王向東，馬艷芝，客紹英

(1.唐山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，河北 唐山 063001； 2.唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000)

荊芥(SchizonepetatenuifoliaBriq.)為唇形科草本植物荊芥的干燥地上部分，始載于《吳普本草》[1]。荊芥主治感冒頭痛、風(fēng)疹、咽喉腫痛等病癥，為中醫(yī)臨床上的常用藥物[2-3]。現(xiàn)代荊芥以人工栽培為主，主要分布在江蘇、浙江、河北、東北三省等地，其中河北安國荊芥和浙江蕭山荊芥最為有名[4]。前人對(duì)荊芥的研究主要在栽培方法、炮制加工、化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用等方面，如有學(xué)者對(duì)荊芥的高產(chǎn)栽培技術(shù)[5]、大田栽培技術(shù)[6]、規(guī)范化生產(chǎn)栽培技術(shù)[7]等進(jìn)行過研究。周麗娜[8]對(duì)荊芥的化學(xué)成分就藥理作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，荊芥具有抗病毒、抗氧化等藥理作用。何婷等[9]發(fā)現(xiàn)，荊芥揮發(fā)油、薄荷酮和胡薄荷酮治療方式給藥，顯示出體內(nèi)抗病毒作用。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，荊芥穗可應(yīng)用于蕁麻疹、水痘、流行性腮腺炎、鼻竇炎等[10]。

ISSR(inter-simple sequence repeat)分子標(biāo)記技術(shù)是利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)的DNA分子標(biāo)記[11]。該標(biāo)記技術(shù)具有模板需求量少、多態(tài)性豐富、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、信息量大等優(yōu)點(diǎn)[12]，目前ISSR標(biāo)記已廣泛運(yùn)用于植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性檢測(cè)與評(píng)價(jià)以及基因定位、進(jìn)化及分子生態(tài)學(xué)等方面的研究[13]。目前關(guān)于荊芥種質(zhì)資源遺傳多樣性方面的研究比較少，劉紅彬等[14]曾研究了基于ITS序列的不同產(chǎn)地裂葉荊芥系統(tǒng)發(fā)育；本實(shí)驗(yàn)室利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)、AFLP技術(shù)和ITS序列分析技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地的荊芥進(jìn)行過遺傳多樣性分析[15-16]。高峰[17]利用ISSR技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地荊芥進(jìn)行過遺傳多樣性分析，而他選用的引物僅為12條，選擇的荊芥材料分布也較集中。鑒于此，本研究擬利用ISSR標(biāo)記技術(shù)，選用100條引物，對(duì)供試11份荊芥種質(zhì)進(jìn)行分析，旨在研究荊芥種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為進(jìn)一步篩選和保存荊芥優(yōu)質(zhì)種源奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

11種荊芥材料名稱及來源見表1。供試的荊芥種子來自河北、安徽等省，3號(hào)和4號(hào)材料由北京同仁堂河北中藥材有限公司提供，其他由課題組成員購自當(dāng)?shù)刂兴幉氖袌?chǎng)。其中1號(hào)和3號(hào)為春播品種，其他均為夏播品種。春播品種于3～4月播種，夏播品種于6～7月播種。

表1供試荊芥材料編號(hào)及來源

Table1Samples number and origin of testedSchizonepetatenuifoliaBriq. materials

樣品編號(hào)SamplesNumber來源Origin1河北安國Anguo,HebeiProvince2河北安國Anguo,HebeiProvince3河北玉田Yutian,HebeiProvince4河北玉田Yutian,HebeiProvince5安徽亳州Bozhou,AnhuiProvince6浙江蕭山Xiaoshan,ZhejiangProvince7山西運(yùn)城Yuncheng,ShanxiProvince8甘肅酒泉Jiuquan,GansuProvince9新疆和田Hetian,XinjiangProvince10江蘇鹽城Yancheng,JiangsuProvince11四川容縣Rongxian,SichuanProvince

1.2　試劑和儀器

1.2.1試劑

β-巰基乙醇、異丙醇、氯仿、無水乙醇、TE緩沖液和雙蒸餾水，以上試劑均購自上海生工，為分析純。ISSR-PCR擴(kuò)增所用的TaqDNA聚合酶 購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2.2儀器

提取DNA的CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司。ISSR-PCR擴(kuò)增在Biometra公司的PCR儀上進(jìn)行，電泳結(jié)果在Bio-Rad儀上拍照，記錄電泳結(jié)果。

1.3　方法

1.3.1DNA的提取

DNA的提取參照CTAB基因組DNA快速提取的方法進(jìn)行[18]。

1.3.2ISSR-PCR體系正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考王躍虎等[19]優(yōu)化的荊芥ISSR-PCR反應(yīng)體系，對(duì)DNA模板用量、引物用量、Taq酶的用量進(jìn)行3因素4水平優(yōu)化(表2)[20]。

利用L16(43)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[21]，隨機(jī)選用1號(hào)、6號(hào)、9號(hào)荊芥材料，用引物UBC855進(jìn)行擴(kuò)增。ISSR-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存[22]。

表2ISSR-PCR反應(yīng)體系體系設(shè)計(jì)

Table2Design of ISSR-PCR

項(xiàng)目Substance參數(shù)設(shè)計(jì)Reactionparameter模板DNATemplateDNA/ng50100150200引物Primer/(μmol·L-1)0.250.500.751.00TaqDNA聚合酶TaqDNApolymerase/U0.500.751.001.25

1.3.3ISSR-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測(cè)

ISSR-PCR反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL，3 μL loading buffer溶液染色后，在含有EB的1.8%瓊脂糖凝膠中檢測(cè)，電壓為5 V·cm-1，最后于凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄結(jié)果。

1.3.4ISSR引物退火溫度的篩選

100條ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的ISSR引物序列設(shè)計(jì)，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。在比引物Tm值低3 ℃的基礎(chǔ)上，設(shè)置5～6個(gè)退火溫度梯度[23-24]。選用1號(hào)材料在已經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序下對(duì)每一個(gè)引物進(jìn)行退火溫度的篩選。

1.3.5ISSR擴(kuò)增并檢測(cè)

用100條引物對(duì)11種荊芥進(jìn)行ISSR分析，然后用濃度為1.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.4　數(shù)據(jù)整理及分析

統(tǒng)計(jì)結(jié)果，同一引物、同一位點(diǎn)有擴(kuò)增條帶的記為“1”，無擴(kuò)增條帶的則記為“0”[25]。利用統(tǒng)計(jì)分析軟件DPS(V7.5)計(jì)算遺傳距離，UPGMA方法進(jìn)行聚類分析[26]。

2　結(jié)果與分析

2.1　DNA提取

將提取出來的11種荊芥基因組DNA進(jìn)行5 V·cm-1電壓下電泳45 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄，結(jié)果如圖1所示?？梢钥吹教崛〉?1種樣品的條帶都十分清晰，總DNA電泳位置近乎一致，證明提取的基因組DNA純度可靠。

M，DNA分子量標(biāo)記。下同。M， DNA marker. The same as below.圖1　荊芥11種品種的DNA電泳結(jié)果Fig.1　Electrophoresis results of 11 Schizonepeta tenuifolia Briq.

2.2　ISSR-PCR體系正交優(yōu)化

隨機(jī)選用1號(hào)，6號(hào)，9號(hào)材料，UBC855引物進(jìn)行正交優(yōu)化，從1號(hào)材料的擴(kuò)增結(jié)果(圖2)中可看出，第3、4、6、7、11、12、13、14、15組的擴(kuò)增條帶多、清晰、整齊；從6號(hào)材料的擴(kuò)增結(jié)果(圖3)中可看出，第3組和第4組的擴(kuò)增條帶較清晰整齊；從9號(hào)材料的擴(kuò)增結(jié)果(圖4)中可看出，第3組和第8組的擴(kuò)增條帶較多，且清晰、整齊，綜合考慮試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和節(jié)省DNA模板，因此選用3號(hào)體系為11種荊芥ISSR-PCR試驗(yàn)的最優(yōu)體系，最優(yōu)反應(yīng)體系為：模板DNA 50 ng，引物0.75 μmol·L-1，TaqDNA聚合酶1 U，ddH2O 補(bǔ)充至25 μL。

圖2　引物UBC855對(duì)1號(hào)荊芥的ISSR結(jié)果Fig.2　ISSR amplification results for primer UBC855 to No.1 Schizonepeta tenuifolia Briq.

圖3　引物UBC855對(duì)6號(hào)荊芥的ISSR結(jié)果Fig.3　ISSR amplification results for primer UBC855 to No.6 Schizonepeta tenuifolia Briq.

圖4　引物UBC855對(duì)9號(hào)荊芥的ISSR結(jié)果Fig.4　ISSR amplification results for primer UBC855 to No.9 Schizonepeta tenuifolia Briq.

2.3　ISSR引物退火溫度篩選

選用1號(hào)材料對(duì)每一個(gè)引物進(jìn)行退火溫度的篩選，篩選結(jié)果如表3。圖5為引物UBC853、UBC855、UBC858(從右至左)的溫度篩選結(jié)果。

2.4　ISSR引物對(duì)11種荊芥的擴(kuò)增

用55條引物在11種荊芥材料中總共擴(kuò)增出458個(gè)條帶，其中多態(tài)性帶為246條，多態(tài)性比率為53.71%，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出8.3個(gè)多態(tài)

性條帶，擴(kuò)增條帶最多的是引物UBC809和引物UBC824，擴(kuò)增條帶為13，多態(tài)性條帶分別為6、11，擴(kuò)增條帶最少的為UBC895，擴(kuò)增條帶為1，多態(tài)性條帶為1。ISSR引物及其擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性水平如表4所示。

2.5　11種荊芥材料的遺傳距離分析

利用55個(gè)ISSR引物在11份荊芥材料中所得的458條擴(kuò)增帶，根據(jù)結(jié)果計(jì)算材料間的遺傳距離[27]，不同荊芥種質(zhì)資源基于ISSR的遺傳距離結(jié)果見表5，結(jié)果表明，供試的11個(gè)荊芥樣本間的遺傳距離在0.208 3～0.709 1，表明這些荊芥樣本之間的遺傳距離較近，親緣關(guān)系差別不大。其中來自安國的荊芥春播和秋播遺傳距離較近為0.287 4，來自玉田的荊芥秋播和春播遺傳距離最近為0.208 3，說明來自同一地區(qū)遺傳距離較近。而6號(hào)和10號(hào)荊芥材料的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳距離為0.709 1；其次為8號(hào)和10號(hào)荊芥材料，遺傳距離為0.647 1；親緣關(guān)系最近的是3號(hào)和4號(hào)荊芥材料，遺傳距離為0.208 3，其次為1號(hào)和2號(hào)荊芥材料，遺傳距離為0.287 4。

表3實(shí)驗(yàn)所用的55條引物的序列及退火溫度

Table3Sequence and annealing temperatures of fifty-five primers

編號(hào)No.序列Sequence(5’-3’)退火溫度Annealingtemperature/℃編號(hào)No.序列Sequence(5’-3’)退火溫度Annealingtempera-ture/℃UBC-808(AG)8C53.8UBC-844(CT)8RC49.6UBC-809(AG)8G58.0UBC-845(CT)8RG48.0UBC-810(GA)8T56.0UBC-846(CA)8RT54.0UBC-811(GA)8C54.0UBC-847(CA)8RC53.1UBC-812(GA)8A52.0UBC-848(CA)8RG53.8UBC-813(CT)8T49.0UBC-849(GT)8YA54.0UBC-815(CT)8G52.0UBC-850(GT)8YC54.0UBC-816(CA)8T53.9UBC-851(GT)8YG58.0UBC-817(CA)8A55.0UBC-852(TC)8RA44.9UBC-818(CA)8G49.6UBC-853(TC)8RT54.0UBC-819(GT)8A58.0UBC-854(TC)8RG49.0UBC-820(GT)8C53.1UBC-855(AC)8YT50.0UBC-821(GT)8T58.0UBC-857(AC)8YG44.0UBC-822(TC)8A53.1UBC-858(TG)8RG54.0UBC-824(TC)8G46.0UBC-859(TG)8RC52.0UBC-825(AC)8T53.1UBC-860(TG)8RA45.0UBC-826(AC)8C53.1UBC-861(ACC)558.0UBC-827(AC)8G58.0UBC-862(AGC)558.0UBC-828(TG)8A52.0UBC-864(ATG)544.0UBC-829(TG)8C48.0UBC-866(CTC)554.0UBC-830(TG)8G50.0UBC-868(GAA)544.0UBC-834(AG)8YT54.0UBC-869(GTT)538.0UBC-835(AG)8YC50.8UBC-873(GACA)447.0UBC-836(AG)8YA56.0UBC-880(GGAGA)349.0UBC-840(GA)8YT53.8UBC-890VHV(GT)753.0UBC-841(GA)8YC52.6UBC-891HVH(TG)753.0UBC-842(GA)8YG52.0UBC-895AGAGTTGGTACGTCTT-GATC48.0

從右至左，分別為6個(gè)溫度依次為46、48、50、52、54、56℃的UBC853處理； 6個(gè)溫度依次為46、48、50、52、54、56℃的UBC855處理； 5個(gè)溫度依次為48、50、52、54、56℃的UBC858處理。From right to left， the former six bands were the UBC853 treatments under the temperatures of 46， 48， 50， 52， 54， 56 ℃， respectively. The six bands in the middle were the UBC855 treatments under the temperatures of 46， 48， 50， 52， 54， 56 ℃. The last five bands were the UBC858 treatments under the temperatures of 48， 50， 52， 54， 56 ℃， respectively.圖5　引物UBC853、UBC855、UBC858的退火溫度篩選結(jié)果Fig.5　Annealing temperatures screening results for primer UBC853， UBC855 and UBC858

2.6　基于ISSR引物對(duì)11種荊芥的聚類分析

用UPGMA方法對(duì)55條ISSR引物的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖6所示。從圖中可看出，親緣關(guān)系較近的中聚類時(shí)距離較近[28-29]。11種荊芥材料都聚在遺傳距離為0.20～0.56的類群中。在遺傳距離為0.50處，可將供試的11種荊芥材料分為2大類，第一大類包括2號(hào)荊芥；第二大類包括1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、11號(hào)荊芥，其中8號(hào)和9號(hào)荊芥材料的親緣關(guān)系比較近，10號(hào)和11號(hào)荊芥材料的親緣關(guān)系比較近。在遺傳距離為0.40處，可將供試的11種荊芥材料分為五大類，第一類為3號(hào)、10號(hào)和11號(hào)荊芥材料，其中10號(hào)和11號(hào)材料的親緣關(guān)系比較近；第二大類為1號(hào)、8號(hào)和9號(hào)荊芥材料，其中8號(hào)和9號(hào)材料的親緣關(guān)系比較近；第三大類為5號(hào)、6號(hào)和7號(hào)荊芥材料，其中5號(hào)和7號(hào)的親緣關(guān)系比較近；第四大類為4號(hào)荊芥材料；第五大類為2號(hào)荊芥材料。

表4ISSR引物及其擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性水平

Table4Primers of ISSR and polymorphism level of their amplification products

引物編號(hào)No.擴(kuò)增條帶數(shù)Amplifiedbands多態(tài)性條帶數(shù)Polymorphicbands多態(tài)性比率Polymorphicpercentage/%引物編號(hào)No.擴(kuò)增條帶數(shù)Amplifiedbands多態(tài)性條帶數(shù)Polymorphicbands多態(tài)性比率Polymorphicpercentage/%UBC-8089333.33UBC-84411872.73UBC-80913646.15UBC-8457228.57UBC-8109444.44UBC-84610770.00UBC-81112650.00UBC-84710440.00UBC-81210440.00UBC-8489888.89UBC-8136466.67UBC-8496350.00UBC-814111090.91UBC-8501010100.00UBC-8156466.67UBC-85110770.00UBC-8167457.14UBC-8525360.00UBC-8176466.67UBC-8537342.86UBC-8188562.50UBC-85488100.00UBC-81933100.00UBC-8559555.56UBC-8209444.44UBC-85777100.00UBC-82110770.00UBC-8586233.33UBC-82210440.00UBC-8599666.67UBC-824131184.62UBC-8607685.71UBC-8256116.67UBC-86110550.00UBC-8267228.57UBC-8627457.14UBC-8279666.67UBC-8649111.11UBC-8288450.00UBC-8668112.50UBC-8296233.33UBC-86812325.00UBC-8309777.78UBC-8694250.00UBC-8349333.33UBC-87312758.33UBC-8357457.14UBC-88012325.00UBC-8369444.44UBC-8906350.00UBC-84010330.00UBC-8917228.57UBC-8418112.50UBC-89511100.00UBC-8429555.56總數(shù)Intotal45824653.71

表511個(gè)供試材料基于ISSR的遺傳距離

Table5Euclidean distance among 11 materials based on ISSR analysis

材料Material1234567891020.287430.49500.322940.46150.35920.208350.48000.42160.43810.361960.60780.51960.49020.47170.378970.44660.43520.46430.37840.37740.396080.51610.41940.50000.50940.42110.54170.420090.40450.32220.50490.45710.49020.60190.47170.4270100.52630.51000.57940.53210.60550.70910.51850.64710.5208110.49020.35350.37250.31070.43400.58180.44640.53850.45540.4286

圖6　11個(gè)供試材料基于ISSR的聚類圖Fig.6　Dendrogram of 11 materials tested based on ISSR

3　討論

對(duì)遺傳背景、遺傳結(jié)構(gòu)和種質(zhì)資源的遺傳關(guān)系進(jìn)行研究，可為提供優(yōu)良品種的選育提供幫助[30]。因此，一個(gè)或更多的可靠的分子鑒定方法是必要的。ISSR多態(tài)性較豐富，能進(jìn)行種質(zhì)資源和遺傳多樣性的分析。本實(shí)驗(yàn)通過ISSR-PCR用55個(gè)ISSR引物擴(kuò)增11個(gè)市場(chǎng)流通的南北荊芥樣本，結(jié)果顯示多態(tài)性比率為53.71%，這表明荊芥遺傳多樣性受到了一定的破壞。其中一些樣本的種質(zhì)資源不同，但遺傳距離在0.208 3～0.709 1，表明其遺傳關(guān)系密切，表明ISSR可以對(duì)具有較近遺傳距離的個(gè)體進(jìn)行相對(duì)較高的多態(tài)性檢測(cè)，并檢測(cè)到具有遠(yuǎn)親緣關(guān)系的種質(zhì)資源，表明ISSR技術(shù)可用于具有遠(yuǎn)遺傳距離的種質(zhì)資源。本研究中，發(fā)現(xiàn)3號(hào)河北玉田和4號(hào)河北玉田荊芥材料親緣關(guān)系最近，其次為1號(hào)和2號(hào)河北安國荊芥材料；浙江蕭山和江蘇省荊芥材料的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；其次為甘肅省和江蘇省荊芥材料；但聚類結(jié)果中來自河北、安徽亳州、浙江蕭山、山西、甘肅、新疆、江蘇、四川省等地的荊芥種質(zhì)資源，雖南北各異，卻聚類在了一起，這就表明有可能全國各地種質(zhì)資源引種頻繁，不同地域引種混亂，導(dǎo)致各省的荊芥親緣關(guān)系較近，品種混雜，缺乏一定的規(guī)范與標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)當(dāng)大力加強(qiáng)荊芥種質(zhì)資源的保護(hù)。

高峰[17]對(duì)不同產(chǎn)地荊芥利用ISSR技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)裂葉荊芥的遺傳多樣性為50.93%，低于同科中廣藿香的種內(nèi)遺傳多樣性，兩者比較表明裂葉荊芥的遺傳多樣性已經(jīng)受到了一定程度的破壞，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)種質(zhì)資源的保護(hù)，與本研究結(jié)果較一致。馬艷芝[16]采用AFLP標(biāo)記和ITS序列分析研究不同荊芥種質(zhì)資源，發(fā)現(xiàn)荊芥AFLP標(biāo)記多態(tài)性不高(63.90%)，聚類結(jié)果中親緣關(guān)系較近或引種頻繁地區(qū)較近種質(zhì)資源聚類在一起，與本研究結(jié)果較一致。本研究發(fā)現(xiàn)，雖1號(hào)和2號(hào)荊芥材料，3號(hào)和4號(hào)荊芥材料的遺傳距離較近，但在聚類時(shí)卻沒有首先聚在一起，可能是由于長(zhǎng)期大面積連年種植，不科學(xué)引種等各種原因，導(dǎo)致群體混雜、種質(zhì)退化，從而影響了荊芥藥材的整齊度和品質(zhì)。而來自南北各地的荊芥種質(zhì)資源卻聚類在了一起，這就表明有可能全國各地種質(zhì)資源引種頻繁，導(dǎo)致各省的荊芥親緣關(guān)系較近。

另外馬艷芝等[15]還采用RAPD技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地的荊芥種質(zhì)資源進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)11種荊芥材料的遺傳距離在0.133 3～0.777 8，種質(zhì)資源遺傳差距不大，遺傳多樣性不高，與本研究的結(jié)果基本一致。本研究基于ISSR分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)11種荊芥遺傳距離在0.208 3～0.709 1，但聚類結(jié)果與材料來源地的遠(yuǎn)近距離的分類結(jié)果并不是完全一致的，在一定程度上有相關(guān)性，這有可能是各地荊芥引種頻繁、不同地域引種混亂導(dǎo)致的，應(yīng)大力加強(qiáng)荊芥種質(zhì)資源的保護(hù)。

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