吳曰福，顧愛星，王洪凱

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052； 2.浙江大學(xué) 生物技術(shù)研究所，浙江 杭州310058)

隨著社會的發(fā)展，人們面對的環(huán)境問題越發(fā)多樣，高鹽環(huán)境問題就是其中之一。利用微生物處理環(huán)境問題一直是生物技術(shù)的研究前沿，分離采集能夠適應(yīng)高鹽環(huán)境的微生物，可以為開發(fā)利用此類微生物打下基礎(chǔ)。嗜鹽耐鹽真菌是一類新型微生物資源，用途廣泛，在環(huán)境生物治理、食品工業(yè)，以及嗜鹽菌與耐鹽植物協(xié)同修復(fù)鹽堿土壤等方面極具應(yīng)用前景，日益受到關(guān)注。

嗜鹽耐鹽真菌的研究是從研究曬鹽場真菌多樣性開始的。在早期的研究中，嗜鹽真菌是指可以在3.0 mol·L-1(17.5%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)甚至更高的鹽濃度下生長，且可以在 1.7 mol·L-1(10%)鹽濃度下經(jīng)常被分離到的真菌；耐鹽真菌是指在 1.7 mol·L-1鹽濃度下只能零星分離到，但也能夠耐受 3.0 mol·L-1鹽濃度的真菌[1]。隨著研究的深入，研究者對耐鹽真菌的界定發(fā)生變化，傾向于認為可以適應(yīng)高鹽環(huán)境的真菌就是耐鹽真菌。Smolyanyuk等[2]認為，耐鹽真菌是指可以在超過0.5 mol·L-1鹽濃度下生長的真菌，測定時一般采用3%、5%、10%、15%、20%的濃度梯度測定真菌的嗜鹽耐鹽性。

過去，人們認為真菌并不能生長在高鹽濃度的環(huán)境中。自Gunde-Cimerman等[3]在曬鹽場首次發(fā)現(xiàn)嗜鹽耐鹽真核微生物后，對嗜鹽耐鹽真菌的研究迅速發(fā)展。李艷華[4]于2003年報道了在滄州鹽池發(fā)現(xiàn)的嗜鹽真菌新種，命名為嗜鹽鏈孢霉(Streptosporomyhalophilagen. nov. sp. nov)，該菌對NaCl的耐受范圍在5%～30%。2013年，代東梅[5]從青海湖土樣中共分離出36株嗜鹽耐鹽真菌，其中包括2個新種、1個新紀(jì)錄種。2014年，Min等[6]從韓國黑松木根系中分離出18株耐鹽真菌，多數(shù)屬于青霉屬(Penicilliumsp.)和木霉屬(Trichodermasp.)。近年來，能夠提供全系列礦化度的曬鹽場一直是研究嗜鹽耐鹽微生物的重要場所。迄今，已知的最嗜鹽的真菌是Wallemiaichthyophaga，該菌需要在至少含10%氯化鈉的環(huán)境才能生長，而且在飽和氯化鈉環(huán)境中也能夠生長[7]。嗜鹽耐鹽微生物因為具有獨特的滲透調(diào)節(jié)、三羧酸循環(huán)和糖酵解機制，因而能夠適應(yīng)極端環(huán)境[8-9]。

嗜鹽耐鹽真菌具有重要的研究價值和廣闊的應(yīng)用前景。研究證實，在高鹽環(huán)境生長的真菌Penicilliumsp.NICS01可以作為生物肥料和生物防治劑來改善植物生長，提高植物抵抗鹽脅迫和枯萎病病菌感染的能力[10]。此外，菌根真菌與植物的共生有助于協(xié)助寄主植物通過機體復(fù)雜的調(diào)節(jié)機制來抵抗高鹽環(huán)境[11]，如菌根真菌與植物根系形成的共生組織可顯著提高鹽堿脅迫下沙棗幼苗葉片葉綠素含量和光合作用，同時，菌根真菌具有較強的生長活力[12]。紅樹林在平衡高鹽環(huán)境的滲透壓作用中，嗜鹽微生物也起到了關(guān)鍵作用[13]。嗜鹽菌還可用于食品工業(yè)，主要用于食用添加劑的生產(chǎn)，目前已實現(xiàn)利用嗜鹽菌生產(chǎn)胡蘿卜素和類胡蘿卜素[14]。

堿蓬屬(Suaeda)植物廣泛分布于世界各地的鹽堿土地區(qū)，是一類典型的鹽生植物，屬于重要的鹽生植物資源[15]。堿蓬葉片肉質(zhì)化程度高，無泌鹽結(jié)構(gòu)，植株通過稀釋的方式避免體內(nèi)的高鹽分發(fā)生毒害，從而體現(xiàn)出較高的耐鹽性[16]。高鹽環(huán)境中生長的耐鹽植物組織中可能蘊藏著豐富的嗜鹽耐鹽真菌，但從鹽堿地上生長的耐鹽植物堿蓬根系分離嗜鹽耐鹽真菌的研究甚少。本研究分離并鑒定堿蓬根系組織中的嗜鹽耐鹽真菌，旨在為了解我國鹽堿地耐鹽植物根際嗜鹽耐真菌的多樣性，及其與耐鹽植物的互作，為此類真菌資源的開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

堿蓬(Suaeda)采自內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市五原縣復(fù)興鎮(zhèn)(海拔1 023.415 m，40.9512°N，東經(jīng)107.9710°E)。

PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基)：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂粉15.0 g，加水定容至1 000 mL，高壓滅菌。1.7 mol·L-1和3.0 mol·L-1NaCl鹽濃度的PDA培養(yǎng)基：在每1 000 mL PDA培養(yǎng)基中分別加入 99.45、175.5 g NaCl。

PCA培養(yǎng)基(馬鈴薯-胡蘿卜-瓊脂培養(yǎng)基)：馬鈴薯50.0 g，胡蘿卜50.0 g，瓊脂粉15.0 g，加水定容至1 000 mL，高壓滅菌。

1.2　真菌的分離與純化

取堿蓬根系，自來水洗凈后，用無菌水洗3遍。將根切成3 mm的小段，放置到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)一周。期間每天觀察，及時將長出的真菌挑到新的平板上進行純化。產(chǎn)孢后，進行單孢分離，保存在PDA斜面上。

1.3　抗鹽性檢測

將純化的菌株分別接種到1.7 mol·L-1和3.0 mol·L-1NaCl濃度的PDA培養(yǎng)基上，每種鹽濃度下各設(shè)3個重復(fù)，同時將每個菌株分別接種到不含NaCl的PDA培養(yǎng)基上作為對照。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察、記錄菌株的生長狀況。當(dāng)對照菌落快長到培養(yǎng)皿邊緣時，測量菌株的菌落直徑。依據(jù)Gunde-Cimerman等[1]對嗜鹽耐鹽真菌的定義，將在3 mol·L-1甚至更高的鹽濃度下分離到的真菌記錄為嗜鹽真菌，將在1.7 mol·L-1的鹽濃度下分離到的真菌記錄為耐鹽真菌。

鹽濃度抑制率(I)計算公式：

(1)

式(1)中dPDA與dPDA+NaCl分別為PDA培養(yǎng)基上和含1.7 mol·L-1或3.0 mol·L-1NaCl鹽濃度的PDA培養(yǎng)基上的菌落直徑。

1.4　分子鑒定

1.4.1DNA提取

采用CTAB法[17]提取真菌基因組DNA。

1.4.25.8S rDNA-ITS序列擴增與測序

利用5.8S rDNA-ITS通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進行PCR擴增。PCR擴增反應(yīng)體系(25 μL)：2×Taqmix 12.5 μL(上海生工生物工程股份有限公司)；ITS1 0.5 μL，ITS4 0.5 μL(杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成)；DNA模板1 μL， ddH2O 10.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物利用l%的瓊脂糖凝膠電泳檢測有無適當(dāng)大小的目的條帶，將檢測出目的條帶的PCR擴增產(chǎn)物純化后送至杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.4.3真菌鑒定

分子鑒定：運用BioEdit軟件對測序結(jié)果進行分析校正，利用NCBI中的Blast對得到的菌株序列進行比對，確認測序結(jié)果。

形態(tài)鑒定：分別將嗜鹽耐鹽菌株接種到PCA培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待產(chǎn)孢后，制作玻片，通過顯微鏡觀察其顯微形態(tài)，參照《真菌鑒定手冊》[18]、《真菌分類學(xué)》[19]、《真菌學(xué)詞典》第9版，以及Mycobank網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(http://www.mycobank.org/)對菌株進行形態(tài)鑒定，結(jié)合菌株的BLAST序列比對結(jié)果鑒定菌株。

2　結(jié)果與分析

2.1　嗜鹽耐鹽真菌的分離與鑒定

從堿蓬根系共分離得到163株真菌，嗜鹽耐鹽性檢測顯示：得到嗜鹽真菌3株，經(jīng)鑒定均為聚多曲霉(Aspergillussydowii)；得到耐鹽真菌40株，分別屬于鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、鏈格孢屬(Alternariasp.)、曲霉屬(Aspergillussp.)、腐霉屬(Pythiumsp.)、埃里格孢屬(Embellisiasp.)、青霉屬(Penicilliumsp.)、小球腔菌屬(Leptosphaeriasp.)、暗球腔菌科(Phaeosphaeriaceae sp.)、炭角菌目(Xylariales sp.)和多孔菌目(Polyporales sp.)。其中：鐮刀菌屬15株，菌株數(shù)最多，占比9.2%；鏈格孢屬8株，占比4.9%；曲霉屬4株，占比2.4%；腐霉屬3株，占比1.8%；埃里格孢屬2株，占比1.2%；青霉屬1株，占比0.6%；小球腔菌屬1株，占比0.6%；暗球腔菌科5株，占比3.1%；炭角菌目真菌3株，占比1.8%；多孔菌目真菌1株，占比0.6%。結(jié)果表明鐮刀菌是堿蓬根際的優(yōu)勢菌種(表1)。

鑒定到種的分別是聚多曲霉(Aspergillussydowii)(3株)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)(1株)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)(8株)、厚垣鐮刀菌(Fusariumchlamydosporum)(2株)和細極鏈格孢(Alternariatenuissima)(1株)。在含不同濃度的NaCl培養(yǎng)基上檢測，結(jié)果顯示聚多曲霉是嗜鹽真菌，在1.7 mol·L-1和3.0 mol·L-1的鹽濃度下都表現(xiàn)出較高的耐鹽性；棘孢曲霉、尖孢鐮刀菌、厚垣鐮刀菌和細極鏈格孢是耐鹽真菌，在1.7 mol·L-1的鹽濃度下都表現(xiàn)出較好的耐鹽性，在3.0 mol·L-1的鹽濃度下幾乎不生長(表2)。其中棘孢曲霉和尖孢鐮刀菌是沒有被報道過的耐鹽真菌。聚多曲霉作為耐鹽真菌已由Kis-Papo等[20]從死海海水中分離得到。

表1嗜鹽耐鹽真菌分離頻率

Table1Isolating proportion of halophilic and halotolerant fungi

分類Taxonomy菌株數(shù)StrainNo.分離頻率Frequency/%Fusariumsp.159.2Alternariasp.84.9Aspergillussp.42.4Pythiumsp.31.8Embellisiasp.21.2Penicilliumsp.10.6Leptosphaeriasp.10.6Phaeosphaeriaceaesp.53.1Xylarialessp.31.8Polyporalessp.10.6

2.2　嗜鹽耐鹽真菌的形態(tài)特征

2.2.1棘孢曲霉 Aspergillus aculeatus

菌株JP 17-7-1于25 ℃培養(yǎng)5 d，在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，菌落直徑約37 mm，質(zhì)地緊密，邊緣白色隆起，中心黑色并下凹，有放射狀溝紋，菌落反面呈淡黃色。菌株在1.7 mol·L-1NaCl鹽濃度的PDA培養(yǎng)基上生長緩慢，直徑約26.7 mm，白色，在3.0 mol·L-1NaCl鹽濃度的PDA培養(yǎng)基上不生長。分生孢子頭球形，頂囊近球形，直徑約50 μm；分生孢子橢圓或圓形，淡褐色，表面有刺突，直徑約5 μm。菌株形態(tài)符合曲霉特征，并且5.8S rDNA-ITS序列與棘孢曲霉相似度為100%，因此鑒定該菌株為棘孢曲霉。本研究首次報道棘孢曲霉是耐鹽真菌(圖1-A)。

2.2.2尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum

菌株JP 4-2在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，25 ℃培養(yǎng)5 d菌落直徑約46 mm，菌絲緊密，邊緣白色，中間淡紅色并隆起。菌株在1.7 mol·L-1NaCl鹽濃度的PDA培養(yǎng)基上生長緩慢，直徑約9 mm，白色，菌絲稀疏；菌株在3.0 mol·L-1NaCl鹽濃度的PDA培養(yǎng)基上不生長。分生孢子梗產(chǎn)孢部位較細，單瓶梗，在菌絲上散生。大型分生孢子由中間向兩端變尖，呈月牙形，多數(shù)3個隔，大小約為50 μm×5 μm；小型分生孢子卵圓形，表面光滑，大小約4 μm。菌體形態(tài)符合鐮刀菌特征，并且5.8S rDNA-ITS序列與尖孢鐮刀菌相似度為100%，因此鑒定該菌株為尖孢鐮刀菌。本研究首次報道尖孢鐮刀菌是耐鹽真菌(圖1-B)。

2.2.3厚垣鐮刀菌 Fusarium chlamydosporum

菌株JP 17-1于25 ℃培養(yǎng)5 d，在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，菌落長滿培養(yǎng)皿，絨毛狀，菌絲奶白色，氣生菌絲發(fā)達，培養(yǎng)基背面淡黃色。菌株在1.7 mol·L-1NaCl鹽濃度的PDA培養(yǎng)基上生長較快，直徑約27 mm，白色；菌株在3.0 mol·L-1NaCl鹽濃度的PDA培養(yǎng)基上不生長。菌絲中間或端部膨大形成多個串聯(lián)的厚垣孢子，圓形，表面粗糙，直徑20～25 μm。該菌株的5.8S rDNA-ITS序列與厚垣鐮刀菌相似度為100%，因此鑒定該菌株為厚垣鐮刀菌。丁小維[21]于2014年已報道厚垣鐮刀菌是耐鹽真菌(圖1-C)。

2.2.4細極鏈格孢Alternariatenuissima

表2堿蓬根際嗜鹽耐鹽真菌耐鹽性及ITS序列分析

Table2Salinity tolerance and ITS sequence analysis of halophilic and halotolerant fungi isolated from roots ofSuaedaplants

菌株Strain鑒定結(jié)果IdentificationresultNaCl鹽濃度抑制率InhibitionratioofNaCl/%1.7mol·L-13.0mol·L-1GenBank中最相似種MostsimilargenerainGenBankITS序列相似度SimilarityofITSsequence/%登錄號AccessionNo.JP1-4Phaeosphaeriaceaesp.50.0100100KU991904JP2-3Penicilliumsp.78.3100100KJ191440JP3-1Embellisiasp.73.310099KP114299JP4-2Fusariumoxysporum65.0100100MF280117JP4-5Fusariumsp.67.0100100KU321547JP5-1Polyporalessp.66.710095KJ831919JP10-1Aspergillussydowii-18.758.3100KP994297JP12-4Xylarialessp.44.310098KP114319JP13-3Alternariatenuissima61.910099KX065003JP13-5Alternariasp.67.0100100KU672592JP17-1Fusariumchlamydosporum51.4100100KT634074JP17-7Pythiumsp.92.110099AB543064JP17-7-1Aspergillusaculeatus27.977.7100GU134884

菌株JP 13-3于25 ℃培養(yǎng)5 d后，在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，菌落直徑約為53 mm，毛絨狀，氣生菌絲發(fā)達，邊緣灰白色，背面深褐色。菌株在1.7 mol·L-1NaCl鹽濃度的PDA培養(yǎng)基上生長緩慢，直徑約20 mm，白色，菌絲稀疏；菌株在3.0 mol·L-1NaCl鹽濃度的PDA培養(yǎng)基上不生長。菌絲分支多，孢子鏈短，分生孢子梨形，多數(shù)分生孢子3個縱膈孢。菌株形態(tài)特征符合鏈格孢，并且5.8S rDNA-ITS序列與細極鏈格孢相一致，鑒定該菌株為細極鏈格孢。代東梅[5]已在2013年報道了細極鏈格孢是耐鹽真菌(圖1-D)。

2.2.5聚多曲霉 Aspergillus sydowii

菌株JP 10-1于25 ℃培養(yǎng)5 d，在PDA培養(yǎng)基上菌落直徑約為32 mm，邊緣白色，中間淡褐色，中心少部分暗藍色。菌株在1.7 mol·L-1NaCl鹽濃度的PDA培養(yǎng)基上生長較快，菌落直徑約38 mm，中間暗藍色，邊緣白色；菌株在3.0 mol·L-1NaCl鹽濃度的PDA培養(yǎng)基上菌落直徑約13.3 mm，白色，質(zhì)地緊密。分生孢子頭輻射狀，直徑約30 μm，頂囊近球形，較小，分生孢子球形，表面粗糙，有刺突，直徑約4 μm。菌體形態(tài)符合曲霉特征，并且5.8S rDNA-ITS序列與聚多曲霉相似度為100%，因此鑒定該菌株為聚多曲霉(圖1-E)。該菌在1.7 mol·L-1和3.0 mol·L-1NaCl鹽濃度下抑制率分別為-18.7%和58.3%(圖2)，表明1.7 mol·L-1NaCl鹽濃度對聚多曲霉生長具有促進作用，而3.0 mol·L-1NaCl鹽濃度對聚多曲霉抑制作用較大。

A， 棘孢曲霉；B， 尖孢鐮刀菌；C， 厚垣鐮刀菌；D， 細極鏈格孢；E， 聚多曲霉。標(biāo)尺=10 μm。A， Aspergillus aculeatus; B， Fusarium oxysporum; C， Fusarium chlamydosporum; D， Alternaria tenuissima; E， Aspergillus sydowii. Bar=10 μm.圖1　五種嗜鹽耐鹽真菌顯微形態(tài)Fig.1　Micrographic morphological characteristics of 5 species of halophilic and halotolerant fungi

A、B、C中培養(yǎng)基上NaCl的濃度分別為0、1.7、3.0 mol·L-1。NaCl concentration in medium A， B， C were 0， 1.7， 3.0 mol·L-1， respectively.圖2　聚多曲霉耐鹽性Fig.2　Salt tolerance of Aspergillus sydowii

3　討論

根際真菌對植物具有重要作用。在干旱、高鹽脅迫環(huán)境條件下，根際真菌提高了植物根系從脅迫環(huán)境中吸收水分的能力，估計可以達到根系總吸水量的20%。植物根系與特定微生物通過互作建立互惠的關(guān)系，可以促進植物生長，增強植物適應(yīng)性，減輕逆境脅迫的癥狀。已有報道，具有忍耐高鹽脅迫能力的菌根真菌與植物根系建立互惠共生體，能夠調(diào)節(jié)植物多種生理生化代謝，增強植物抗鹽性[22-23]。篩選高效耐鹽的菌根真菌資源，對開發(fā)菌根真菌提高植物抗鹽性的應(yīng)用具有重要意義。本研究從堿蓬根系中分離到的耐鹽真菌屬于多個屬，有2個種是首次報道的耐鹽真菌。本研究得到的真菌是從健康的堿蓬根系表面分離的，雖然分離時沒有進行表面消毒，無法區(qū)分分離到的是黏附在根系表面的真菌還是內(nèi)生真菌，但許多菌株在培養(yǎng)過程中沒有出現(xiàn)任何形式的孢子，與分離內(nèi)生真菌時遇到的情況相似[24]，據(jù)此推測有些菌株可能屬于內(nèi)生真菌。關(guān)于內(nèi)生真菌與植物根系的互作情況和對植物抗(耐)鹽性的影響將作進一步研究。

高鹽環(huán)境是一種極端環(huán)境，研究者根據(jù)其采樣的環(huán)境，對耐鹽真菌耐鹽濃度的定義標(biāo)準(zhǔn)也不同。早期的研究是從曬鹽場分離真菌，篩選耐鹽真菌的標(biāo)準(zhǔn)是能夠在10% NaCl鹽濃度下生長；后期有研究從海邊土壤、植物中分離真菌，考慮到海水的平均含鹽量約為3%，因此采用3%的NaCl鹽濃度作為耐鹽標(biāo)準(zhǔn)[25]。黃菁菁等[26]從海水環(huán)境中的土樣和植物樣品中分離真菌，篩選耐鹽真菌的標(biāo)準(zhǔn)是6%的含鹽量。本研究采用從曬鹽場篩選耐鹽菌株的標(biāo)準(zhǔn)(10%的鹽濃度)，從鹽堿地生長健壯的堿蓬根系中分離的真菌，許多是耐鹽菌株，說明堿蓬可作為研究耐鹽菌株多樣性的重要來源，鹽堿地生長的植物根系中的真菌具有豐富的多樣性。

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