李京霞，夏　惠，2，呂秀蘭，2，王　進(jìn)，2，梁　東，2，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，四川 成都 611130； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 果蔬研究所，四川 成都 611130)

抗壞血酸(ascorbic acid，AsA)又名維生素C(vitamin C，Vc)，是生物體內(nèi)重要的抗氧化劑和許多酶的輔因子。AsA不僅在植物生長發(fā)育及抗逆過程中具有重要作用[1]，且與人類的健康密切相關(guān)。因此，研究AsA在植物中的代謝調(diào)控機(jī)制具有重要意義。植物體內(nèi)AsA代謝涉及自身合成、運(yùn)輸、循環(huán)和降解等幾個(gè)方面。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，無論是高AsA含量的獼猴桃(Actinidia)[2-4]或刺梨(Rosaroxburghii)[5]等，還是低AsA含量的蘋果(Malusdomestics)[6]和番茄(Lycopersiconesculentum)[7]等，自身合成是植物體內(nèi)AsA含量的決定因子，而且還發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)植物都是通過L-半乳糖合成AsA，其他幾種途徑(L-古洛糖途徑、D-半乳糖醛酸途徑和肌醇途徑)可能只在一些植物中發(fā)揮輔助作用[8-9]。

L-半乳糖途徑是植物合成AsA最重要的途徑，也是目前研究的最為透徹的途徑。該途徑中涉及的所有基因也已在多種植物中獲得，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)[10]、蘋果[4]、刺梨[5]、獼猴桃[4]、柑橘(Citrus)[11]、番茄[12]、藍(lán)莓(Vacciniumcorymbosum)[13]和棗(Ziziphusjujuba)[14]等。隨著植物體內(nèi)AsA的合成途徑及相關(guān)基因的鑒定和功能驗(yàn)證，目前關(guān)于AsA研究的熱點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)锳sA在植物體內(nèi)合成的調(diào)控機(jī)制方面，即研究有哪些因子可以調(diào)控L-半乳糖途徑，及其通過何種方式進(jìn)行調(diào)控。

一些研究表明，F(xiàn)-box類蛋白往往可以作為SCF(Skp1-Cullin-F-box)類E3泛素連接酶復(fù)合體的一部分，通過泛素化調(diào)控下游靶基因的表達(dá)[15-16]。2009年，Zhang等[17]從擬南芥臭氧敏感型突變體中克隆得到AMR1(ascorbic acid mannose pathway regulator 1)基因，功能位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的氨基酸N端和C端分別有F-box功能域和由48個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的DUF295功能域。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，AMR1基因的表達(dá)在擬南芥中能夠抑制L-半乳糖合成途徑中GME(GDP-D-mannose-3'，5'-epimerase)、GMP(GDP-D-mannose pyrophosphorylase)、GGP(GDP-L-galactose phosphorylase)和GPP(L-galactose-1-phosphate phosphatase)等基因的轉(zhuǎn)錄，負(fù)調(diào)控AsA的合成。且AMR1的表達(dá)受環(huán)境因子和植物自身?xiàng)l件的影響，在脅迫條件下或一些衰老組織中表達(dá)水平升高，這與AsA含量呈負(fù)相關(guān)。以上研究表明，擬南芥AMR1可能作為SCF復(fù)合物的一部分，通過泛素化調(diào)控AsA的合成，但其具體的作用機(jī)制目前還不清楚。

甜櫻桃被譽(yù)為“早春第一果”，經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高，在我國很多溫帶地區(qū)都有種植。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，AsA在甜櫻桃果實(shí)生長過程中的含量變化明顯，而不同生長階段葉片中的AsA含量差異也很顯著，這些特性為我們研究AsA調(diào)控機(jī)制提供了很好的材料。為了研究甜櫻桃AsA生物合成調(diào)控機(jī)制，本研究擬通過從甜櫻桃中克隆出PacAMR1基因，并檢測(cè)該基因在果實(shí)生長期和不同發(fā)育時(shí)期葉片中的表達(dá)模式，分析PacAMR1表達(dá)與抗壞血酸含量變化的相關(guān)性。研究結(jié)果將為更深入地認(rèn)識(shí)植物AsA合成的調(diào)控機(jī)制和通過生物技術(shù)手段改良植物AsA水平奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　植物材料

以甜櫻桃品種佐藤錦(Prunusaviumcv. Satonishiki)為實(shí)驗(yàn)材料，供試樣品均采自四川雅安市漢源縣九襄甜櫻桃示范園。于2016年3—6月，在謝花后0、10、20、30、40和50 d分別取正常發(fā)育的果實(shí)。在果實(shí)成熟時(shí)，選取樹冠外圍當(dāng)年生枝，分別選取枝條頂端、中部和基部葉片作為幼葉、成熟葉和老葉。所有樣品迅速用液氮速凍，放超低溫保存待用。

1.2　果實(shí)總RNA提取

采用改良的CTAB法提取RNA[18]，并測(cè)定核酸濃度及質(zhì)量，存于-80 ℃冰箱備用。

1.3　甜櫻桃AMR1基因全長的獲得

根據(jù)GenBank中其他植物(詳見圖3)AMR1基因氨基酸序列和項(xiàng)目組前期對(duì)甜櫻桃轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)甜櫻桃AMR1全長引物(表1)。

按照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA第一鏈后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PCR反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，變性到延伸35個(gè)循環(huán)；接著72 ℃ 10 min，最后保存于4 ℃。參照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行操作，回收和純化目的DNA片段，連接到pMD 19-T vector上，重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行克隆、測(cè)序。利用DNAMAN 軟件將所得的片段拼接，得到PacAMR1全長cDNA序列。

1.4　甜櫻桃AMR1的相關(guān)生物信息學(xué)分析

根據(jù)所測(cè)得的核苷酸序列，利用DNAStar軟件分析其序列，并在ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)上找出其開放閱讀框；利用EMBL(https://www.embl.org)分析氨基酸的保守功能域。從GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中挑選來源于不同植物的AMR1氨基酸序列，用Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性比對(duì)，用MEGA5.0軟件進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.5　甜櫻桃AMR1的表達(dá)分析

根據(jù)克隆得到的目的基因AMR1基因序列，用Primer Express 3.0 軟件設(shè)計(jì)定量表達(dá)分析所需的引物序列(表1)。分別提取不同樣品的總RNA，使用DNase Ⅰ處理后，利用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa)在熒光定量PCR儀上進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。Real-time PCR反應(yīng)體系：SYBR Green qPCR SuperMix 10 μL，上游引物 0.8 μL，下游引物0.8 μL，cDNA模板1.5 μL，ddH2O 6.9 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s；60 ℃ 31 s；72 ℃ 20 s；熔解曲線反應(yīng)。共40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增采用BIO-RAD公司iQ5TM型實(shí)時(shí)定量 PCR儀進(jìn)行，利用 iO5TMReal-Time PCR Detection System 進(jìn)行基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔct法，重復(fù)3次。

表1本研究所用引物

Table1Primers used in this study

引物名稱Primer引物核苷酸序列Nucleotideofsequences引物用途UsageofprimersPacAMR1-S5'-CCACTCTGCCAAGTCAGTCA-3'基因克隆GenecloningPacAMR1-A5'-GGGATTGGATTTTTCCACCT-3'基因克隆GenecloningPacAMR-REAL-S25'-CCACTCTGCCAAGTCAGTCA-3'基因表達(dá)GeneexpressionPacAMR-REAL-A25'-TCGTCAGCCATAGCTCCTTT-3'基因表達(dá)Geneexpression

1.6　甜櫻桃果實(shí)不同時(shí)期AsA含量的測(cè)定

冷凍組織2.0 g以提取AsA[5]。HPLC法測(cè)定AsA，使用帶有VWD檢測(cè)器和SB-Zobax C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)的Agilent 1260型高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)量。流動(dòng)相為15%甲醇和pH為2.5的85%偏磷酸水溶液組成。流速1 mL·min-1，進(jìn)樣體積10 μL，柱溫度35 ℃，檢測(cè)波長243 nm。

2　結(jié)果與分析

2.1　PacAMR1基因全長cDNA的獲得及序列分析

以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，利用特異引物PacAMR1-S和PacAMR1-A進(jìn)行基因完整編碼區(qū)的擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，在1 300 bp左右有單一明亮的條帶，與預(yù)測(cè)片段大小相符(圖1)。對(duì)該片段進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞以及陽性克隆的篩選，送成都擎科生物公司測(cè)序。測(cè)序正確的序列命名為PacAMR1。

圖1　甜櫻桃PacAMR1 cDNA全長RT-PCR擴(kuò)增Fig.1　PCR amplification of full-length cDNA of PacAMR1 in sweet cherry

利用EditSeq軟件分析測(cè)序結(jié)果表明，克隆獲得PacAMR1基因cDNA全長為1 327 bp，該基因完整開放閱讀框?yàn)? 206 bp(圖2)，位于23～1 228 bp，編碼401個(gè)氨基酸，分子量為25.78 ku，等電點(diǎn)為7.144，帶正電荷殘基總數(shù)45，帶負(fù)電荷殘基總數(shù)46，屬于穩(wěn)定類蛋白。在氨基酸N端和C端分別有F-box和DUF295功能域(圖2)，與擬南芥同源基因AMR1有相似的結(jié)構(gòu)域。

NCBI Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和DNAMAN的分析結(jié)果表明，PacAMR1編碼的氨基酸與甜櫻桃(Prunusavium，XP_021819517.1)、梅(Prunusmume，XP_016651609.1)、桃(Prunuspersica，XP_020424646.1)、白梨(Pyrusbretschneideri，XP_009337088.1)和蘋果(Malusdomestica，XP_008337956.1)的AMR1蛋白序列同源性分別為99%、97%、96%、77%和77%，表明PacAMR1與其他植物的AMR1氨基酸序列具有較大的相似性(圖3)。

ATG，起始密碼子; *，終止密碼子。被框住的區(qū)域分別為F-box和DUF295功能域。ATG, Initiation codon; *, Termination codon. Boxed area was F-box and DUF295 domain.圖2　PacAMR1基因序列及推測(cè)的氨基酸序列Fig.2　Full-length cDNA and its protein sequence of PacAMR1

Ⅰ～Ⅵ依次為甜櫻桃Prunus avium AMR1，桃Prunus persica XP_020424646.1，梅Prunus mume XP_016651609.1，甜櫻桃Prunus avium XP_021819517.1，白梨Pyrus bretschneideri XP_009337088.1，蘋果Malus domestica XP_008337956.1。Ⅰ-Ⅵ represented sweet cherry Prunus avium AMR1, peach Prunus persica XP_020424646.1, plum blossom Prunus mume XP_016651609.1, sweet cherry Prunus avium XP_021819517.1, pear Pyrus bretschneideri XP_009337088.1, apple Malus domestica XP_008337956.1, respectively.圖3　PacAMR1基因編碼的氨基酸序列與其他相關(guān)序列的多重對(duì)比Fig.3　Alignment of multiple sequences of PacAMR1 protein amino acid sequence with that of other plants

選擇GenBank 中其他7種植物的AMR1氨基酸序列與PacAMR1對(duì)比分析后，使用MEGA5.0軟件中的NJ法(Neighbor-Joining)制作進(jìn)化樹(圖4)。從進(jìn)化樹中可以看出，甜櫻桃與桃樹、梅聚為一類。

2.2　PacAMR1基因在甜櫻桃果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)及AsA含量的測(cè)定

由圖5-A可以看出，在果實(shí)開始生長發(fā)育到花后第10天時(shí)，PacAMR1基因表達(dá)量下降，大約下降1倍左右；第10～30天，PacAMR1基因表達(dá)量緩慢上升；第30天的表達(dá)量約為10 d的3倍；第30～40天，PacAMR1基因表達(dá)量迅速上升并達(dá)到峰值，為第10天的7倍左右；從果實(shí)生長第40天以后，PacAMR1基因表達(dá)量下降。從整體趨勢(shì)看，隨著果實(shí)發(fā)育成熟，PacAMR1基因的表達(dá)量是逐漸上升的。在第10天時(shí)，PacAMR1基因的表達(dá)量最低，之后甜櫻桃果實(shí)在發(fā)育第40天時(shí)其表達(dá)量達(dá)到最大。

使用高效液相色譜法測(cè)定甜櫻桃果實(shí)成熟過程中AsA含量變化，由圖5-B可以看出，在果實(shí)開始生長發(fā)育到第10天時(shí)，AsA含量上升到峰值；第10～20天，AsA含量迅速下降到最低值；第20～50天，AsA含量緩慢上升；但上升到第50天時(shí)，其AsA含量也要比第0天低。從整體趨勢(shì)看，隨著果實(shí)發(fā)育成熟AsA含量是下降的。在果實(shí)第10天時(shí)，AsA含量最高。

圖4　不同植物PacAMR1基因編碼的氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化Fig.4　Phylogenetic evolution of amino acid sequences encoded by different plant PacAMR1

圖5　甜櫻桃果實(shí)發(fā)育過程PacAMR1基因表達(dá)量(A)及ASA含量(B)變化Fig.5　PacAMR1 gene expression (A) and ascorbic acid content (B) during fruit development of sweet cherry

2.3　PacAMR1基因在不同發(fā)育時(shí)期葉片的表達(dá)及AsA含量的測(cè)定

由圖6-A發(fā)現(xiàn)，在幼葉期，PacAMR1基因的表達(dá)量最低，從幼葉到成熟葉，PacAMR1基因的表達(dá)量緩慢上升，且表達(dá)量上升地較少，從成熟葉到老葉，PacAMR1基因的表達(dá)量迅速上升，且達(dá)到峰值。從整體上看，隨著葉片的生長PacAMR1基因的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。

使用高效液相色譜法測(cè)定不同葉齡中AsA含量變化，由圖6-B可以看出，幼葉的AsA含量最高，從幼葉到成熟葉，AsA含量緩慢下降，且下降的數(shù)量較少，從成熟葉到老葉，AsA含量快速下降，在老葉中AsA含量最低。整體上看，隨著葉片的生長發(fā)育，AsA含量呈下降趨勢(shì)變化。

圖6　甜櫻桃不同葉齡PacAMR1基因表達(dá)量(A)及AsA含量(B)變化Fig.6　PacAMR1 gene expression (A) and ascorbic acid content (B) in different leaf development stages of sweet cherry

3　討論

目前為止，抗壞血酸生物合成的代謝通路已經(jīng)有明確結(jié)論[8-10]，但對(duì)這些合成途徑的調(diào)控機(jī)制尚不明確，所以研究抗壞血酸合成調(diào)控機(jī)制具有重要意義。本研究從甜櫻桃果實(shí)中克隆出一條AMR1基因，通過對(duì)其核苷酸和推測(cè)的蛋白質(zhì)序列的分析發(fā)現(xiàn)，PacAMR1基因cDNA全長為1 327 bp，在位于23～1 228 bp有完整開放閱讀框，長度為1 206 bp，編碼401個(gè)氨基酸，且PacAMR1與其他植物的AMR1基因具有很高的同源性(圖3、圖4)，表明我們從佐藤錦甜櫻桃中獲得了AMR1基因。

氨基酸序列分析的結(jié)果表明，在PacAMR1編碼的蛋白質(zhì)序列的N端和C端分別具有F-box和DUF295功能域(圖2)。以前的研究表明，具有F-box功能域是F-box類蛋白家族的典型特征[19-21]，這說明本研究獲得的PacAMR1屬于F-box類蛋白。F-box類蛋白是SCF類E3泛素連接酶復(fù)合物的一部分，通常通過泛素化對(duì)下游目標(biāo)蛋白進(jìn)行調(diào)控，而通過泛素化降解目標(biāo)蛋白是包括開花、生物節(jié)律、根系發(fā)育和光信號(hào)感受在內(nèi)的多個(gè)生物學(xué)進(jìn)程的重要調(diào)控機(jī)制[19-21]。這些結(jié)果也暗示著PacAMR1在甜櫻桃的各種生理進(jìn)程中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控功能。

Zhang等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中AMR1的表達(dá)與GME、GMP、GGP和GPP基因的表達(dá)和AsA的含量呈相反的趨勢(shì)。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)隨著果實(shí)發(fā)育成熟，PacAMR1基因的表達(dá)量是逐漸上升的，而AsA含量是下降的(圖5)。PacAMR1的表達(dá)在幼葉中最低，在老葉中最高，但幼葉中的AsA含量最高，老葉中ASA含量最低。這些結(jié)果表明，PacAMR1的表達(dá)與AsA含量呈負(fù)相關(guān)，PacAMR1可能通過某種機(jī)制反向調(diào)控甜櫻桃中AsA的生物合成。本課題組以前對(duì)甜櫻桃果實(shí)生長過程L-半乳糖途徑相關(guān)基因表達(dá)模式有過研究[22]，對(duì)比這些基因的表達(dá)模式與本文中PacAMR1表達(dá)模式，我們也發(fā)現(xiàn)在果實(shí)生長過程中PacAMR1的表達(dá)與L-半乳糖途徑中的GME、GMP、GGP和GPP等的表達(dá)呈相反趨勢(shì)。綜合這些發(fā)現(xiàn)，我們更進(jìn)一步地認(rèn)為PacAMR1可能作為泛素化體的一部分，通過泛素化影響L-半乳糖途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)控植物體中AsA的生物合成，但這些還需要進(jìn)一步的互作和轉(zhuǎn)基因等實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

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