邱源旺　甘建和　楊文龍　戴亞萍　王俊　張波　汪錚　蘇婷婷　李燚光　周紅燕　徐微　黃利華

214005 無錫市第五人民醫(yī)院(邱源旺、戴亞萍、王俊、張波、汪錚、李燚光、蘇婷婷、周紅燕、徐微、黃利華)；215006 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院(甘建和)；330006南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院(楊文龍)

目前國內(nèi)外慢性乙型肝炎防治指南均將恩替卡韋(entecavir, ETV)作為慢性乙型肝炎(CHB)患者臨床抗病毒治療的首選藥物之一，但因其療程的長期性，造成臨床上部分患者服藥的依從性差，自行停藥以及不規(guī)范停藥的現(xiàn)象時有發(fā)生。因此，如何實(shí)現(xiàn)ETV安全停藥是目前研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)問題。近期研究報道ETV除了直接抑制HBV復(fù)制外，通過調(diào)節(jié)Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子水平對控制病毒及維持病毒學(xué)應(yīng)答產(chǎn)生影響[1]，推測ETV停藥后是否復(fù)發(fā)可能與Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子表達(dá)水平相關(guān)，這些細(xì)胞因子的變化以及其在維持持久應(yīng)答中的作用目前不清楚，仍待進(jìn)一步闡明。

本研究旨在接受ETV治療并達(dá)到我國2010年發(fā)布的慢性乙型肝炎防治指南停藥標(biāo)準(zhǔn)、HBeAg陽性的CHB患者中，研究ETV停藥后Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子表達(dá)水平的動態(tài)變化特點(diǎn)及其在ETV停藥后維持持久病毒學(xué)應(yīng)答中的作用。

1　對象與方法

1.1研究對象入選2009年1月至2011年12月在無錫市第五人民醫(yī)院、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院、蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診或住院的HBeAg陽性的CHB接受ETV治療患者。

1.2入選標(biāo)準(zhǔn)(1)接受ETV治療至少2年以上，并符合2010年我國發(fā)布的慢性乙型肝炎防治指南的停藥標(biāo)準(zhǔn)[2]；(2)愿意簽署醫(yī)院倫理委員會通過的知情同意書，依從性好、資料完整、能接受隨訪的CHB患者。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn)(1)接受ETV治療前或停藥時，經(jīng)影像學(xué)、肝活檢或Fibrotouch提示明顯肝纖維化或肝硬化的患者；(2)既往出現(xiàn)過對任何一種核苷(酸)類似物耐藥的患者；(3)既往有停藥后復(fù)發(fā)史的患者；(4)合并丙型肝炎、自身免疫性或膽汁淤積性肝病、或伴有惡性腫瘤、嚴(yán)重全身性疾??；(5)孕婦；(6)近6月內(nèi)使用過免疫調(diào)節(jié)劑的患者。

1.4停藥標(biāo)準(zhǔn)[2]HBeAg 陽性患者在達(dá)到了HBV DNA檢測下限以下(HBV DNA<100拷貝/ml)以及ALT復(fù)常和HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換之后，再經(jīng)過1年以上的鞏固治療仍保持不變，并且具有2年以上總療程的患者。

1.5病毒學(xué)應(yīng)答定義[3]病毒學(xué)應(yīng)答是指經(jīng)抗病毒治療血清HBV DNA降至低于檢測值下限。持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答具體指的是停止抗病毒治療后隨訪52周仍能保持血清HBV DNA持續(xù)低于檢測值下限。

1.6復(fù)發(fā)(Relapse)定義[3]病毒學(xué)復(fù)發(fā)即獲得病毒學(xué)應(yīng)答的患者在停藥之后，每隔1個月檢測兩次HBV DNA都超過104拷貝/ml。

1.7復(fù)發(fā)的處理對于病毒學(xué)復(fù)發(fā)的患者再次予以恩替卡韋抗病毒治療，同時結(jié)束本停藥研究的隨訪，納入普通CHB的抗病毒隨訪中。

1.8觀察指標(biāo)和檢測方法分別在停藥0、12、24、52周檢測肝功能、HBV DNA、HBV標(biāo)志物(HBV-M)、Th1/Th2/Thl7細(xì)胞因子。肝功能采用日立7600全自動生化分析儀及配套試劑檢測；HBV DNA及HBV基因分型由lightcycle基因熒光定量分析儀檢測，HBV DNA檢測采用PCR-熒光探針法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測下限為100拷貝/ml；HBV基因分型采用實(shí)時熒光PCR法，使用上海復(fù)星科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的試劑盒檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作；ETV相關(guān)耐藥位點(diǎn)檢測由美國貝克曼庫爾特公司CEQ-8000基因測序儀采用HBV聚合酶區(qū)基因序列分析法檢測，引物由上海

表1　復(fù)發(fā)組與持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答組基線特征比較

生工生物工程公司合成。HBeAb、HBeAg采用1235時間分辨熒光免疫分析儀檢測。HBsAg的定量檢測采用i2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及采用Abbott試劑檢測；Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子采用微量樣本多重蛋白定量(CBA)法，使用美國BD公司生產(chǎn)的人Th1/Th2/Thl7細(xì)胞因子試劑盒檢測單個樣本中多種蛋白的含量，包括Th1(IL-2、IFN-γ、TNF-α)、Th2(IL-4、IL-6、IL-10)和Thl7(IL-17A)。停藥觀察時間均為52周。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)或中位數(shù)±四分位間距(M±QR)表示，采用t檢驗(yàn)、或秩和檢驗(yàn)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；組間率的比較用R x C表的χ2檢驗(yàn)。HBV DNA在檢測水平以下的患者按照2.0 log10拷貝/mL進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，復(fù)發(fā)患者將復(fù)發(fā)時的檢測數(shù)據(jù)計入隨后的各隨訪時間點(diǎn)的檢測結(jié)果。所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析。所有統(tǒng)計分析基于雙側(cè)假設(shè)檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1研究對象基本臨床資料本研究根據(jù)停藥標(biāo)準(zhǔn)入組停藥患者共136例，HBV聚合酶區(qū)基因序列分析均未發(fā)現(xiàn)ETV耐藥位點(diǎn)耐藥，剔除肝硬化及隨訪<24周的患者各12例，納入滿足本研究方案的CHB患者112例，其中男74例，女38例，年齡22～63歲(40.1±11.2)，抗病毒治療總療程26～40個月，平均(30.7±3.5)個月；停藥后52周病毒學(xué)復(fù)發(fā)率為48.2% (54/112)。根據(jù)患者停藥52周是否發(fā)生病毒學(xué)復(fù)發(fā)，將患者分復(fù)發(fā)組(Viral relapse，VR)和持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答組(Sustained off-treatment virological response,SVR)，SVR組患者年齡、基線HBV DNA水平均低于VR組，VR組經(jīng)HBV聚合酶區(qū)基因序列分析均未發(fā)現(xiàn)恩替卡韋耐藥位點(diǎn)耐藥，2組間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001)，性別、基線ALT水平、基因型、病毒學(xué)應(yīng)答時間及治療療程比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

2.2SVR組與VR組停藥后HBsAg(log10IU/mL)、HBVDNA、HBeAg及ALT水平的變化SVR組與VR組停藥后12周、24周、52周間HBsAg水平、HBV DNA水平、HBeAg水平及ALT水平比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(均P<0.05)，見表2。

表2　VR組與SVR組停藥后HBsAg、HBV DNA、HBeAg及ALT水平的變化

注：a與同組停藥基線(0周)比較，P<0.05.

Note:aP<0.05 compared with the baseline of entecavir discontinuation of the same group.

2.3SVR組與VR組患者停藥時Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子表達(dá)水平比較SVR組和VR組患者在停藥時血清Th1(IFN-γ、IL-2、TNF-α)水平比較，IFN-γ水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004，表3)，IL-2、TNF-α水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05，表3)。SVR患者血清Th2(IL-4、IL-6、IL-10)水平均低于VR，組間比較只有IL-10水平結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001，表3)。停藥時Th17(IL-17A)SVR組高于VR組，但兩組間結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.609，表3)。

表3　VR組與SVR組停藥后Th1(IFN-γ、IL-2、TNF-α)/Th2(IL-4、IL-6、IL-10)/Th17(IL-17A)細(xì)胞因子表達(dá)水平(ng/ml)比較

注：a與同組停藥基線(0周)比較，P<0.05.

Note:aP<0.05 compared with the baseline (0 week) of entecavir discontinuation of the same group.

2.4Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子表達(dá)水平在ETV停藥后維持病毒學(xué)應(yīng)答中的作用SVR組停藥后Th1型細(xì)胞因子中TNF-α、IL-2、IFN-γ水平出現(xiàn)波動，但無顯著性差異(均P>0.05，表3)。Th2類細(xì)胞因子IL-10水平呈顯著下降趨勢，各隨訪時間點(diǎn)與停藥基線結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.092,2.368,2.726,均P<0.05，表3)。SVR組患者在各隨訪時間點(diǎn)IFN-γ水平保持在較高水平，均顯著高于VR組(均P<0.05，表3)。

VR組患者停藥后Th1細(xì)胞因子IFN-γ水平前24周呈下降趨勢，24周后呈上升趨勢，停藥24周IFN-γ水平與停藥基線結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.984,P<0.05，表3)，Th2類細(xì)胞因子中在隨訪52周過程中IL-4、IL-6及IL-10水平出現(xiàn)波動無顯著性差異(均P>0.05，表3)。VR組患者在停藥0、12、24、52周IL-10水平均顯著高于SVR組患者(P<0.05，表3)。

SVR組患者停藥后IL-17A水平略有升高，各隨訪時間點(diǎn)高于復(fù)發(fā)組，但組間結(jié)果比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05, 表3)。

3　討論

HBV感染的臨床轉(zhuǎn)歸一般是由感染之后人體的免疫系統(tǒng)和病毒之間相互作用所決定。正常的免疫狀態(tài)下，Th1/Th2兩類細(xì)胞因子相互制約，處于動態(tài)平衡，對機(jī)體抵抗病原體感染、控制及清除病毒均具有重要意義，一旦這種動態(tài)平衡被打破將導(dǎo)致疾病的發(fā)生與發(fā)展，影響疾病的預(yù)后轉(zhuǎn)歸[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在ETV抗病毒治療中，第4周時患者血清IFN-γ水平顯著低于基線水平，其后又緩慢上升，但在48周時仍低于基線點(diǎn)，因此認(rèn)為應(yīng)用ETV治療后患者IFN-γ水平的下降一方面降低體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，減輕肝臟的纖維化反應(yīng)，延緩疾病的進(jìn)展；另一方面ETV治療過程中體內(nèi)Th1類免疫反應(yīng)下降而Th2類免疫反應(yīng)不足，機(jī)體清除病毒的能力被削弱而不利用病毒的清除與控制，當(dāng)停止用藥或出現(xiàn)耐藥時仍會出現(xiàn)病毒學(xué)復(fù)發(fā)。也有研究報道ETV在抗病毒治療過程中，可促進(jìn)IFN-γ水平升高，使Th1/Th2細(xì)胞因子平衡的變化向Th1方向傾斜，從而發(fā)揮控制HBV復(fù)制、促進(jìn)HBeAg的血清轉(zhuǎn)換作用[5]。本研究結(jié)果顯示ETV停藥后SVR組在停藥后52周Th1細(xì)胞因子雖然沒有發(fā)現(xiàn)顯著升高，但這些患者IFN-γ、IL-2、TNF-α水平均穩(wěn)定在較高水平，而且IFN-γ水平在各隨訪時間點(diǎn)均顯著高于VR組,說明Th1細(xì)胞因子IFN-γ水平在ETV停藥后維持病毒學(xué)應(yīng)答中發(fā)揮一定的作用。其機(jī)制可能是一方面停藥后機(jī)體仍能通過自身的T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等分泌一定水平的IFN-γ，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的增殖、分化，參與細(xì)胞免疫，從而抑制HBV DNA復(fù)制[6-7]；另一方面IFN-γ可以抑制Th2型細(xì)胞因子表達(dá)，使患者體內(nèi)IL-10表達(dá)水平降低，Th1/Th2細(xì)胞因子平衡的變化趨勢向Th1方向傾斜，患者體內(nèi)細(xì)胞免疫功能得到了維持或加強(qiáng)，有利于控制病毒和減少停藥后病毒學(xué)復(fù)發(fā)[8]。VR組患者停藥后52周隨訪過程中Th2類細(xì)胞因子穩(wěn)定在較高水平，Th1細(xì)胞因子中IFN-γ水平呈下降趨勢，而且停藥24周IFN-γ水平較停藥基線水平顯著下降?；颊咴谕Ｋ?4周后IFN-γ水平出現(xiàn)上升，可能原因?yàn)椴糠只颊咄Ｋ幒蟪霈F(xiàn)HBV DNA反彈，誘發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，通過自然殺傷細(xì)胞或T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，進(jìn)一步調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的分化、增殖，參與肝臟炎癥反應(yīng)及抗病毒[9]。VR組患者IL-10水平在停藥后呈上升趨勢，顯著高于SVR組，說明Th2細(xì)胞因子IL-10水平的高表達(dá)可能與病毒學(xué)復(fù)發(fā)有關(guān)。其機(jī)制可能是IL-10能促使慢性HBV感染的T細(xì)胞耗竭，抑制病毒特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答[10]，同時在抗原呈遞細(xì)胞作用下,抑制T淋巴細(xì)胞等分泌細(xì)胞因子,下調(diào)IFN-γ等Th1型細(xì)胞因子的表達(dá),使Th1/Th2細(xì)胞因子平衡的變化總趨勢向Th2方向傾斜，HBV DNA不能被有效清除，從而導(dǎo)致CHB患者ETV停藥后易復(fù)發(fā)[11-12]，但其確切機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。上述研究結(jié)果表明Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡狀態(tài)與ETV停藥后復(fù)發(fā)密切相關(guān)。

近期研究發(fā)現(xiàn)Thl7參與肝臟炎癥反應(yīng)及清除病毒過程，與CHB的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[13]。Yu等[14]報道ETV抗病毒治療過程中隨著HBV DNA的水平下降，伴有Th17細(xì)胞數(shù)量升高。本研究結(jié)果顯示，雖然ETV停藥后各隨訪時間點(diǎn)SVR組IL-17A水平高于VR組，但結(jié)果比較均無顯著性差異，提示Th17細(xì)胞因子IL-17A與ETV停藥后復(fù)發(fā)無顯著相關(guān)性。

綜上所述，Th1細(xì)胞因子IFN-γ水平穩(wěn)定在較高水平表達(dá)有利于ETV停藥后維持病毒學(xué)應(yīng)答，Th2細(xì)胞因子IL-10水平的高表達(dá)可能與病毒學(xué)復(fù)發(fā)有關(guān)，CHB患者ETV停藥后可能通過Th1/Th2細(xì)胞因子平衡機(jī)制在維持持久的病毒學(xué)應(yīng)答中發(fā)揮一定的作用。由于本研究入組病例數(shù)相對少，停藥后觀察時間短，對于長期ETV停藥后復(fù)發(fā)與Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子水平的關(guān)系有待擴(kuò)大樣本及長期觀察研究。

利益沖突無

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