郭春艷　劉楊　封青　梁導(dǎo)艷　孫晶瑩　李慧瑾　趙向絨　李研　趙彭花　胡軍

710068 西安，陜西省人民醫(yī)院(郭春艷、劉楊、封青、梁導(dǎo)艷、孫晶瑩、趙向絨、李研、趙彭花、胡軍)； 710068 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院(郭春艷、劉楊、封青、梁導(dǎo)艷、孫晶瑩、趙向絨、李研、趙彭花、胡軍)；710021 西安醫(yī)學(xué)院(李慧瑾)

流感大流行對(duì)人類健康危害嚴(yán)重。流感病毒型別多，血凝素(Hemagglutinin, HA)抗原表位變異是造成流感反復(fù)流行的主要因素[1-4]。接種疫苗是預(yù)防流感的主要措施，但傳統(tǒng)思路開發(fā)的疫苗往往滯后于疫情暴發(fā)[5]。研制能夠誘導(dǎo)持久保護(hù)性免疫的通用流感疫苗對(duì)流感預(yù)防具有現(xiàn)實(shí)意義，而HA抗原表位預(yù)測(cè)工作是通用流感疫苗研究的重要基礎(chǔ)之一。目前研究抗原表位的方法主要是計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)和單克隆抗體(monoclonal antibody, mAb, 簡(jiǎn)稱單抗)技術(shù)。Igaroshi等[6]采用計(jì)算機(jī)同源建模方法對(duì)2009年H1N1流感病毒HA抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，并將HA抗原表位分為4個(gè)。應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)流感病毒HA的抗原表位成了主流，但是缺乏相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)進(jìn)行佐證[7]。

單抗能識(shí)別并結(jié)合單一的抗原表位，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中得到極為廣泛的應(yīng)用[8]。Rockman等[9]利用與H5N1各毒株具有廣泛交叉反應(yīng)性的單抗識(shí)別HA中和表位，詳細(xì)說明了H5N1流感病毒抗原漂移的機(jī)制。本文以H1N1流感病毒裂解疫苗為免疫原，通過篩選制備3株識(shí)別HA蛋白的單抗，同時(shí)以單抗作為研究工具，從抗體相互阻斷試驗(yàn)著手，并以計(jì)算機(jī)模擬方法對(duì)其驗(yàn)證，深入研究HA的抗原表位，其結(jié)果完善并補(bǔ)充了現(xiàn)有抗原表位預(yù)測(cè)方法，同時(shí)為闡明流感病毒免疫機(jī)制提供研究思路。

1　材料與方法

1.1主要試劑甲型H1N1流感病毒裂解疫苗(國(guó)藥準(zhǔn)字S20090015)購(gòu)自華蘭生物疫苗有限公司；RNA提取試劑盒(DP419)、cDNA第一鏈合成試劑盒(KR103)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；DNA聚合酶、pMD19-T載體、DNA Marker為TaKaRa(日本)公司產(chǎn)品；SBA ClonotypingTMSystem/HRP單抗亞類鑒定試劑盒(5300-05)購(gòu)自SouthernBiotech公司。

1.2單抗的制備和鑒定首次免疫：弗氏完全佐劑與流感裂解疫苗乳化后，進(jìn)行皮下免疫，20～25μg/只；二次免疫：應(yīng)用弗氏不完全佐劑，同首次免疫劑量和方法；加強(qiáng)免疫：融合前3 d，只用流感裂解抗原腹腔追加免疫。采用間接ELISA方法、有限稀釋法進(jìn)行3～4次亞克隆，篩選分泌抗體的陽(yáng)性細(xì)胞株[10]；BALB/c小鼠體內(nèi)注入液體石蠟，7 d后腹腔注入篩選出的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株制備腹水[11]；然后采用辛酸-硫酸銨方法純化腹水[12]。采用SBA ClonotypingTMSystem/HRP單抗亞類鑒定試劑盒測(cè)定，具體方法見說明書。

1.3單抗識(shí)別抗原位點(diǎn)分析用改良的過碘酸鈉法將各株純化的單抗標(biāo)記HRP，間接ELISA方法測(cè)定酶標(biāo)單抗的工作濃度(當(dāng)待測(cè)單抗與抗原反應(yīng)的OD450 nm值出現(xiàn)下降前的一個(gè)稀釋度作為該抗體的工作濃度)。H1N1抗原包被96孔ELISA檢測(cè)板，濃度為2 μg/ml；分別用過飽和的單抗與之反應(yīng)進(jìn)行封閉，150 μl/孔，37 ℃孵育1 h，常規(guī)洗滌；然后加入某一工作濃度的HRP標(biāo)記單抗，100 μl/孔，以SP2/0作為陰性對(duì)照，37 ℃反應(yīng)1 h后洗滌；TMB顯色后2 mol/L濃硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450 nm值。根據(jù)(對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組)/對(duì)照組判定抑制率(IR)。其中IR小于或等于0.4為標(biāo)記抗體和封閉抗體識(shí)別不相同的位點(diǎn)；IR大于或等于0.8為兩株抗體識(shí)別的表位高度相關(guān)或一致；IR在0.4～0.8范圍內(nèi)代表識(shí)別的位點(diǎn)有相關(guān)性[13]。

1.4克隆3株單抗的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因收集3株分泌抗H1N1流感病毒HA蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞株，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，作為后續(xù)基因克隆的模板。對(duì)NCBI公布的小鼠單抗輕鏈和重鏈的可變區(qū)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，共設(shè)計(jì)27條引物，見表1。用8條引物(7條上游引物+1條下游引物)PCR擴(kuò)增單抗輕鏈可變區(qū)基因，用9條引物(5條上游引物+4條下游引物)PCR擴(kuò)增單抗重鏈可變區(qū)基因。輕鏈基因約320 bp，重鏈基因約350 bp。將PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物再次進(jìn)行PCR鑒定(輕鏈在擴(kuò)增產(chǎn)物下游設(shè)計(jì)5條引物，重鏈在擴(kuò)增產(chǎn)物上游設(shè)計(jì)5條引物)。輕鏈鑒定陽(yáng)性目的條帶約180 bp，重鏈鑒定為陽(yáng)性的條帶約150 bp。T載體與膠回收的陽(yáng)性片段連接后轉(zhuǎn)化DH5α大腸埃希菌，經(jīng)PCR和酶切鑒定后測(cè)序，將測(cè)序正確的核苷酸序列翻譯為氨基酸序列。

1.5計(jì)算機(jī)模擬分析HA蛋白與單抗結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)操作方法如下：① 查找已經(jīng)報(bào)告的抗體與流感病毒HA蛋白結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)模板，并明確二者之間的結(jié)合表位；② 應(yīng)用NCBI blast軟件分別比對(duì)A1-12、H1-13、H1-15與晶體模板中抗體序列的同源性，以同源性最高的晶體模板中的抗體作為目標(biāo)抗體；③ 找出該目標(biāo)抗體與HA晶體結(jié)合的位點(diǎn)；④ 將本文所用的HA氨基酸序列與“③”中確定的HA晶體上的位點(diǎn)比對(duì)，以此分別確定三株單抗與HA蛋白的結(jié)合表位。

表1　小鼠單抗輕鏈和重鏈可變區(qū)引物

2　結(jié)果

2.1陽(yáng)性單抗的建立及其特性鑒定應(yīng)用現(xiàn)有的單抗融合技術(shù)，最終獲得3株穩(wěn)定分泌抗HA的單抗，分別命名為H1-13、H1-15、A1-12。應(yīng)用單抗亞類鑒定試劑盒，測(cè)定3株單抗的型均為κ鏈，H1-15亞類為IgM，H1-13、A1-12亞類均為IgG1。

2.2單抗識(shí)別HA抗原表位分析將這3株單抗作為研究工具來研究抗原表位，具體結(jié)果見表2。H1-15與A1-12、H1-13間的反應(yīng)抑制率均在40%以下，抑制不明顯，抑制率越小，空間位置越遠(yuǎn)，表明其識(shí)別的位點(diǎn)可能不同，H1-15單獨(dú)成為第一組。如先加H1-13，再加入HRP標(biāo)記的A1-12，兩者間的抑制率為27%，說明H1-13與A1-12識(shí)別兩個(gè)不同的位點(diǎn)。如先加A1-12再加入HRP標(biāo)記的H1-13，反應(yīng)抑制率在93%，表明其識(shí)別的抗原表位具有相關(guān)性，推測(cè)其針對(duì)比較接近的2個(gè)不同的抗原表位，所以A1-12和H1-13成為第二組。

表2　3株單克隆抗體之間反應(yīng)抑制率(%)

2.3抗體輕、重鏈可變區(qū)氨基酸序列分析分別克隆上述3株抗體細(xì)胞系的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因序列VL和VH，見表3。

VH和VL配對(duì)時(shí)，各個(gè)高變區(qū)的環(huán)在分子表面形成抗原結(jié)合部位，由于抗體用這些高變環(huán)以表面互補(bǔ)的方式來結(jié)合抗原，一般又將這些高變環(huán)稱為互補(bǔ)決定區(qū)(complementary-determining region, CDR)，各個(gè)不同CDR的分別稱作CDR1、CDR2和CDR3。在CDR之間的區(qū)域氨基酸序列的變化則較小，稱為骨架區(qū)(framework region,FR)，輕鏈和重鏈各有4個(gè)FR，即FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3，F(xiàn)R4。以H1-13為例進(jìn)行說明，應(yīng)用abYsis軟件分析抗體的CDR區(qū)及FR區(qū)，具體見圖1。

2.4分析單抗結(jié)合H1N1流感病毒HA上的氨基酸位點(diǎn)用計(jì)算機(jī)模擬方法分別分析3株單抗與2009年和1918年流感病毒結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)，其中H1-13識(shí)別的位點(diǎn)與A1-12識(shí)別的位點(diǎn)非常相似，可將這兩株抗體分為一組；H1-15識(shí)別的位點(diǎn)與另外兩株截然不同，將其劃為一組，具體預(yù)測(cè)結(jié)果見表4。

3　討論

近幾年，流感大流行嚴(yán)重威脅人們的生命安全，抗原表位預(yù)測(cè)是研究流感流行、致病及開發(fā)疫苗的重要工具，目前已經(jīng)確定的HA表位非常有限。單克隆抗體技術(shù)在研究抗原表位方面應(yīng)用日益廣泛[14]，計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)研究抗原表位可以有效簡(jiǎn)化表位研究過程。因此，本研究以本實(shí)驗(yàn)室制備的3株抗H1N1流感病毒單抗為研究對(duì)象，聯(lián)合應(yīng)用ELISA阻斷試驗(yàn)和計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)，將這3株單抗識(shí)別的抗原表位區(qū)分為2類。兩種方法預(yù)測(cè)的結(jié)果得到了相互印證，也進(jìn)行了相互補(bǔ)充，間接驗(yàn)證了應(yīng)用ELISA阻斷試驗(yàn)預(yù)測(cè)抗體識(shí)別抗原表位方法的可行性[15]。

圖1　H1-13抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)及骨架區(qū)基因序列Fig.1　Analysis of light and heavy chain variable region and skeleton region sequences of H1-13 antibody

單克隆抗體序列A1-12VHVQLVESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTDYGVNWVRQPPGKGLEWLGLIWGEGSTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARDKGINYWYFDVWGQGTTVTVSSVLDIVLTQSPLSLPVSLGDQASMSCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLEH1-13VHVQLEESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVAYISNGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARNYGYGFAYWGQGTTVTVSSVLDIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPHTFGGGTKLELH1-15VHVQLQESGPELVKPGASVKISCKASGYSFTAYFMNWVMQSHGKSLEWIGRINPYNGDTFYNQKFKGKATLTVDKSSSTAHMELRSLASEDSAVYYCARHPFYAMDYWGQGTTVTVSSVLDVLMTQAPKFMSTSVGGRVSITCKASQDVNTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYTTPYTFGGGTKLELK

表4　3株mAbs與H1N1流感病毒HA結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)結(jié)果

阻斷ELSIA試驗(yàn)中出現(xiàn)了疊加順序不同，抑制率不同。從單抗與1918年流感病毒結(jié)合的位點(diǎn)可見，H1-13識(shí)別的位點(diǎn)位于A1-12識(shí)別的位點(diǎn)內(nèi)；從與2009年流感病毒識(shí)別的位點(diǎn)可見，H1-13與A1-12識(shí)別的位點(diǎn)非常接近。原因可能是由于先加入H1-13作為封閉抗體后，導(dǎo)致了抗原表位結(jié)構(gòu)的變構(gòu)，Reynolds等[16]提出了變構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)，利用這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)可以研究、分析變構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)、功能。Alix等[17]利用PEOPLE程序來預(yù)測(cè)線性抗原表位，發(fā)現(xiàn)抗原與抗體發(fā)生反應(yīng)的時(shí)候，抗原表位的構(gòu)象發(fā)生了變化，因此抗原表位是有柔韌性的。此外，表面極性大、親水性強(qiáng)的氨基酸殘基通常也參與表位構(gòu)成，所以須用其他實(shí)驗(yàn)方法來進(jìn)一步驗(yàn)證。

1918年H1N1流感病毒與2009年H1N1流感病毒在HA抗原表位區(qū)域具有極高的相似度[18]，對(duì)這3株單抗進(jìn)行預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)出二種結(jié)合模式，比對(duì)到1918、2009年流行的H1N1的血凝素HA蛋白上，分別預(yù)測(cè)出了結(jié)合位點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)3株單抗結(jié)合HA上的氨基酸位點(diǎn)均分布在HA結(jié)構(gòu)的頭部，頭部的抗原決定簇決定了病毒的抗原性，該結(jié)果為后期流感病毒HA表位疫苗的研究提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

利益沖突無(wú)

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