戴世龍，李浩，許博文，張青松

(華北理工大學(xué)附屬開灤總醫(yī)院，河北唐山063000)

肌肽即丙氨酰組氨酸，是一種內(nèi)源性二肽。近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，肌肽在體外動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用[1～4]，但其對乳腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響鮮見報(bào)道。轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(MTA1)是腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因之一，與上皮源性惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲關(guān)系密切[5]。2016年10月～2017年2月，本研究觀察了肌肽對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲、遷移及MTA1表達(dá)的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞由華北理工大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室保存。肌肽，VETEC公司；DMEM(高糖)，CORNING公司；總RNA提取試劑盒，寧波市重鼎生物技術(shù)有限公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京莊盟國際生物基因科技有限公司；Matrigel，美國Sigma公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(SYBRGreenⅠ法)，日本TAKARA公司；兔抗人MTA1抗體，Abcom公司；鼠抗人β-actin抗體，臺(tái)灣Arigo公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔及羊抗鼠IgG(二抗)，美國KPL公司。MTA1 引物由美國Invitrogen公司合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)將MDA-MB-231細(xì)胞置于含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.3細(xì)胞遷移、侵襲能力檢測

1.3.1細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)將1.2中培養(yǎng)的細(xì)胞以0.25%胰酶消化；調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞重新貼壁；待單層長滿，棄去培養(yǎng)基，用無菌10 μL槍頭在孔板底均勻間隔劃6條直線，以無菌PBS清洗3次。將細(xì)胞隨機(jī)分為三組，分別為50 mmol/L肌肽組、100 mmol/L肌肽組、對照組，前兩組分別以含終濃度為50、100 mmol/L肌肽的培養(yǎng)基培養(yǎng)，對照組常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)；培養(yǎng)24 h時(shí)在倒置顯微鏡下觀察劃痕處細(xì)胞愈合情況并拍照，每組重復(fù)3次。以劃痕愈合率評估細(xì)胞遷移能力。劃痕愈合率=(0 h時(shí)劃痕平均寬度-24 h時(shí)劃痕平均寬度)/0 h時(shí)劃痕平均寬度×100%。

1.3.2細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)將Transwell小室置于24孔板中，DMEM水化1 h；取密度為1×106個(gè)/mL MDA-MB-231細(xì)胞100 μL種植于小室中，下室(24孔板內(nèi)小室外)加入含20% FBS的DMEM 500 μL；參照1.3.1將細(xì)胞分組并處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；小心取出小室采用Giemsa染色液染色10 min，PBS清洗3次，棉球擦拭干凈小室內(nèi)膜細(xì)胞及小室周圍殘留染液，倒置顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)量并拍照。

1.3.3細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)將Transwell小室置于24孔板中，以1∶8稀釋的Matrigel膠體100 μL包被Transwell上室，待其凝固后，吸除Matrigel 膠上析出的液體，DMEM水化1 h；取密度為1×106個(gè)/mL MDA-MB-231細(xì)胞100 μL種植于小室(上室)中，下室(24孔板內(nèi)小室外)加入含20% FBS的DMEM 500 μL；參照1.3.1將細(xì)胞分組及處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；小心取出小室，Giemsa染色液染色10 min，PBS清洗3次，棉球擦拭干凈小室內(nèi)膠質(zhì)上未侵襲的殘留細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)量并拍照。

1.4MTA1 mRNA及MTA1蛋白表達(dá)檢測① MTA1 mRNA檢測：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。將1.2中培養(yǎng)的細(xì)胞接種于6孔板，參照1.3.1分組及處理，培養(yǎng)24 h時(shí)按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，參照RNA逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性180 s，95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。MTA1 引物序列：上游5′-AAGACCACCGACAGATAC-3′，下游5′-GTTGTTGA-

CGCTGATTTG-3′。以β-actin 為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算MTA1 mRNA 相對表達(dá)量。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以平均值為最終結(jié)果。② MTA1蛋白表達(dá)檢測：采用Western blotting法。將1.2中培養(yǎng)的細(xì)胞接種于6孔板，參照1.3.1分組及處理，培養(yǎng)24 h時(shí)，使用裂解液RIPA與PMSF(200∶1)混合液提取各組蛋白，分光光度計(jì)檢測蛋白濃度；蛋白與上樣緩沖液按照體積比4∶1混合，100 ℃金屬浴5 min；取適量處理后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳(200 V，30 min)，15 V條件下電轉(zhuǎn)15 min到NC膜，麗春紅預(yù)染、洗滌；5%脫脂奶粉封閉6～8 h，棄去牛奶，加入MTA1一抗，4 ℃過夜；TBST洗滌3～5次，加入二抗室溫孵育2 h；洗膜，15 min后顯影，化學(xué)發(fā)光儀中顯影并拍攝。采用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶與內(nèi)參(β-actin)條帶灰度值之比表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1三組細(xì)胞遷移、侵襲能力比較對照組細(xì)胞劃痕寬度愈合率、遷移及侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)均高于50、100 mmol/L肌肽組，50 mmol/L肌肽組均高于100 mmol/L肌肽組，組間比較P<0.05或<0.01。見表1。

表1　三組細(xì)胞遷移、侵襲能力比較

注：與對照組比較，*P<0.01；與50 mmol/L肌肽組比較，△P<0.05。

2.2三組MTA1 mRNA和蛋白表達(dá)比較對照組MTA1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量均低于50、100 mmol/L肌肽組，50 mmol/L肌肽組均低于100 mmol/L肌肽組，組間比較P<0.05或<0.01。見表2。

表2　三組MTA1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，*P<0.01；與50 mmol/L肌肽組比較，△P<0.05。

3　討論

化療通常作為乳腺癌患者手術(shù)前后的輔助治療或作為保守治療方法應(yīng)用于不能接受手術(shù)的患者，但有研究表明，化療具有潛在的促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[6]，其機(jī)制可能與化療對耐藥細(xì)胞和高侵襲性細(xì)胞的篩選作用以及誘導(dǎo)促轉(zhuǎn)移因子表達(dá)有關(guān)[7～9]。

肌肽分子式為C9H14N4O3，相對分子量為226.24 bp，是一種生物體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)，存在于多數(shù)動(dòng)物骨骼肌中。肌肽具有強(qiáng)烈的抗氧化作用，可作為自由基清除劑，具有螯合金屬、抗衰老及促進(jìn)傷口愈合等功能，被廣泛應(yīng)用于帕金森病、糖尿病、腦卒中、胃潰瘍及老年性白內(nèi)障等疾病的治療[10]。研究發(fā)現(xiàn)，肌肽可抑制結(jié)腸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等腫瘤細(xì)胞增殖[1～4]。肌肽作為一種天然內(nèi)源性二肽，不僅對正常細(xì)胞具有保護(hù)作用，而且具有殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，是一種十分理想的抗腫瘤藥物或作為其他化療藥物的輔助用藥。腫瘤在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力與腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力密切相關(guān)，遷移及侵襲能力強(qiáng)則腫瘤易于轉(zhuǎn)移，抑制遷移及侵襲能力則可以明顯抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。本研究細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肌肽可明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移及侵襲能力，且100 mmol/L肌肽的效果好于50 mmol/L。

MTA1作為腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因家族的一員，在多種人類上皮源性腫瘤如乳腺癌、大腸癌、胰腺癌、食管癌、胃癌等細(xì)胞中高表達(dá)，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力緊密相關(guān)，且其表達(dá)水平與腫瘤臨床病理分級(jí)、腫瘤侵襲能力呈正相關(guān)[11～13]。三陰性乳腺癌具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率高、侵襲能力強(qiáng)及缺乏HER2靶點(diǎn)等特點(diǎn)，患者預(yù)后差[14]。Jiang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，利用RNA干擾技術(shù)抑制雌激素受體(ER)陰性MDA-MB-231細(xì)胞中MTA1表達(dá)可以增強(qiáng)ERα表達(dá)，干擾沉默MTA1表達(dá)后ERα表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞株對雌激素拮抗劑的敏感性顯著增強(qiáng)，且細(xì)胞的遷移、侵襲能力顯著減弱。有研究指出，乳腺癌細(xì)胞MTA1可能通過合成MTA1細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶激活激酶(MTA1-CAK)復(fù)合物中的組蛋白去乙?；笍?fù)合物(HDAC)，進(jìn)而抑制CAK誘導(dǎo)ER激活的功能，阻滯ER介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄[16]。Sankaran等[17]報(bào)道，MTA1通過促進(jìn)透明質(zhì)酸介導(dǎo)的能動(dòng)受體(HMMR)表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲。本研究結(jié)果顯示，肌肽可抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞MTA1 mRNA和蛋白表達(dá)，且作用具有劑量依賴性，提示肌肽可能通過下調(diào)MTA1表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力。鑒于肌肽具有抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移及侵襲的作用，其或許可以作為乳腺癌臨床化療藥物的補(bǔ)充。但本研究未對肌肽調(diào)節(jié)MTA1表達(dá)的機(jī)制進(jìn)行探討，肌肽是否可通過抑制MTA1表達(dá)而增強(qiáng)ERα表達(dá)，進(jìn)而提高乳腺癌對化療藥物的敏感性等問題均是未來研究的方向。

綜上所述，肌肽可抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的遷移及侵襲，抑制MTA1表達(dá)可能是其作用機(jī)制。

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