(biāo)本的采集2016年8—9月在山東省微山縣、莒南縣、墾利縣的豬圈中使用紫外誘蚊燈(“功夫小帥”牌，武漢市吉星環(huán)?？萍加邢挢?zé)任公司產(chǎn)品)和電動(dòng)吸蚊器采集蚊蟲(chóng)標(biāo)本。使用紫外誘蚊燈采集時(shí)間為晚上19:00至次日7:00，電動(dòng)吸蚊器采集時(shí)間為日落前至晚上20:00。蚊蟲(chóng)標(biāo)本在-20 ℃冰箱內(nèi)冷凍1 h，在冰排上剔除雄蚊，蚊蚡類后按照蚊子形態(tài)學(xué)特點(diǎn)對(duì)雌蚊分類，按照采集地區(qū)與蚊蟲(chóng)種類裝入凍存管，50～120只/批，凍存保存于液氮罐中。

1.2蚊蟲(chóng)處理與病毒分離從液氮罐中取出裝有蚊蟲(chóng)的凍存管，迅速將蚊蟲(chóng)倒入加有5 mm滾珠的2 ml Eppendorf 管中，每管加入1.5 ml 研磨液(含5%青霉素、鏈霉素、1% 谷氨酰胺的MEM培養(yǎng)液)，在組織震蕩儀上以25次/s頻率震蕩3 min 后以4 ℃，15 000×g離心30 min。取80 μl 研磨上清液感染生長(zhǎng)至70%～80%的單層BHK-21和C6/36細(xì)胞，吸附1 h后，棄掉上清，加入1 ml細(xì)胞維持液，分別置于37 ℃和28 ℃培養(yǎng)箱，逐日觀察細(xì)胞病變情況。盲傳3代，無(wú)病變者舍棄。對(duì)出現(xiàn)病變的樣品繼續(xù)傳代，直至出現(xiàn)規(guī)律病變后凍存。

1.3分子生物學(xué)檢測(cè)取140 μl蚊蟲(chóng)研磨上清液，用QIAamp? Viral RNA提取試劑盒(Qiagen公司)提取RNA，利用隨機(jī)引物p(dN)6 和Ready-to-GoTM You prime First-Strand Beads 試劑盒(GE Healthcare 公司)制備cDNA文庫(kù)。使用本科室自行設(shè)計(jì)的JEV 型特異性引物及探針進(jìn)行熒光RT-PCR檢測(cè)。同時(shí)對(duì)細(xì)胞感染出現(xiàn)的陽(yáng)性分離株提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，參照文獻(xiàn)[5]中使用的JEV特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)得到的陽(yáng)性PCR樣品進(jìn)行回收，送梓熙生物公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.4系統(tǒng)進(jìn)化分析使用Clustal X2.09軟件完成序列比對(duì)，Bioedit進(jìn)行序列編輯，MegAlign軟件完成病毒核苷酸和氨基酸同源性分析，使用Mega 5.0 軟件繪制JEV系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)(Neighbor-Joining方法)，Bootstrap值設(shè)定為1 000。繪制系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)所選用的其他病毒株包含JEV的五種基因型別，外群基因MVE-1-51為墨累山谷腦炎病毒(Murray Valley encephalitis virus, MVEV)(表1)。

2　結(jié)果

2.1蚊蟲(chóng)標(biāo)本采集2016年8月30日至9月7日，在山東省微山縣、莒南縣、墾利縣共采集蚊蟲(chóng)標(biāo)本8 418只，其中三帶喙庫(kù)蚊(Culextritaeniorhy-nchus)共3 535只占41.99%，中華按蚊(Anophelessinensis)共1 883只占22.37%，騷擾阿蚊(Armigeresobturbans)共3 000只占35.64%。

2.2病毒分離蚊蟲(chóng)標(biāo)本共分為81批進(jìn)行研磨處理，研磨上清液接種細(xì)胞，獲得8株能夠引起B(yǎng)HK-21細(xì)胞規(guī)律病變的陽(yáng)性分離物，編號(hào)為SDJN1633、SDJN1635、SDJN1646、SDWS1607、 SDWS1614、SDWS1615、SDWS1617、SDWS1619。

2.3分子生物學(xué)檢測(cè)使用基于JEV E基因特異性引物對(duì)8株陽(yáng)性分離物的cDNA進(jìn)行序列擴(kuò)增。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，顯示該8株分離物在約1 500 bp有目的核酸片段，測(cè)序后比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該8株陽(yáng)性分離物均為基因Ⅰ型JEV。81批蚊蟲(chóng)標(biāo)本中，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法共檢測(cè)出23批陽(yáng)性，陽(yáng)性率為28.4%。所有陽(yáng)性標(biāo)本均是從三帶喙庫(kù)蚊中獲得(表2)。

表1　本研究中采用乙腦病毒序列背景信息

注：a：為本次新分離乙型腦炎病毒株b☆：MVE-1-51為進(jìn)化分析時(shí)所用外群

Notes：a：JEV strains isolated in this studyb：MVE-1-51 was used as an outgroup in all phylogenetic analyses

表2　2016年山東省蚊蟲(chóng)標(biāo)本中乙型腦炎病毒分離及檢測(cè)

注：a每批指蚊蟲(chóng)研磨時(shí)，50-120只/研磨管，一管為一批；“—”：代表沒(méi)有采集到該蚊種

Note:aMosquitoes were homogenized in 50-120 individuals per pool; “—”: No collection of this mosquito species

2.4新分離JEV系統(tǒng)進(jìn)化分析對(duì)得到的8株新分離JEV進(jìn)行E基因序列測(cè)序，與GenBank中收錄的不同型別、不同國(guó)家的JEV序列E基因核苷酸序列做系統(tǒng)進(jìn)化分析。構(gòu)建基于Neighbor-Joining方法的核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。新分離的8株病毒與山東省分離得到的JEV均屬于基因Ⅰ型乙腦病毒(KL78/SD/CHN/13、VN11/SD/CHN/13、SD0810、RC34/SD/CHN/13)且同屬一個(gè)支進(jìn)化分支(圖1)[3-4]。新分離8株乙腦病毒與山東省以往分離的乙腦病毒之間的核苷酸和氨基酸同源性分別為98.3%～99.4%和99.6%～100%。

注：黑色三角形代表本研究分離的8株JEV圖1　山東省乙腦病毒E基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Note: Black triangles represents the 8 strains of JEV isolated in this studyFig.1　Phylogenetic analysis of JEV isolated from Shandong

3　討論

JEV又稱日本腦炎病毒，因其在日本暴發(fā)并首次分離到該病毒而命名?；颊吒腥綣EV后，大部分表現(xiàn)為非特異性癥狀如發(fā)熱、頭痛、咳嗽等，但是一旦病毒侵入神經(jīng)系統(tǒng)，會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷甚至死亡，在兒童中神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥出現(xiàn)的概率為30%[6]。山東省1986年將乙腦疫苗納入兒童計(jì)劃免疫后，乙腦的流行強(qiáng)度逐年下降[7]。但是近年來(lái)流行特征發(fā)生改變，出現(xiàn)以成人病例為主的乙腦暴發(fā)流行[8]。

乙腦傳播途徑主要以蚊—豬(鳥(niǎo))—蚊為主，人是終末宿主，環(huán)境中的蚊媒密度與乙腦的感染概率關(guān)系密切，庫(kù)蚊屬蚊蟲(chóng)是山東省的優(yōu)勢(shì)蚊種，其中又以三帶喙庫(kù)蚊為主[9]。本次調(diào)查結(jié)果也反映出三帶喙庫(kù)蚊在數(shù)量上的優(yōu)勢(shì)。并且分離的和核酸檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本均來(lái)自三帶喙庫(kù)蚊，進(jìn)一步證實(shí)三帶喙庫(kù)蚊是攜帶和傳播乙型腦炎病毒最主要的媒介。

JEV主要以乙腦病毒E基因區(qū)段作為靶點(diǎn)基因[10]。本研究通過(guò)對(duì)JEV E基因序列進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)新分離JEV均為基因Ⅰ型，與之前山東省蚊蟲(chóng)中分離的JEV一致[3,11]，說(shuō)明基因Ⅰ型乙腦病毒是目前山東省流行的主要型別，與我國(guó)及亞洲目前流行基因型別一致[12]。此外，進(jìn)化分析顯示山東省新分離JEV均聚集在一起，且與之前在山東省分離到的JEV親緣關(guān)系最近，說(shuō)明山東省內(nèi)JEV的遺傳進(jìn)化較為保守，在當(dāng)?shù)匦纬煞€(wěn)定的自然循環(huán)圈。

利益沖突:無(wú)

[1]Campbell GL，Hills SL，F(xiàn)ischer M，et al. Estimated global incidence of Japanese encephalitis[J]. Bull World Health Organ，2011，89(10): 766-774.DOI:10.2471/BLT.10.085233.

[2]林小娟，劉桂芳，張麗，等. 山東省1986～2010年流行性乙型腦炎流行病學(xué)特征分析[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2013,40(13): 2389-2391.DOI:10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2009.04.002.

[3]高曉艷，王海巖，王環(huán)宇，等. 山東省新分離乙腦病毒(SD08-10株)全基因組序列特征[J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2009，23(4): 242-244.DOI:10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2009.04.002.

[4]Tao ZX，Liu GF，Wang M，et al. Molecular Epidemiology of Japanese Encephalitis Virus in Mosquitoes during an Outbreak in China，2013[J]. Sci Rep，2015，4. DOI: 10.1038/srep04908.

[5]Wang HY，Takasaki T，F(xiàn)u SH，et al. Molecular epidemiological analysis of Japanese encephalitis virus in China[J]. J Gen Virol，2007，88(3): 885-894.DOI: 10.1099/vir.0.82185-0.

[6]Solomon T，Vaughn DW. Pathogenesis and clinical features of Japanese encephalitis and West Nile virus infections[J]. Curr Top Microbiol Immunol，2002，267: 171-194.DOI:10.1007/978-3-642-59403-8.

[7]徐愛(ài)強(qiáng)，劉桂芳，宋立志，等. 現(xiàn)階段山東省乙腦流行因素的探討[J]. 預(yù)防醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)信息，1996，2(2): 129-130.DOI:10.16406/j.pmt.issn.1672-9153.1996.02.034.

[8]尹遵棟，湯伯明，唐曉燕，等. 以大年齡病例為主的流行性乙型腦炎發(fā)病危險(xiǎn)因素的病例對(duì)照研究[J]. 中國(guó)疫苗和免疫，2013，19(3): 235-239.

[9]楊培培，李文娟，程鵬，等. 山東省南水北調(diào)沿線蚊類密度及流行性乙型腦炎病毒自然感染狀況研究[J]. 中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志，2016，27(3): 232-234,240.

[10]Zheng YY，Li MH，Wang HY，et al. Japanese encephalitis and Japanese encephalitis virus in mainland China[J]. Rev Med Virol，2012，22(5): 301-322.DOI: 10.1002/rmv.1710.DOI:1-.1002/rmv.1710.

[11]王海巖，高曉燕，宋立志，等. 山東省首次分離出基因1型流行性乙型腦炎病毒[J]. 中國(guó)疫苗和免疫，2009，15(4): 337-340.

[12]Gao XY，Li XL，Li MH，et al. Vaccine strategies for the control and prevention of Japanese encephalitis in Mainland China, 1951-2011[J]. PLoS Negl Trop Dis，2014，8(8): e3015. DOI: 10.1371/journal.pntd.0003015.DOI:10.1371/journal.pntd.000315.