耳蝸基底膜組織巨噬細胞對噪聲的反應

楊衛(wèi)平 許陽 胡博華 董有毅 楊仕明

1解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，耳鼻咽喉研究所（北京100853）

2解放軍總醫(yī)院呼吸科（北京100853）

3美國紐約州立布法羅大學聽力及聾病研究中心(NY14214USA）

噪聲性聾是一種最常見的感音神經(jīng)性聾，由于交流障礙極大的影響了患者的生活質(zhì)量。噪聲性耳蝸損傷是由耳蝸內(nèi)組織機械性損傷引起的多方面反應，包括氧化反應、炎性反應、能量代謝障礙等導致耳蝸細胞生物和分子的變化。最新研究通過對噪聲暴露后小鼠和大鼠耳蝸感覺上皮相關基因RNA序列變化，及對差異表達基因的轉(zhuǎn)錄序列生物信息分析后發(fā)現(xiàn)，免疫和炎性反應是噪聲暴露后耳蝸的主要反應[1]。

由于血腦、血迷路屏障的存在，內(nèi)耳曾被認為是一個“免疫豁免器官”。近年來研究證明，內(nèi)耳具有免疫應答，免疫防疫和免疫調(diào)節(jié)功能[2-4]。Corti器位于耳蝸基底膜的頂部，由感覺細胞（內(nèi)、外毛細胞）和支持細胞構(gòu)成，Corti器的感覺細胞對噪聲等損傷因素最為敏感[5]。在生理狀態(tài)下耳蝸Corti器缺少免疫細胞，噪聲暴露后未見單核細胞滲入Cor?ti器[6]。耳蝸基底膜底部最接近Corti器，是否由耳蝸基底膜底部的免疫細胞對Corti器損傷的感覺細胞起到免疫監(jiān)視作用？鑒于噪聲暴露后耳蝸基底膜免疫反應問題，我們采用白細胞共同抗原(CD45)熒光免疫抗體標記耳蝸基底膜免疫細胞，觀察噪聲暴露前后耳蝸基底膜底部的免疫細胞形態(tài)的變化，為揭示噪聲暴露后耳蝸基底膜免疫反應機制提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

入選C57BL/6J小鼠（24只，4-8周，雌雄各半），購自杰克遜實驗室(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME,USA）。動物隨機分為實驗組和對照組，接觸噪聲暴露動物為實驗組，噪聲暴露后1、4和10天處死小鼠各6只，未接觸噪聲暴露動物6只為對照組。動物均無強噪聲暴露和耳毒性藥物使用史，所有實驗程序均符合美國紐約州立布法羅大學動物管理和使用委員會的倫理認證。

1.2 實驗步驟

所有實驗動物首先接受聽力學基線評估。噪聲暴露1天、4天和10天后處死動物,觀察噪聲暴露后耳蝸基底膜免疫細胞的變化。噪聲暴露10天組動物處死之前檢測ABR，定量觀察耳蝸毛細胞缺失數(shù)量，目的評估噪聲暴露后耳蝸聽功能和感覺細胞形態(tài)學的變化。

1.3 腦干誘發(fā)電位反應閾值(ABR)測試

動物于噪聲暴露前及噪聲暴露后10天，腹腔內(nèi)注射氯胺酮（87mg/kg）和賽拉嗪（3mg/kg）混合劑麻醉后，將動物置于加熱毯上維持體溫在37.5℃。記錄電極置于動物顱頂皮下，參考電極和接地電極分別置于測試耳和對側(cè)耳后皮下。應用電位反應測聽儀（SigGen,Turker-Davis Technologies,TDT,Alachua,FL,USA)檢測不同頻率（4、8、16和 32 kHz）短聲誘發(fā)的動物雙耳聽性腦干反應閾值（ABR），刺激重復率21次/秒。帶通濾波100～3000Hz，刺激強度為20 ～100 dBSPL，間隔 5 dB。

1.4 噪聲暴露

噪聲信號由實時信號處理器（RP2.1,Tucker Davis Technologies,TDT,USA)產(chǎn)生，經(jīng)衰減器(PA5 TDT,USA)和放大器(Crown XLS 202,Harman Inter?national Company,USA)傳至揚聲器(NSD2005-8,Eminence,USA)。噪聲暴露在隔聲室內(nèi)進行，揚聲器懸掛于動物籠子正上方30cm處。應用聲級計(LD-PCB,model 800B,APCB Piezotronics Div.,Lar?son Davis,USA)、前置放大器(LD-PCB,model 825,Larson Davis,USA)和電容式微音器(Larson and Da?vis,LDL 2559,USA)測量校準噪聲強度。噪聲暴露條件為:寬帶1-7kHz，120dBSPL，1小時。

1.5 損傷的感覺細胞評估

噪聲暴露后10天，ABR測試，CO2深度麻醉動物后處死，快速解剖取出雙側(cè)耳蝸,10%福爾馬林室溫固定4小時，為減少解剖因素造成人為的組織損傷，采用本課題組建立的原位耳蝸基底膜毛細胞觀察方法[7]，染色評估噪聲暴露后耳蝸毛細胞損傷情況。顯微鏡下去除蝸尖和外側(cè)壁部分，充分暴露耳蝸基底膜。用Alexa Fluor 488 phalloidin（1：75，Applied Biosystems,Carlsbad,CA,USA,10mM PBS稀釋)染色耳蝸毛細胞絲狀肌動蛋白（Filamentous actin,F-actin）。室溫避光孵育30分鐘，PBS液漂洗后將耳蝸置于培養(yǎng)皿中，熒光顯微鏡下觀察毛細胞形態(tài)變化。

1.6 CD45熒光免疫抗體標記耳蝸基底膜

噪聲暴露后1、4、10天快速解剖取出雙側(cè)耳蝸,經(jīng)10%福爾馬林4°C過夜固定后，分離耳蝸基底膜，將分離的耳蝸基底膜置入10mM PBS液清洗后，移入0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100，10%羊血清白蛋白，10mM PBS液稀釋，pH 7.40）液中，室溫作用1h。10mM PBS液清洗組織后，將耳蝸基膜移入10mM PBS稀釋的CD45抗體(goat CD 45 polyclonal antibody 1:200,AF114,RD Inc.,USA)液中4°C過夜。PBS液清洗組織后，將耳蝸基膜移入10 mM PBS稀釋的二抗液中(Alexa Fluor?488 donkey anti-goat IgG,1:200 in PBS,Invitrogen)室溫孵育2h，PBS液清洗組織。為鑒別非特異性染色，小塊標本僅用二抗液孵育。將標本移入5μg/ml碘化丙錠(propidium lodide,PI，Molecular probe,Inc.,Eugene,OR,USA)染色液中(10mM PBS配制)，室溫避光染色10min。將PBS清洗后的標本平鋪于載玻片，抗熒光退變劑(ProlongTM Antifade kit,Molecu?lar Probes Inc.USA)封片。

1.7 熒光顯微鏡觀察和計算機圖像分析

熒光顯微鏡下(Leica Z6 APO Manual Macro?Fluo,USA)觀察，采用顯微鏡附件數(shù)碼相機(SPOT RT,Color Diagnostic Instruments,Inc.,Sterling Heights,MI,USA)拍照全耳蝸基底膜，利用計算機圖像處理軟件(Adobe Photoshop CS6,version 13.0.1,Adobe Systems,San Jose,CA,USA)自動合成視圖。觀察噪聲暴露后小鼠耳蝸基底膜毛細胞和免疫細胞形態(tài)變化，自耳蝸頂回到底回計數(shù)全耳蝸基底膜缺失的毛細胞和CD45熒光染色陽性的免疫細胞。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用SigmaStat(Version3.5,San Jose,CA,USA)軟件進行數(shù)據(jù)分析。比較噪聲暴露前與噪聲暴露后10天小鼠不同頻率ABR閾值(x±s)，采用兩因素方差分析檢驗（時間×頻率）。比較噪聲暴露前與噪聲暴露后10天小鼠耳蝸基底膜頂回、底回毛細胞缺失數(shù)目(x±s)，采用兩因素方差分析檢驗（時間×部位）。比較噪聲暴露前與噪聲暴露后1、4、10天小鼠耳蝸基底膜頂回、底回CD45免疫陽性細胞數(shù)目±s)，采用兩因素方差分析檢驗（時間×部位）。P＜0.05認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 噪聲暴露后小鼠聽閾升高

噪聲暴露前和噪聲暴露后10天，分別進行ABR檢測，了解噪聲暴露對實驗動物聽功能的影響，結(jié)果顯示噪聲暴露后所有檢測頻率的ABR閾值均明顯提高(F=1622.754,df=1,104,P＜0.001;Tukey test,P＜0.001)，4個頻率的平均閾值由37.3±15.1 dBSPL提高至75.3±11.1 dBSPL，平均閾移為38.0±9.0 dBSPL，見圖1B所示。

2.2 噪聲致耳蝸毛細胞損傷

Alexa 488-labeled phalloidin染色毛細胞纖毛、表皮板后，熒光顯微鏡下觀察噪聲爆震后10天耳蝸基膜毛細胞形態(tài)的變化，如圖1A所顯示,外毛細胞損傷明顯,外毛細胞染色區(qū)缺失被記為毛細胞缺失。缺失的細胞出現(xiàn)在三排外毛細胞，第3排外毛細胞損傷最為嚴重，其次為第2排、第1排外毛細胞。定量觀察發(fā)現(xiàn)，噪聲暴露后全耳蝸基底膜毛細胞缺失數(shù)目增多，底回外毛細胞缺失數(shù)目明顯多于頂回(F=92.484,df=1,40,P＜0.001;Tukey test,P＜ 0.001)，見圖1C所示。

2.3 免疫細胞在耳蝸基底膜底面的分布和形態(tài)特點

熒光顯微鏡下觀察，在生理條件下小鼠耳蝸基底膜底面（鼓階面）存在CD45陽性免疫細胞，這些陽性免疫細胞主要為巨噬細胞，巨噬細胞分布于全耳蝸外側(cè)壁和骨螺旋板之間的耳蝸基底膜。CD45陽性細胞存在多種形態(tài)，其不同形態(tài)與耳蝸存在的部位相關。小鼠耳蝸基底膜為兩圈，頂回的巨噬細胞胞體呈樹枝狀，多個細長突起，胞漿少，細胞核多，核呈不規(guī)則型（見圖2A，細胞核染色未出示)。底回細胞胞體呈樹干狀或不規(guī)則的圓形、卵圓形，枝狀突起縮短、減少或消失，胞漿增多（見圖2D)。除巨噬細胞外，極少量的單核細胞存在于耳蝸基底膜底面，單核細胞為小圓型，細胞核大而圓。

2.4 噪聲暴露后耳蝸基底膜免疫細胞的變化

圖1 噪聲暴露后10天耳蝸聽功能下降毛細胞損傷。A:Alexa 488-labeled phalloidin染色的小鼠耳蝸基底膜底回毛細胞(200×)，噪聲暴露后第3排外毛細胞缺失數(shù)目最多，箭頭示缺失的外毛細胞區(qū)域，標尺=100m;B：比較噪聲暴露前后小鼠4個頻率ABR閾值的變化，噪聲暴露后10天小鼠不同頻率ABR閾值均明顯高于對照組(P＜0.001);C:定量觀察噪聲暴露后10天耳蝸基底膜頂回、底回外毛細胞缺失數(shù)目。與對照組比較，噪聲暴露后小鼠耳蝸基底膜頂回、底回外毛細胞缺失數(shù)目均增多，實驗組底回外毛細胞缺失數(shù)目明顯多于頂回(P＜0.001)。Fig.1 Structural damage and functional loss of the cochleae examined at10 days after exposure to an intense noise at120 dB sound pressure level(SPL)for 1 hour.A:Typical image of F-actin staining using Alexa 488-labeled phalloidin in hair cells in the basal section of cochlea(200×).The third row of out hair cells(OHCs)show the most damage,followed by the second and first rows of OHCs．Arrows point to the areas of missing outer hair cells.Bar=100m.B:Comparison of ABR thresholds at the 4 tested frequencies before and after noise exposure groups.The thresholds are significantly elevated above baseline with an increase at all tested frequencies in animal after noise exposure P＜0.001.C:Comparison of the number of missing OHCs before and afternoise exposure in the apical and basal sections in the basilarmembrane of cochlea.The average number of missing cells in the noise-injured ears is significantly higher than in the control ears P ＜0.001，and the average number of missing cells in the basal section is significantly higher than that observed in the apical section P＜0.001.

噪聲暴露后1天，單核細胞滲入耳蝸基底膜鼓階面，侵潤的CD45陽性的小圓細胞出現(xiàn)在耳蝸基底膜與外側(cè)壁交界處(見圖2E)，主要分布于耳蝸基底膜底回的上部,其分布與耳蝸感覺細胞損傷主要區(qū)域相吻合。噪聲暴露后4天，CD45陽性的小圓細胞胞體變大，出現(xiàn)細而短的突起，表明單核細胞轉(zhuǎn)化為巨噬細胞(見圖2C,F)。盡管耳蝸基底膜原有巨噬細胞數(shù)量減少，但由于大量單核細胞轉(zhuǎn)化為巨噬細胞，耳蝸基底膜底回CD45陽性細胞密度增加(見圖2F)。噪聲暴露后10天，耳蝸基底膜CD45陽性細胞形態(tài)與對照組無明顯改變。噪聲暴露后Corti氏器未見單核細胞遷入。圖3顯示噪聲暴露前及噪聲暴露后1,4,10天耳蝸基底膜頂回、底回CD45陽性細胞數(shù)目。噪聲暴露后1天，耳蝸基底膜CD45陽性細胞數(shù)目較正常對照組略有增加，但無統(tǒng)計學意義。噪聲暴露后4天，耳蝸基底膜頂回、底回CD45陽性細胞數(shù)目均較正常對照組明顯增加(F=15.205,df=3,46,P＜0.001;Tukey test,P＜0.001)，耳蝸底回CD45陽性細胞數(shù)目多于頂回P＜0.05。噪聲暴露后10天，CD45陽性細胞數(shù)目下降接近對照組。

圖2 噪聲暴露前后耳蝸基底膜底面CD45標記的免疫細胞形態(tài)。A,B,C:耳蝸基底膜頂回。D,E,F：耳蝸基底膜底回。A和D,B和E,C和F分別為正常對照，噪聲暴露后1天，4天耳蝸基底膜免疫細胞。箭頭示不同時間典型的免疫細胞形態(tài)，標尺=40m.Fig.2 Typical morphology of immune cells stained w ith CD45 beneath the basil armembrane of cochlea before and after noise exposure.A,B and C:Morphology of immune cells in the apical section.D,E and F:Morphology of immune cells in the basal section.A and D,B and E,Cand F:Morphology of immune cells before and 1day,4 days after noise exposure respectively.Arrowspoint to the typical morphology of immune cells in the different time.Bar=40m.

圖3 噪聲暴露前及噪聲暴露后1天、4天和10天耳蝸基底膜底面頂回、底回CD45陽性細胞數(shù)目。與噪聲暴露前比較，噪聲暴露后4天耳蝸基底膜頂回、底回CD45陽性細胞數(shù)目明顯多于對照組P＜0.001，底回CD45陽性數(shù)目明顯多于頂回 P＜0.05。Fig.3 Comparison of the numbers of CD45 positive cells in the apical and basal sections in the basilarmembrane of cochlea between the control and after noise exposure 1,4 and 10 days groups.The number of immune cells in the apical and basal sections at 4 days post-noise exposure is significantly greater than in the control group P ＜ 0.001，and the average number of CD45 positive cells in the basal section is significantly higher than that observed in the apical section P＜0.05。

3 討論

本實驗小鼠ABR檢測和缺失毛細胞計數(shù)結(jié)果表明，噪聲暴露后動物存在耳蝸聽功能和感覺細胞的損傷。我們研究的主要目的是揭示耳蝸基底膜鼓階面免疫細胞的形態(tài)特點及噪聲暴露后的變化。其主要發(fā)現(xiàn)：1，正常動物耳蝸基底膜底側(cè)面存在巨噬細胞，這些細胞呈現(xiàn)不同的形態(tài)特點。2，噪聲暴露后出現(xiàn)時間相關的單核細胞滲入和轉(zhuǎn)化。3，噪聲暴露后單核細胞滲入與感覺細胞損傷區(qū)域相吻合。4，噪聲暴露后耳蝸基底膜底回毛細胞缺失與免疫陽性細胞數(shù)目明顯增多的趨勢相一致。表明單核細胞侵潤是噪聲暴露后耳蝸基底膜的主要免疫反應。

CD45是白細胞共同抗原，巨噬細胞常用的標記物。本實驗采用CD45免疫熒光標記耳蝸基底膜免疫細胞。Hirose K等在2017年報道中指出，耳蝸內(nèi)的巨噬細胞不是小膠質(zhì)細胞[8]。主要依據(jù)：1，細胞表面標記物和功能蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞表達CD68，CD45，iba-1,F4/80和CX3CR1，證明這些細胞具有典型的組織巨噬細胞的性質(zhì)。2，內(nèi)耳的巨噬細胞體積大，突起粗，分布于內(nèi)耳組織。與巨噬細胞相比，小膠質(zhì)細胞體積小，突起細，分布于腦實質(zhì)組織內(nèi)。3，定居型耳蝸組織巨噬細胞存在更新，組織巨噬細胞源自血液中的單核細胞，單核細胞源自骨髓中的前體細胞。而小膠質(zhì)細胞則源于卵黃囊中胚層的原始細胞。γ射線照射殺死耳蝸內(nèi)巨噬細胞和所有骨髓造血細胞的小鼠，接受健康動物帶有內(nèi)源性熒光標記的骨髓移植后的2-3月內(nèi)，重新構(gòu)建了耳蝸內(nèi)的組織巨噬細胞。證明定居型耳蝸組織巨噬細胞源自骨髓中的前體細胞，而小膠質(zhì)細胞不能更新定居型耳蝸組織的巨噬細胞。本實驗觀察到噪聲暴露后，單核細胞滲入耳蝸基底膜，并轉(zhuǎn)化為組織巨噬細胞的結(jié)果,支持耳蝸基底膜的組織巨噬細胞不是小膠質(zhì)細胞的觀點。

在生理情況下，耳蝸的螺旋韌帶、螺旋板、螺旋神經(jīng)節(jié)和血管紋周圍血管存在免疫細胞[9-12]。本文報道了耳蝸基底膜的底部存在巨噬細胞的分布特點，這些細胞從頂回到底回分布于整個耳蝸基底膜，廣泛的分布模式表明全耳蝸基底膜存在免疫監(jiān)督。耳蝸基底膜組織巨噬細胞的形態(tài)特點為本研究的一個重要發(fā)現(xiàn)，值得注意的是，生理條件下巨噬細胞的形態(tài)與其在耳蝸基底膜部位相關。頂回的巨噬細胞呈樹枝狀，而底回的巨噬細胞呈不規(guī)則狀,推論基底膜巨噬細胞存在多種亞群體。這種異質(zhì)性表明，耳蝸基底膜頂回和底回的巨噬細胞具有部位相關的不同功能，其在耳蝸基底膜頂回和底回的功能尚不清楚。研究表明，耳蝸基底膜底回的感覺細胞對老化和噪聲等損傷較頂回更為敏感[13,5]，不同的免疫功能可能是其作用之一。

組織巨噬細胞分為定居型和游走型。巨噬細胞源自于單核細胞，有研究報道，噪聲暴露后單核細胞滲入耳蝸組織，其在耳蝸損傷和恢復中的作用尚不清楚[9,11,14]。我們發(fā)現(xiàn)噪聲暴露后1天單核細胞侵潤耳蝸基底膜的底面，噪聲暴露后4天轉(zhuǎn)化為巨噬細胞。前期研究發(fā)現(xiàn)，噪聲暴露后10分鐘耳蝸基底膜外毛細胞核出現(xiàn)固縮，30分鐘可見核腫脹細胞[15]。噪聲暴露后耳蝸基底膜單核細胞的滲入和轉(zhuǎn)化發(fā)生在噪聲暴露后1-4天，推論耳蝸細胞的免疫反應發(fā)生在耳蝸基底膜細胞損傷之后，時間相關的單核細胞滲入及巨噬細胞的轉(zhuǎn)換是耳蝸免疫反應一個重要的起始步驟。噪聲暴露后10天耳蝸基底膜免疫細胞數(shù)目接近噪聲暴露前水平，與噪聲暴露后內(nèi)耳免疫炎性反應的相關報道結(jié)果相吻合[14]。

單核細胞從何處進入耳蝸基底膜并不十分清楚，有學者認為單核細胞從骨螺旋板血管和它的分支進入耳蝸基底膜[16]。我們認為耳蝸外側(cè)壁可能是單核細胞進入耳蝸基底膜的主要部位，因為耳蝸外側(cè)壁的血管紋和螺旋韌帶存在豐富的血管系統(tǒng)。本研究發(fā)現(xiàn)單核細胞簇存在于耳蝸基底膜與外側(cè)壁的連接處，推論單核細胞主要來自耳蝸外側(cè)壁的血管。

單核細胞的滲入和轉(zhuǎn)化主要發(fā)生在耳蝸基底膜的底回上部，其與感覺細胞損傷主要區(qū)域相吻合。組織的巨噬細胞具有三種基本的免疫功能：損傷細胞的吞噬，產(chǎn)生炎性分子，抗原呈遞作用[2,8,17]。巨噬細胞屬于抗原呈遞細胞，加工處理抗原，將其傳遞給T淋巴細胞，誘導免疫應答反應。定量研究發(fā)現(xiàn)，噪聲暴露后耳蝸底回毛細胞缺失和CD45陽性免疫細胞數(shù)目增多的結(jié)果相一致,推論巨噬細胞參與了噪聲性耳蝸基底膜感覺細胞的損傷過程。巨噬細胞分為兩種亞型，即M1型和M2型。M1型參與促炎反應，M2型參與抗炎反應[18]?；罨腗2型巨噬細胞能夠分泌大量的抗炎因子如IL-10等,下調(diào)M1型啟動的免疫應答，在炎性反應中發(fā)揮修復作用[19-20]。噪聲暴露后耳蝸毛細胞通過兩種方式死亡，即凋亡和壞死。凋亡細胞死亡后被吞噬細胞清除，不造成炎性反應。壞死細胞死亡后，細胞內(nèi)溶酶體膜破裂，釋放大量溶酶體內(nèi)的水解酶，造成周圍細胞的次級損傷。組織巨噬細胞在耳蝸損傷早期階段可能發(fā)揮促進炎癥反應的作用，在耳蝸損傷晚期階段參與組織的修復過程，其具體功能有待于進一步研究揭示。

總之，免疫應答是耳蝸對各種損傷的一種重要反應。作為耳蝸免疫系統(tǒng)的一個重要參與者，耳蝸基底膜組織巨噬細胞存在于耳蝸基底膜鼓階側(cè)面。巨噬細胞是耳蝸基底膜組織主要的免疫細胞，在生理條件下巨噬細胞分布于整個耳蝸基底膜。這些細胞在耳蝸基底膜的頂回和底回呈現(xiàn)不同的形態(tài)。噪聲暴露后單核細胞滲入耳蝸基底膜轉(zhuǎn)化為巨噬細胞。單核細胞侵潤和轉(zhuǎn)化的時間、主要部位及細胞數(shù)量的變化，提示免疫細胞在噪聲暴露后耳蝸的損傷和修復中起到重要的作用。

1 Yang SZ, Cai QF, Vethanayagam RR, et al. Immune Defense Is thePrimary Function Associated With the Differentially Expressed,2016,333:283-294.

2 Hu BH, Zhang C, Frye MD. Immune Cells and Non-Immune CellsWith Immune Function in Mammalian Cochleae. Hear Res.2017.12.009.

3 胡博華.噪聲性耳聾:基礎研究進展和展望[J].中華耳科學雜志.2016,14(6):693-700.Hu BH.Noise-Induced Hearing Loss:A Review of Recent Ad?vances[J].Chinese Journal of Otology,2016,14(6):693-700.

4 Kalinec GM,Lomberk G,Urrutia RA,et al.Resolution of Cochle?ar In for mmation:Novel Target for Preventing or Ameliorating Drug-,Noise-and Age-Related Hearing Loss.Front Cell Neuro?sci,2017,11:192.doi:10.3389/fncel.2017.00192.e Collection 2017.

5 Vethanayagam RR,Yang W,Dong Y,et al.Toll-Like Receptor 4 Modulates the Cochlear Immune Response to Acoustic Injury.CellDeath Dis,2016,7(6):e2245.doi:10.1038/cddis.2016.156.

6 Du X,Choi CH,Chen K,et al.Reduced Formation of Oxidative Stress Biomarkers and Migration of Mononuclear Phagocytes in the Cochleae of Chinchilla After Antioxidant Treatment in Acute Acoustic Trauma.International Journal of Otolaryngology,2011,2011:612-690.

7 Cai Q, Vethanayagam RR, Yang S, et al. Molecular Profile of Co?chlear Immunity in the R,2014,11(1)173-194.

8 Hirose K,Rutherford MA,WarcholME.Two Cell Population Par?ticipate in Clearance of Damaged Hair Cells From the Sensory Ep?itheliaof the Inner Ear.Hear Res,2017,352:70-81.

9 Hirose K,Discolo CM,Keasler JR,et al.Mononuclear Phagocytes Migrate Into the Murine Cochlea After Acoustic Trauma.JComp Neurol,2005,489(2):180-194.

10 Okano T,Nakagawa T,Kita T,et al.Bone Marrow-Derived Cells Expressing Iba1 Are Constitutively Present as Resident Tissue Macrophages in the Mouse Cochlea.JNeurosci Res,2008,86(8):1758-1767.

11 Tornabene SV,Sato K,Pham L,et al.Immune Cell Recruitment Following Acoustic Trauma.Hear Res,2006,222(1-2):115-124.

12 Shi X.Resident Macrophages in the Cochlear Blood-Labyrinth Barrier and Their Renewal via Migration of Bone-Marrow-De?rived Cells.Celland Tissue Research,2010,342(1):21-30.

13 Frye MD,YangW,Zhang C,et al.Dynamic Activation of Basilar Membrane Macrophages in Response to Chronic Sensory Cell De?generation in Aging Mouse Cochleae.Hear Res,2017,344:125-134.

14 Wakabayashi K,Fujioka M,Kanzaki S,et al.Blockade of Interleu?kin-6 Signaling Suppressed Cochlear Inflammatory Response and Improved Hearing Impairment in Noise-Damaged Mice Cochlea.Neuroscience Research,2010,66(4):345-352.

15 楊衛(wèi)平，于黎明，胡吟燕，等.脈沖噪聲暴露后早期大鼠耳蝸外毛細胞死亡時程觀察[J].解放軍醫(yī)學雜志.2006,31(6):543-544.YangWP，Yu LM，Hu YY,et al.Time Sequential Analysis of the Death of Rats Cochlear Outer Hair Cells at the Early Stage After Exposure to Impulse Noise[J].Med JChin PLA,2006,31(6):543-544.

16 Harris JP,Fukuda S,Keithley EM.Spiral Modiolar Vein:Its Im?portance in Inner Ear Inflammation.Acta Otolaryngol,1990,110(5-6):357-365.

17 Yang W,Vethanayagam RR,Dong Y,et al.Activation of the Anti?gen Presentation Function of Mononuclear Phagocyte Populations Associated With the Basilar Membrane of the Cochlea After Acoustic Overstimulation.Neuroscience,2015,303:1-15.

18 Hirayama D,Lida T,Nakase H.The Phagocytic Function of Mac?rophage-Enforcing Innate Immunity and Tissue Homeostasis.Int JMolSci,2017,19(1).pii:E92.doi:10.3390/ijms19010092.

19 Wood MB,Zuo J.The Contribution of Immune Infiltrates to Oto?toxicity and Cochlear Hair Cell Loss.FrontCellNeurosci,2017,11:106.doi:10.3389/fncel.2017.00106.eCollection 2017.

20 Li YW,Zhang C,Sheng QJ,et al.Mesenchymal Stem Cells Res?cue Acute Hepatic Failure by Polarizing M2 Macrophages.World JGastroenterol,2017,23(45):7978-7988.