白　琪，魯艷輝，鄭許松，呂仲賢，*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華321004；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，省部共建浙江省植物有害生物防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州310021)

細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP)作為最古老和最龐大的超基因家族，是由數(shù)量眾多、功能復(fù)雜的一類血紅蛋白酶基因組成，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物等生物體內(nèi)，其酶系是昆蟲中涉及抗藥性的三大主要代謝解毒酶類之一。細(xì)胞色素P450在昆蟲的生命過程中有多種功能，主要包括參與殺蟲劑和植物次生物質(zhì)的代謝以及蛻皮激素、保幼激素、性信息素的合成，與昆蟲的生長、發(fā)育以及防御密切相關(guān)[1]。細(xì)胞色素P450在昆蟲中多存在于中腸、脂肪體和馬氏管中[2]，昆蟲通過集中于中腸的解毒酶系統(tǒng)對(duì)攝入的有毒物質(zhì)(包括植物次生物質(zhì))快速代謝，而脂肪體有利于代謝經(jīng)表皮或氣管進(jìn)入體內(nèi)的有毒物質(zhì)[3]。已發(fā)現(xiàn)的昆蟲P450基因分屬于CYP4、CYP6、CYP9、CYP12、CYP18、CYP28、CYP49、CYP300s和CYP400s家族[4]。近來，由于昆蟲基因組序列可用性增加，越來越多的昆蟲細(xì)胞色素P450基因被鑒定出來[5-6]。有研究表明，昆蟲CYP4基因參與代謝外源化合物和形成殺蟲劑抗藥性，且在脂類物質(zhì)代謝中起重要作用[7]。

二化螟(Chilosuppressalis)是我國乃至其他亞洲國家水稻產(chǎn)區(qū)的一種重要蛀桿害蟲，為害可造成稻株枯鞘、枯心和白穗，嚴(yán)重影響水稻的質(zhì)量和產(chǎn)量[8-9]。當(dāng)前我國水稻二化螟防治主要仍以化學(xué)防治為主，但長期不合理使用化學(xué)農(nóng)藥，造成了稻田系統(tǒng)害蟲天敵殺傷、生物多樣性下降、害蟲抗藥性快速增加，進(jìn)而導(dǎo)致稻田生態(tài)系統(tǒng)自然控制功能減弱，病蟲害發(fā)生頻繁，由此形成惡性循環(huán)。因此，探索更安全有效的二化螟生物防治新方法及其機(jī)制對(duì)促進(jìn)水稻的可持續(xù)生產(chǎn)具有重要意義。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并驗(yàn)證獲得二化螟的兩種細(xì)胞色素P450基因CsCYP4M38和CsCYP4M39，在此基礎(chǔ)上分析這兩種基因的時(shí)空表達(dá)譜，為進(jìn)一步從分子水平研究二化螟細(xì)胞色素P450基因功能提供基礎(chǔ)，以期為二化螟的綜合防治提供新思路。

1　材料與方法

1.1　供試?yán)ハx

二化螟種群于2015年3月采自浙江省金華市郊(29°04′N，119°38′E)，置于人工氣候室飼養(yǎng)并維持種群，溫度(26±1)℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期14 h∶10 h。幼蟲采用人工飼料飼養(yǎng)[10]，羽化后的成蟲以10%的蜂蜜水補(bǔ)充營養(yǎng)。

1.2　實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定CsCYP4M38和CsCYP4M39基因的表達(dá)

不同發(fā)育階段樣本：收集不同發(fā)育階段的健康且大小一致的二化螟樣本，包括卵(約500粒卵)，1-6齡幼蟲(蛻皮后第1天的幼蟲，饑餓3 h)，第1天的蛹，雌雄成蟲(第1天羽化的成蟲)。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

不同組織樣本：收集二化螟3齡幼蟲，饑餓3 h后在預(yù)冷的pH 7.2的PBS緩沖液中解剖，收集頭、中腸、脂肪體和表皮4部分組織，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭。

總RNA提?。豪肨rizol試劑(Invitrogen)提取所有樣本總RNA，具體步驟參照Trizol試劑說明書。取1 μL RNA樣品測(cè)定D260/D280(Nanodrop 2000)，比值介于1.8～2.2的樣品用于cDNA合成。

cDNA合成：取3.0 μg 總RNA，利用Oligo dT進(jìn)行cDNA合成，操作步驟參照Thermo Fisher反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書。cDNA置于-20 ℃保存以供real-time PCR使用。

將所有樣本按照上述步驟提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以二化螟β-tubulin基因(GenBank登錄號(hào)：EU429675)為內(nèi)參基因，分別對(duì)CsCYP4M38基因和CsCYP4M39基因mRNA表達(dá)量進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系20 μL: SYBR(Bio-Rad)10 μL，上下游引物各1 μL(表1)，cDNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，制作熔解曲線，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。每個(gè)樣本2個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.3　數(shù)據(jù)分析

序列同源性比對(duì)利用ClustalW軟件(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)完成。利用Mega 6.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。Real-time PCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT方法處理，差異顯著性采用DPS軟件分析(P≤0.05)。

2　結(jié)果與分析

2.1　二化螟與其他昆蟲P450基因的同源性分析

利用ClustalW軟件將二化螟CsCYP4M38、CsCYP4M39基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中注冊(cè)的部分昆蟲的P450基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明，CsCYP4M38與其他昆蟲的P450基因的氨基酸序列一致性在52.88%～56.86%，其中與煙草天蛾ManducasextaMsCYP4M2氨基酸序列同源性最高，CsCYP4M39與其他昆蟲的P450基因的氨基酸序列一致性在53.78%～59.96%，其中與煙草天蛾MsCYP4M1氨基酸序列同源性最高(表1)。

2.2　部分昆蟲P450基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

采用Mega 6.0軟件對(duì)二化螟CsCYP4M38、CsCYP4M39基因及NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中注冊(cè)的部分昆蟲P450基因的氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)，進(jìn)化樹顯示兩個(gè)大的分支，第一個(gè)大的分支中包括CYP6家族和CYP9家族，第二個(gè)大的分支為CYP4家族。從進(jìn)化樹上可以看出，CsCYP4M38與CsCYP4M39屬于CYP4家族，且分別與MsCYP4M2和MsCYP4M1進(jìn)化距離較近，聚類正確。

2.3　CsCYP4M38和CsCYP4M39在二化螟不同發(fā)育歷期表達(dá)分析

表1二化螟CsCYP4M38和CsCYP4M39氨基酸序列與8種昆蟲P450基因氨基酸序列的同源性比較

Table1Percent identities of amino acid residues amongCsCYP4M38，CsCYP4M39 ofChilosuppressalisand P450 of other eight insects

基因名稱GeneNameBmCYP4M5BmCYP4M9MsCYP4M1MsCYP4M2HzCYP4M6HzCYP4M7CmCYP4M25CsCYP4M38CsCYP4M39MbCYP4M61.0354.6762.4352.4968.4664.7456.5752.8853.78BmCYP4M5—53.2867.4055.0763.6760.5657.5754.8754.58BmCYP4M9—57.7461.8355.0953.9853.9854.8555.78MsCYP4M1—55.0762.8761.5561.1654.3759.96MsCYP4M2—53.6952.3953.1956.8653.98HzCYP4M6—65.4757.2956.2956.49HzCYP4M7—56.5756.3753.98CmCYP4M25—55.7854.98CsCYP4M38—54.18

MbCYP4M，甘藍(lán)夜蛾Mamestrabrassicae， KX008607；BmCYP4M5，家蠶Bombyxmori， EF528484；BmCYP4M9，家蠶Bombyxmori， EF017796；MsCYP4M2，煙草天蛾Manducasexta， L38671；MsCYP4M1，煙草天蛾Manducasexta， GU731525；HzCYP4M6，美洲棉鈴蟲Helicoverpazea， AY113687；HzCYP4M7，美洲棉鈴蟲Helicoverpazea， AY113688；CmCYP4M25，稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis， KP001139;CsCYP4M38，二化螟Chilosuppressalis， KF701163；CsCYP4M39，二化螟Chilosuppressalis， KF701164。

Bm， 家蠶Bombyx mori， BmCYP9A21 (EF415298)， BmCYP9A19 (EF488994)， BmCYP9A22 (EF491004)， BmCYP6AB5 (EF570076)， BmCYP4M5 (EF528484)， BmCYP4M9 (EF017796)， BmCYP6A8 (GQ241737); Ha， 棉鈴蟲Helicoverpa armigera， HaCYP6B7 (HM042304)， HaCYP9Ax(JX486677); Cm， 稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis， CmCYP4G112 (KP001142)， CmCYP4M25 (KP001139); Dm， 黑腹果蠅Drosophila melanogaster， DmCYP6A8 (AF387659)， DmCYP6A2 (U78088); Pc， 加拿大虎紋鳳蝶Papilio Canadensis， PcCYP6B25 (AF278603); Ag， 棉蚜Aphis gossypii， AgCYP6A14 (KR028424)， AgCYP6A13 (KR028423)， AgCYP6A2 (KR028422); Ms， 煙草天蛾 Manduca sexta， MsCYP4M2 (L38671)， MsCYP4M1 (GU731525); Cq， 致倦庫蚊Culex quinquefasciatus， CqCYP9M10 (AB332027)， CqCYP6BB3 (AB334749)， CqCYP6M12 (AB334748)， CqCYP6Z10 (AB334747); Md， 家蠅Musca domestica， MdCYP6A37 (DQ642010)， MdCYP6A36 (DQ642009)， MdCYP6D1 (U15168); Mb， 甘藍(lán)夜蛾Mamestra brassicae， MbCYP4M(KX008607)， MbCYP9A(KR676343); Hz， 美洲棉鈴蟲Helicoverpa zea， HzCYP4M6 (AY113687)， HzCYP4M7 (AY113688); Pg， 北美黑條黃鳳蝶Papilio glaucus， PgCYP6B4 (U47059); Cs， 二化螟Chilo suppressalis， CsCYP4M38 (KF701163)， CsCYP4M39 (KF701164)。圖1　二化螟CsCYP4M38、CsCYP4M39與其他昆蟲已知P450的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1　Phylogenetic analysis of CsCYP4M38， CsCYP4M39 and P450 gene sequences from some insect species

CsCYP4M38基因和CsCYP4M39基因在二化螟不同發(fā)育歷期的表達(dá)量測(cè)定結(jié)果表明，兩種基因在二化螟不同發(fā)育歷期均有表達(dá)，但是表達(dá)水平隨著二化螟發(fā)育歷期的變化而變化。CsCYP4M38基因表達(dá)量由高到低依次為5齡幼蟲、2齡幼蟲、雌成蟲、蛹、3齡幼蟲、4齡幼蟲、6齡幼蟲、雄成蟲、卵、1齡幼蟲；且在5齡幼蟲、2齡幼蟲及雌成蟲中的表達(dá)水平顯著高于其他發(fā)育歷期；3齡幼蟲、4齡幼蟲及蛹中的表達(dá)水平顯著高于1齡幼蟲中的表達(dá)水平；卵、1齡幼蟲、6齡幼蟲及雄成蟲中的表達(dá)水平無明顯差異。CsCYP4M39基因表達(dá)量由高到低依次為4齡幼蟲、3齡幼蟲、5齡幼蟲、6齡幼蟲、2齡幼蟲、1齡幼蟲、雌成蟲、蛹、卵、雄成蟲，表達(dá)量隨齡期增加基本呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)；4齡幼蟲內(nèi)表達(dá)水平達(dá)到最高；在3～6齡幼蟲中表達(dá)量顯著高于卵及雄成蟲中的表達(dá)量；卵、1齡幼蟲、2齡幼蟲、蛹及雌雄成蟲中的表達(dá)水平無明顯差異(圖2)。

2.4　兩種P450基因不同組織表達(dá)分析

CsCYP4M38基因和CsCYP4M39基因在二化螟不同組織的表達(dá)量測(cè)定結(jié)果表明，兩種基因在測(cè)定的4個(gè)組織中均有表達(dá)。CsCYP4M38基因表達(dá)量高低依次為脂肪體、表皮、中腸、頭。CsCYP4M39基因表達(dá)量高低依次為脂肪體、中腸、表皮、頭。兩種基因在脂肪體內(nèi)的表達(dá)水平均顯著高于其他組織中的表達(dá)水平(圖3)。

3　討論

當(dāng)前對(duì)昆蟲細(xì)胞色素P450的研究主要集中在兩個(gè)方面，一是P450對(duì)體內(nèi)激素(包括保幼激素、蛻皮激素和信息素)等內(nèi)源物質(zhì)的合成與代謝；二是P450對(duì)外源有毒物質(zhì)(如殺蟲劑、植物的有毒物質(zhì))的代謝或激活[11]。如已證明至少6種P450(CYP302A1、CYP306A1、CYP307A1、CYP314A1、CYP315A1和CYP18A1)參與了果蠅(Drosophilamelanogaster)蛻皮激素的代謝，家蠶(Bombyxmori)CYP15C1在保幼激素的合成過程中起著重要作用[12]。細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的殺蟲劑抗藥性已在果蠅(D.melanogaster)、岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)、家蠅(Muscadomestica)、赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)、棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、褐飛虱(Nilaparvatalugens)、煙粉虱(Bemisiatabaci)等昆蟲中被普遍發(fā)現(xiàn)[13]。鑒于昆蟲細(xì)胞色素P450對(duì)昆蟲的生長發(fā)育具有重要作用，本文測(cè)定了二化螟兩種細(xì)胞色素P450基因的時(shí)空表達(dá)譜，以期為二化螟細(xì)胞色素P450的功能研究提供基礎(chǔ)。

卵，第5天的卵；一齡，第1天的1齡幼蟲；二齡，第1天的2齡幼蟲；三齡，第1天的3齡幼蟲；四齡，第1天的4齡幼蟲；五齡，第1天的5齡幼蟲；六齡，第1天的6齡幼蟲；蛹，第1天的蛹；雌蛾，第1天的雌成蟲；雄蛾，第1天的雄成蟲。數(shù)據(jù)處理以卵期CYP4M38和CYP4M39兩種基因的表達(dá)量為基準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)誤由3次生物學(xué)重復(fù)計(jì)算得出，柱上無相同字母表示在DPS的One-Way ANOVA-Fisher’s LSD方法檢驗(yàn)下差異顯著(P≤0.05)。Egg， 5-day-old egg; 1st， 1-day-old 1st instar larva; 2nd， 1-day-old 2nd instar larva; 3rd， 1-day-old 3rd instar larva; 4th， 1-day-old 4th instar larva; 5th， 1-day-old 5th instar larva; 6th， 1-day-old 6th instar larva; PP， 1-day-old pupa; FA， 1-day-old female adult; MA， 1-day-old male adult. All the data were calculated based on the expression level of CYP4M38 and CYP4M39 in the egg stage. Standard error bars were based on three replicates. Bars marked without the same letters indicated significant difference through One-Way ANOVA-Fisher’s LSD method of DPS software(P≤0.05).圖2　CsCYP4M38和CsCYP4M39基因在不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量Fig.2　Developmental expression patterns of CsCYP4M38 and CsCYP4M39 genes

頭、表皮、脂肪體、中腸分別代表3齡二化螟幼蟲的頭、表皮、脂肪體和中腸。每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)。柱上無相同字母的表示在 DPS One-Way ANOVA-Fisher’s LSD 方法檢驗(yàn)下差異顯著(P≤0.05)。HD， Head; ED， Epidermis; FB， Fat body; MG， Mid gut. Every treatment was replicated 3 times. Bars marked without the same letters indicated significant differences through DPS One-Way ANOVA-Fisher’s LSD test(P≤0.05).圖3　CYP4M38和CYP4M39基因在二化螟3齡幼蟲不同組織的表達(dá)Fig.3　Tissue-specific expressions of CYP4M38 and CYP4M39 genes in the 3rd instar larvae of Chilo suppressalis

序列同源性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CsCYP4M38氨基酸序列與煙草天蛾MsCYP4M2氨基酸序列同源性最高，序列一致性高達(dá)56.86%；CsCYP4M39氨基酸序列與煙草天蛾MsCYP4M1氨基酸序列同源性最高，序列一致性高達(dá)59.96%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，CsCYP4M38與CsCYP4M39屬于CYP4家族，且分別與MsCYP4M2和MsCYP4M1進(jìn)化距離較近，聚類正確。

細(xì)胞色素P450基因在昆蟲不同發(fā)育階段和組織器官中的表達(dá)存在差異性，使得這些基因的功能也不近相同[14]。有研究表明，黑森癭蚊(Mayetioladestructor)隨齡期的增加，其體內(nèi)CYP4D1基因表達(dá)也升高，6齡幼蟲表達(dá)量最高，在發(fā)育成蛹后其表達(dá)量迅速降低，在成蟲期又略有提高[15]。同樣，致倦庫蚊(Culexquinquefasciatus)中CYP4H34基因表達(dá)從卵期到幼蟲末期逐漸增加，在蛹期急劇下降，成蟲期表達(dá)量仍低[16]。二化螟CsCYP4M38和CsCYP4M39在不同發(fā)育階段表達(dá)模式不同，CsCYP4M38在幼蟲期的表達(dá)水平除1齡外均高于卵期及雄成蟲，雌成蟲內(nèi)的表達(dá)水平僅低于2齡及5齡，表達(dá)峰值出現(xiàn)在5齡；CsCYP4M39在幼蟲期的表達(dá)量均高于卵、蛹和成蟲期，且在幼蟲期表達(dá)量隨齡期增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，表達(dá)峰值出現(xiàn)在4齡。二化螟CsCYP4M39在蛹及成蟲期表達(dá)量較少，這與搖蚊(Chironomustentans)的CYP4G33基因表達(dá)模式相似[17]。二化螟CsCYP4M38和CsCYP4M39在不同發(fā)育階段的表達(dá)量變化，可能意味著昆蟲代謝外源性物質(zhì)的能力[18]，CsCYP4M38和CsCYP4M39的表達(dá)可能是二化螟發(fā)育各階段所必需的，推測(cè)其可能參與二化螟生長發(fā)育過程中細(xì)胞和機(jī)體的生理代謝過程。

此外，有些P450基因存在特異性表達(dá)，如來源于家蠅(M.domestica)的CYP6D1只在成蟲期表達(dá)，來源于棉鈴蟲(H.armigera)的CYP6B2只在幼蟲期表達(dá)[19]，甘藍(lán)夜蛾(Mamestrabrassicae)CYP4S4僅在觸角表達(dá)[20]。本研究中二化螟兩種P450基因CsCYP4M38和CsCYP4M39的時(shí)空表達(dá)譜分析表明，這兩種基因在二化螟所有測(cè)定的發(fā)育時(shí)期和組織中均有不同程度的表達(dá)，說明這兩種基因的表達(dá)均不具備發(fā)育階段特異性和組織特異性?；虻谋磉_(dá)與其功能存在著一定的關(guān)系，二化螟CsCYP4M38和CsCYP4M39兩種細(xì)胞色素P450基因均在脂肪體和中腸中的表達(dá)水平相對(duì)較高，這是因?yàn)樵诶ハx生長、發(fā)育和繁殖等過程中具有重要作用。如中腸是昆蟲進(jìn)行消化吸收的主要場(chǎng)所[21]，脂肪體可代謝糖類、脂類及蛋白質(zhì)，同時(shí)也是激素作用的靶標(biāo)組織[22]。

本研究通過對(duì)二化螟CsCYP4M38和CsCYP4M39兩種基因的時(shí)空表達(dá)譜進(jìn)行測(cè)定和分析發(fā)現(xiàn)，CsCYP4M38和CsCYP4M39在二化螟各發(fā)育階段及測(cè)定組織中均有表達(dá)，并且在脂肪體中表達(dá)量最高，這可能與脂肪體是參與昆蟲代謝的重要組織器官有關(guān)，這些結(jié)果提示CsCYP4M38和CsCYP4M39可能參與二化螟內(nèi)源和外源物質(zhì)的代謝作用。研究結(jié)果可為揭示二化螟細(xì)胞色素P450基因的分子功能和二化螟的有效防治提供科學(xué)依據(jù)。

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