許軍　石鑫　舒暢　冷焱　曹博　孫巍

150030 哈爾濱，黑龍江省疾病預防控制中心(許軍、石鑫、舒暢、曹博、孫巍)；158100 雞西市疾病預防控制中心(冷焱)

諾如病毒(Norovirus, NoV)屬于杯狀病毒科，是引起暴發(fā)和散發(fā)性急性胃腸炎的主要致病原。諾如病毒傳播力強，可通過水、食物、氣溶膠和接觸等多種途徑傳播，主要發(fā)生在醫(yī)院、學校、幼托機構、養(yǎng)老院等相對密閉的場所，主要表現為嘔吐、腹瀉等[1]。2016年黑龍江省共報告4起急性胃腸炎暴發(fā)疫情，發(fā)病211例，無死亡病例。本研究對相關樣本進行病毒核酸檢測和序列分析，以了解這4起暴發(fā)疫情的病原分子特征，為今后此類疾病監(jiān)測和疫情處置提供參考數據。

1　材料與方法

1.1標本采集由疫情發(fā)生地的疾病預防控制中心進行現場流行病學調查，采集現癥患者的肛拭子或糞便標本，低溫送至黑龍江省疾病預防控制中心，-70 ℃保存待檢。

1.2病毒核酸提取用無菌生理鹽水將糞便標本制成10%懸液，振蕩每個標本1 min，置離心機2 370×g離心5 min。取上清液200 μl，采用德國Qiagen公司的RNeasy Mini Kit試劑盒進行病毒核酸提取，提取方法按照說明書進行。

表1　2016年黑龍江省4起胃腸炎暴發(fā)疫情概況

1.3熒光定量RT-PCR、RT-PCR及序列測定使用江蘇碩世NoV GI/GII熒光定量PCR檢測試劑盒檢測NoV GI、GII。選取NoV陽性標本，采用引物P290/P289擴增病毒的聚合酶區(qū)(RdRp)片段[2]；采用引物G1SKF/G1SKR、COG2F/G2SKR分別擴增GI、GII部分衣殼蛋白(VP1)片段[3]；采用引物MON432/G1SKR、MON431/G2SKR分別擴增包括GI、GII的ORF1/2重疊區(qū)基因序列[4]，進行重組分析。擴增PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，送至賽默飛世爾科技公司進行雙向序列測定。

1.4序列拼接和進化分析序列拼接使用DNAStar軟件中的Seqman程序。從GenBank下載NoV GI、GII各基因型參考株序列，使用Mega6.0軟件的Clustal W進行序列比對，采用鄰接法構建進化樹，bootstrap重復檢驗1 000次。重組分析采用SimPlot3.5.1軟件進行。

2　結果

2.1疫情概況和特征2016年黑龍江省共報告4起胃腸炎暴發(fā)疫情(表1)，其中2016年10月1起，11月2起，12月1起。疫情發(fā)生在學校、幼托機構，其中學校2起，幼托機構2起。共發(fā)病211例，無死亡病例。其中男性患者97例，女性患者114例，男女性別比為1∶1.2。病例最小年齡為3歲，最大為48歲。不同年齡段中，≤5歲共28例，占13.27%；6～18歲年齡組共127例，占60.19%；≥19歲共56例，占26.54%。病例病程短、病情輕，主要臨床表現為嘔吐(90.5%)、腹痛(71.1%)、發(fā)熱(57.8%)和腹瀉(53.6%)(表2)。

2.2序列測定及系統(tǒng)進化分析隨機選取每起疫情的陽性標本3～4份擴增NoV部分RdRp和VP1片段，進行序列測定分析，構建進化樹，如圖1、2和表3。

表2　2016年黑龍江省4起胃腸炎暴發(fā)疫情病例臨床特征

表3　2016年黑龍江省4起胃腸炎暴發(fā)疫情諾如病毒分型結果

注：“-”表示未測出序列

Note: “-”indicates undetected sequence

“●”表示2016年黑龍江省4起暴發(fā)疫情陽性標本圖1　NoV RdRp區(qū)核苷酸序列進化分析“●”indicates stains of 4 outbreaks of gastroenteritis in Heilongjiang, 2016Fig.1　Phylogenetic tree based on partial RdRp gene sequences

2.3重組分析RdRp區(qū)和VP1區(qū)分型結果不一致的陽性株為疑似重組型。通過序列分析發(fā)現本研究存在疑似重組型：GII.P12/GII.3型、GI.Pd/GI.3型，重組位點需要進一步通過重組分析軟件確定。對疑似重組型用引物MON432/G1SKR、MON431/G2SKR分別擴增包括NoV GI、GII的ORF1/2重疊區(qū)基因序列，用SimPlot3.5.1軟件對序列進行重組鑒定(圖3)。選取樣本Heilongjiang-HL7、Heilongjiang-QTH1分別作為GII.P12/GII.3、GI.Pd/GI.3重組型的代表株進行重組分析。結果顯示Heilongjiang-HL7在RdRp區(qū)與GII.12/Sakai/04-179(AB220922)參考株具有高度同源性，在VP1區(qū)與GII.12/Sakai/04-179同源性降低，與GII.3/Toronto(U02030)參考株的同源性迅速增高。Heilongjiang-QTH1在RdRp區(qū)與參考株GI.Pd/Vesoul576(EF529738)具有高度同源性，在VP1區(qū)與GI.Pd/Vesoul576同源性降低，與參考株GI.3/VA98115(AY038598)同源性迅速增高。

● 表示2016年黑龍江省4起暴發(fā)疫情陽性標本圖2　NoV VP1區(qū)核苷酸序列進化分析“●”indicates stains of 4 outbreaks of gastroenteritis in Heilongjiang, 2016Fig.2　Phylogenetic tree based on partial VP1 gene sequence

圖3　重組株RdRp和VP1區(qū)基因序列Simplot分析Fig.3　Simplot analysis of partial polymerase and capsid gene sequence of the strains

3　討論

本研究在2016年黑龍江省4起急性胃腸炎暴發(fā)疫情樣本中均檢出NoV ，NoV 陽性率為34.3%(35/102)，這4起暴發(fā)疫情均發(fā)生在冬季。提示NoV 已成為我省急性胃腸炎暴發(fā)的重要病原。托幼機構和學校是NoV 胃腸炎暴發(fā)的重要場所，主要癥狀表現為嘔吐。

NoV 為單股正鏈RNA病毒，分為3個開放閱讀框(ORFs)。ORF1編碼非結構蛋白，包括RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)，ORF2編碼主要結構蛋白(VP1)，ORF3編碼次要結構蛋白(VP2)。根據基因特征，NoV 被分為6個基因群(Genogroup，GI-GVI)，感染人類的主要為GI、GII和GIV，GI和GII可進一步分為9個和22個基因型[5]。NoV 易發(fā)生變異，主要通過突變和重組兩個機制發(fā)生變異，這使NoV 的基因和抗原性具有豐富的多樣性。通常報道的重組主要是NoV RdRp區(qū)和VP1區(qū)屬于不同的基因型，重組位點一般位于ORFl/ORF2重疊區(qū)[6]。本研究選擇了較為保守的部分RdRp區(qū)和VP1區(qū)進行測序分析。結果顯示哈爾濱市南崗區(qū)高校疫情由GII.17型、GI.6型引起；呼蘭區(qū)幼托機構疫情由GII.2型、GII.P12/GII.3型引起；七臺河市中學疫情由GII.Pe、GI.Pd/GI.3型引起；阿城區(qū)幼托機構疫情由GII.2引起。

有研究顯示，在引起胃腸炎暴發(fā)的NoV 中，GII一直處于優(yōu)勢地位，其中GII.4型一直是引起人類急性胃腸炎暴發(fā)的主要基因型，其次為GII.3型。GII.3型常以基因型間重組的形式出現，如GII.Pa/GII.3、GII.Pb/GII.3、GII.P12/GII.3[7]。但在2014年底出現了一種新的GII.17變異株，并在中國(廣州[8]、北京[9])和日本[10]引起暴發(fā)流行。監(jiān)測數據顯示2015年我國NoV 相關急性胃腸炎主要是由GII.17新變異株引起。本研究根據部分RdRp區(qū)和VP1區(qū)基因序列構建的遺傳進化樹顯示，在哈爾濱市南崗區(qū)高校疫情檢測到的GII.17型與2014—2015年日本、2014年中國(廣州、香港)分離株親緣關系接近，可能為同一遺傳進化來源。新GII.17型在主要結構蛋白VP1的P2區(qū)上發(fā)生了一系列的氨基酸突變，這些位點包括病毒與宿主細胞上受體的結合位點及病毒抗原性決定域等。這些氨基酸突變很可能是導致病毒突然暴發(fā)流行的主要原因[11]。

在黑龍江省2016年11、12月的2起疫情中均檢測到GII.2型NoV ，并且在其中1起疫情中還檢測到GII.P12/GII.3重組型。這2起疫情的GII.2型NoV 核苷酸序列高度同源，提示NoV 在黑龍江省流行過程中不同基因型持續(xù)的共同進化和循環(huán)。我省對2012—2015年病毒性腹瀉監(jiān)測結果顯示：480例腹瀉樣本中GII.P12/GII.3重組型檢出3例、GII.4_Sydney2012型檢出3例[12]。2016年我國NoV 暴發(fā)以GII.2型為主，GII.2型是我省首次在急性胃腸炎暴發(fā)病例中檢出該基因型病毒。我國2014—2015年在安徽省[13]、廣東省[14]均發(fā)生GII.2型NoV 引起的急性胃腸炎暴發(fā)疫情。此外還在1起疫情中檢測到GI.Pd/GI.3重組型。我國由GI.Pd/GI.3重組型NoV 引起的急性胃腸炎暴發(fā)疫情在以往的文獻中報道較少，也是黑龍江省首次檢測到的GI重組型。依據目前文獻澳大利亞維多利亞州2002—2010年69起胃腸炎暴發(fā)疫情由GI引起，其中有5起是由GI.Pd/GI.3重組型NoV 引起[15]。重組可使病毒的抗原決定基因發(fā)生改變，病毒逃避宿主的免疫應答，引起暴發(fā)或流行。黑龍江省至今還未見關于GII.2型、GI.6型、GI.Pd/GI.3重組型NoV 暴發(fā)疫情和散發(fā)病例的報道，這提示NoV 在黑龍江省存在多個基因型的流行，因此需要加強監(jiān)測，弄清來源，關注其發(fā)展，為疫情處置和科學防控提供參考數據。

利益沖突無

[1]廖巧紅, 冉陸, 靳淼, 等. 諾如病毒感染暴發(fā)調查和預防控制技術指南(2015版)[J]. 中華預防醫(yī)學雜志, 2016, 50(1): 7-16. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2016.01.003.

[2]Jiang X, Huang PW, Zhong WM, et al. Design and evaluation of a primer pair that detects both Norwalk-and Sapporo-like caliciviruses by RT-PCR[J]. J Virol Methods, 1999, 83(1-2): 145-154. DOI:10.1016/S0166-0934(99)00114-7.

[3]Kojima S, Kageyama T, Fukushi S, et al. Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses[J]. J Virol Methods, 2002, 100(1-2):107-114. DOI: 10.1016/s0166-0934 (01)00404-9.

[4]Cannon JL, Barclay L, Collins NR, et al. Genetic and epidemiologic trends of norovirus outbreaks in the United States from 2013 to 2016 demonstrated emergence of novelGII.4 recombinant viruses[J]. J Clin Microbiol, 2017, 55(7): 2208-2221. DOI: 10.1128/JCM.00455-17.

[5]Vinjé J. Advances in laboratory methods for detection and typing of norovirus[J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(2): 373-381. DOI: 10.1128/JCM.01535-14.

[6]Bull RA, Hansman GS, Clancy LE, et al. Norovirus recombination in ORF1/ORF2 overlap[J]. Emerg Infect Dis, 2005, 11(7): 1079-1085. DOI: 10.3201/eid1107.041273.

[7]Mahar JE, Bok K, Green KY, et al. The importance of intergenic recombination in norovirus GII.3 evolution[J]. J Virol, 2013, 87(7): 3687-3698. DOI: 10.1128/JVI.03056-12.

[8]Lu J, Sun L, Fang L, et al. Gastroenteritis outbreaks caused by Norovirus GII.17, Guangdong province, China, 2014-2015[J]. Emerg Infect Dis, 2015, 21(7): 1240-1242. DOI:10.3201/eid2107.150226.

[9]Gao Z, Liu B, Huo D, et al. Increased norovirus activity was associated with a novel norovirus GII.17 variant in Beijing, China during winter 2014-2015[J]. BMC Infect Dis, 2015, 15: 574. DOI: 10.1186/s12879-015-1315-z.

[10]Matsushima Y, Ishikawa M, Shimizu T, et al. Genetic analyses of GII.17 norovirus strains in diarrheal disease outbreaks from December 2014 to March 2015 in Japan reveal a novel polymerase sequence and amino acid substitutions in the capsid region[J]. Euro Surveill, 2015, 20(26): pii21173. DOI: 10.2807/1560-7917.ES2015.20.26.21173

[11]Lu J, Fang L, Zheng H, et al. The evolution and transmission of epidemic GII.17 noroviruses[J]. J Infect Dis, 2016, 214(4): 556-564. DOI: 10.1093/infdis/jiw208.

[12]許軍, 石鑫, 舒暢, 等. 黑龍江省2012-2015年諾如病毒感染的分子流行病學研究[J]. 中國公共衛(wèi)生管理, 2016, 32(5): 569-572. DOI: 10.19568/j.cnki.23-1318.2016.05.001.

[13]史永林, 孔翔羽, 靳淼, 等. 安徽省諾如病毒胃腸炎暴發(fā)的分子病原學特征研究[J]. 中華實驗和臨床病毒學雜志, 2015, 29(4): 310-312. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2015. 04.007.

[14]謝才文, 唐 薇, 杜春生, 等. 廣州市某所特殊教育學校諾如病毒急性胃腸炎暴發(fā)疫情分析[J]. 疾病監(jiān)測與控制雜志, 2017, 11(1): 30-32.

[15]Bruggink LD, Oluwatoyin O, Sameer R, et al. Molecular and epidemiological features of gastroenteritis outbreaks involving genogroup I norovirus in Victoria, Australia, 2002-2010[J]. J Med Virol, 2012, 84(9): 1437-1448. DOI: 10.1002/jmv.23342.