叢艷君，李 曄，劉家琦，陳 澍，于曉鳳，李林峰

乳及乳制品因其營養(yǎng)豐富而深受廣大民眾喜愛，但同時(shí)，乳類也是國際糧農(nóng)組織公布的8大類食物過敏原之一[1]，牛乳過敏問題一直以來廣受關(guān)注。α-乳白蛋白（α-lactalbumin，ALA）是牛奶中的主要過敏原之一，大約占牛奶總蛋白含量的5%，乳清蛋白的25%[2]。ALA屬于溶菌酶家族，為單體球狀蛋白質(zhì)，其分子質(zhì)量為14.2 kDa，含有123 個(gè)氨基酸，4 個(gè)二硫鍵[3]。牛乳ALA是由乳腺上皮細(xì)胞分泌的，其主要功能為通過半乳糖基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)調(diào)節(jié)乳糖的合成[4]。牛源和人源的ALA具有74%的同源性和6%的相似性。在食品工業(yè)中，ALA是嬰兒配方食品的重要組成成分，這是因?yàn)樗卸喾N必需氨基酸，并具有多種生理功能，如抑制結(jié)腸癌作用和抗炎癥作用等[5]。

過敏原表位是過敏原中參與結(jié)合抗體的組成部分，是蛋白質(zhì)引發(fā)食物過敏反應(yīng)的免疫學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)[6]。從免疫學(xué)機(jī)制來看，食物過敏可分為免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導(dǎo)和非IgE介導(dǎo)兩大類。一些研究表明，在牛奶過敏疾病中，免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）發(fā)揮著重要的作用，一些持續(xù)性牛乳過敏患兒和成人患者血清中抗乳蛋白的IgG含量顯著高于正常水平[7-8]，但是IgG介導(dǎo)的牛乳過敏反應(yīng)機(jī)制目前報(bào)道較少。

本研究首先參考文獻(xiàn)[4]收集對牛乳ALA過敏的嬰幼兒血清，然后用血清識(shí)別ALA的IgG作用表位，進(jìn)而通過丙氨酸免疫表位掃描技術(shù)識(shí)別降低ALA致敏性的關(guān)鍵氨基酸。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鏈霉親和素、Costar 96 孔酶標(biāo)板 北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；ALA、4-氯-1-萘酚、三氟乙酸、辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的單克隆鼠抗人IgG 美國Sigma公司；ALA多肽為實(shí)驗(yàn)室合成。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250F生化培養(yǎng)箱 上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；550型酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；C18液相色譜柱、1200型高效液相色譜儀、5975E型質(zhì)譜儀 美國安捷倫科技公司；PSI 200多通道多肽合成儀 美國多肽科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛乳過敏患者血清的收集

根據(jù)典型的食物過敏史（臨床癥狀均表現(xiàn)為特異性皮炎）、ImmunolCAP實(shí)驗(yàn)篩選8 例ALA牛乳過敏患者（6個(gè)月～3 歲，平均年齡為1 歲），收集血清，8 例牛乳過敏患者血清特異性IgG含量在80～100 kU/L，如表1。同時(shí)收集5 例非牛乳過敏癥幼兒（1～3 歲）的血清用作陰性對照。陽性血清及陰性血清由北京友誼醫(yī)院提供，用來鑒別IgG表位和關(guān)鍵氨基酸。

表1 ALA過敏患者血清IgG水平Table 1 Serum levels of total IgG from ALA allergic patients

1.3.2 ALA多肽的合成、純化及鑒定

基于ALA的氨基酸序列，錯(cuò)位合成23 條長度為15 個(gè)氨基酸的ALA多肽。

合成方法為9-芴甲氧羰基（9-fluorenylmethoxycarbonyl，F(xiàn)moc）固相合成法[9]，即用含有游離的羥基的Fmoc-氨基酸-Wang樹脂在多肽合成儀上完成多肽的合成。多肽的合成以第一個(gè)Fmoc-氨基酸通過酯化反應(yīng)連接到Wang樹脂開始。反應(yīng)后，連接到Wang樹脂上的氨基酸殘基通過乙?；磻?yīng)保護(hù)起來，使它們不能進(jìn)行后續(xù)的步驟。其他氨基酸重復(fù)這個(gè)過程依次連接。連接完最后一個(gè)氨基酸后，加入體積比為1∶1∶0.05的二氯甲烷/三氟乙酸/三異丁基硅烷的混合物，切割氨基酸側(cè)鏈的保護(hù)基團(tuán)和樹脂，F(xiàn)moc保護(hù)基團(tuán)通過添加哌啶被移出，然后用二氯甲烷和甲醇洗滌。過濾后，裂解劑在真空條件下被去除，用叔丁基甲基醚冷沉淀得到粗肽，真空干燥，再溶于水凍干。

合成多肽的純化用C18反相高效液相色譜柱完成，梯度洗脫液為0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）三氟乙酸-水和0.1%乙腈-水，流速為12.0 mL/min。合成多肽的準(zhǔn)確性通過質(zhì)譜測定分子質(zhì)量進(jìn)行鑒定，采用電噴霧離子源，噴霧壓力為0.1 MPa，干燥氣溫度350 ℃，流速為5 L/min，掃描范圍為m/z 500～2 200。

1.3.3 IgG作用表位和關(guān)鍵氨基酸的識(shí)別

通過間接酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）識(shí)別IgG作用表位和關(guān)鍵氨基酸[10]。將連接鏈霉親和素的多肽加入到酶標(biāo)板中進(jìn)行包被后洗滌，再用三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%牛血清白蛋白）封閉，洗滌之后加入個(gè)體血清或者混合血清分別識(shí)別IgG作用表位或者關(guān)鍵氨基酸。二抗為HRP標(biāo)記的單克隆鼠抗人IgG，顯色液為4-氯-1-萘酚，檢測波長為450 nm，630 nm作為參照波長，以消除非特異性吸附。在參照波長下檢測物光的吸收最小。最后的結(jié)果是檢測波長和參照波長的OD值之差。陰性血清作為對照。

作用表位是被65%以上過敏患者個(gè)體血清識(shí)別的多肽[2]。關(guān)鍵氨基酸是作用表位的氨基酸被丙氨酸取代后合成的多肽的致敏性消失的氨基酸。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均做3 次平行，3 次重復(fù)。統(tǒng)計(jì)分析采用Excel 2010進(jìn)行，使用ANOVA分析數(shù)據(jù)的差異水平，以Kruskal-Wallis檢驗(yàn)P＜0.05作為差異顯著。ALA的三維結(jié)構(gòu)圖用Pymol軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 多肽合成

基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（the protein databank，PDB）中ALA氨基酸序列，本研究合成了23 條重疊肽（P1～P23），涵蓋了ALA 123 個(gè)氨基酸，肽的長度是15 個(gè)氨基酸，每相鄰2 條肽錯(cuò)位5 個(gè)氨基酸，重復(fù)10 個(gè)氨基酸，見表2，合成的多肽屬于ALA大部分氨基酸序列。多肽合成后用反相高效液相色譜純化，純度均在85%以上，并用質(zhì)譜通過測定多肽的分子質(zhì)量驗(yàn)證了合成多肽的準(zhǔn)確性。

表2 基于ALA氨基酸序列合成的23 條多肽Table 2 Twenty-three peptides synthesized based on the amino acid sequence of ALA

2.2 IgG作用表位的識(shí)別

本研究以多肽與血清反應(yīng)的OD值來表示結(jié)合的強(qiáng)度，反應(yīng)孔顏色越深，OD值越大，以O(shè)D值大于0.50為反應(yīng)程度強(qiáng)，大于0.25為反應(yīng)程度較強(qiáng)，大于0.10為反應(yīng)程度較弱，低于0.10為無反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)組的OD值大于陰性對照組的2 倍時(shí)判定為陽性結(jié)果，多肽與非牛乳過敏患者血清均表現(xiàn)為無反應(yīng)（陰性對照的OD值為0.05）。如表3所示，多數(shù)多肽與患者血清IgG都發(fā)生了特異性陽性反應(yīng)， 但是反應(yīng)程度不同，并且識(shí)別率不同。其中編號(hào)為P2的多肽（aa6～20）和編號(hào)為P5的多肽（aa21～35）的識(shí)別率為100%（8/8，即與8 份血清均發(fā)生特異性反應(yīng)）。aa36～50（P8）和aa86～100（P18）的識(shí)別率為75%（6/8）。P4、P9、P11和P13的識(shí)別率為37.5%（3/8）。多肽P1、P3、P6、P7、P10、P12、P14、P15、P17、P19、P20，P22的識(shí)別率為25%（2/8），P23與1 份血清發(fā)生了反應(yīng)。多肽P16和P21與血清未發(fā)生特異性反應(yīng)。通過比對PDB數(shù)據(jù)庫，用Pymol軟件制作ALA的三維結(jié)構(gòu)圖，見圖1，ALA的IgG作用表位在氨基酸序列中的定位為aa6～20、aa21～35、aa36～50和aa86～100，以綠色區(qū)域表示IgG作用表位。

圖1 ALA的3D結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 3D structure of ALA

表3 牛乳過敏患者血清識(shí)別ALA IgG作用表位Table 3 IgG-binding epitopes of ALA identified with individual serum from cow milk allergic patients

2.3 丙氨酸免疫表位掃描技術(shù)識(shí)別ALA IgG作用表位

以識(shí)別率100%的作用表位aa6～20和aa21～35為研究對象，識(shí)別關(guān)鍵氨基酸。即用丙氨酸依次取代作用表位上的氨基酸，合成多肽，以aa6～20和aa21～35為對照，用陽性混合血清通過ELISA方法識(shí)別新合成的多肽，比較OD值大小。

圖2 識(shí)別作用表位aa6～20的關(guān)鍵氨基酸的OD值Fig. 2 Identification of the critical amino acids in the epitope aa 6–20

如圖2所示，第9位的苯丙氨酸（Phe）、第15位的亮氨酸（Leu）分別被丙氨酸取代后合成的多肽OD值為零，多肽致敏性消失。與對照組相比，第11位的谷氨酸（Glu）被丙氨酸取代后合成的多肽OD值顯著增加（P＜0.05），第17位的甘氨酸（Gly）被丙氨酸取代后合成多肽的OD值顯著降低（P＜0.05），其他氨基酸被丙氨酸取代后的多肽OD值與對照組（aa6～20）差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 識(shí)別作用表位aa21～35的關(guān)鍵氨基酸的OD值Fig. 3 Identification of the critical amino acids in the epitope aa 21–35

同理，如圖3所示，第24位的脯氨酸（Pro）、第26位的色氨酸（Trp）和第32位的組氨酸（His）分別被丙氨酸取代后合成的多肽OD值為零，多肽致敏性消失。與對照組（aa21～35）相比，第22位絲氨酸（Ser）、第25位谷氨酸（Glu）、第27位纈氨酸（Val）和第29位的蘇氨酸（Thr）被取代后合成的多肽OD值顯著降低（P＜0.05），其他氨基酸被取代后合成多肽的OD值與對照組差異不顯著（P＞0.05）。

基于以上數(shù)據(jù)，第9位的苯丙氨酸，第15位的亮氨酸，第24位的脯氨酸，第26位的色氨酸和第32位的組氨酸是影響ALA致敏性的關(guān)鍵氨基酸。這些重要的氨基酸殘基的空間位置見圖1。

3 討 論

牛乳是嬰幼兒最早接觸的食物，也是5 歲以內(nèi)幼兒的主要過敏原，在發(fā)達(dá)國家大約2%～3%的幼兒對牛乳過敏[11]。其中，牛乳中ALA IgE識(shí)別率為6%～100%[7,12-13]。雖然IgG被認(rèn)為是正常人食用牛乳蛋白或者對牛乳蛋白免疫耐受后血清中都會(huì)產(chǎn)生的抗體[7]，但是一些研究表明，對β-乳球蛋白過敏患者血清中IgG含量顯著高于免疫耐受患者[14-17]。本研究收集IgG介導(dǎo)的牛乳過敏患者血清，用血清識(shí)別ALA的作用表位和關(guān)鍵氨基酸，探索牛乳ALA過敏機(jī)理。

牛乳過敏原ALA表位的識(shí)別方法主要有以下3 種：第一種是利用化學(xué)或酶法將過敏原“切割”成片段，然后逐個(gè)識(shí)別多肽的致敏性或抗原性。Hopp等[18]采用酶水解法研究牛乳ALA免疫學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)ALA的酶解肽段中aa4～18、aa60～80、aa91～94、aa105～117、aa119～123對天然ALA與兔血清的結(jié)合有不同程度的抑制作用。J?rvinen等[10]采用酶法裂解合成的重疊多肽定位出3 個(gè)牛乳ALA IgG結(jié)合表位。第二種是肽文庫技術(shù)，即建立噬菌體肽庫，用特異性血清中IgE或IgG篩選某種過敏原的線性表位，并進(jìn)行序列定位。Li Xin等[19]利用噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)篩選得到牛乳ALA線性和構(gòu)象表位，并通過生物信息學(xué)工具確定IgG和IgE表位。第三種是化學(xué)合成技術(shù)，即利用固相合成肽技術(shù)合成過敏原的重疊肽（每隔若干個(gè)氨基酸重疊），肽的長度一般是10～15 個(gè)氨基酸，然后用相應(yīng)的抗體與這些多肽反應(yīng)來確定表位[20-22]。Hochwallner等[23]化學(xué)合成了ALA的8 條多肽，用牛乳過敏患者血清識(shí)別發(fā)現(xiàn)多肽aa1～19的識(shí)別率為23.7%，aa15～34的識(shí)別率為47.4%。本研究采用‘丙氨酸免疫表位掃描技術(shù)’合成ALA系列多肽，以牛乳過敏患者血清為探針，通過ELISA方法識(shí)別ALA的作用表位和關(guān)鍵氨基酸。

牛乳過敏是由IgE介導(dǎo)或者非IgE介導(dǎo)的I型過敏反應(yīng)，患者接觸牛奶后會(huì)導(dǎo)致全身性蕁麻疹、支氣管收縮、血管性水腫和全身型過敏等癥狀。通過細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)的進(jìn)一步延遲或后期免疫反應(yīng)也屬于牛乳過敏的臨床范圍，如特異性皮炎[24]。在本研究中，8 例患者血清中IgG含量顯著高于其他抗體，均出現(xiàn)特異性皮炎的臨床癥狀，期望本研究結(jié)論可以為作用表位的識(shí)別模式與致敏個(gè)體的臨床癥狀的關(guān)系研究提供理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)識(shí)別到ALA 4 個(gè)IgG結(jié)合序列，分別為aa6～20、aa21～35、aa36～50和aa86～100，作用表位aa6～20、aa86～100與Hopp等[18]使用兔抗血清識(shí)別的aa4～18、aa91～94表位部分一致，這些區(qū)域具有親水性。另外，J?rvinen等[10]采用合成的重疊多肽定位出3 個(gè)牛乳ALA IgG結(jié)合表位，分別為aa7～18、aa51～61、aa89～108，本研究識(shí)別的作用表位aa6～20、aa86～100部分驗(yàn)證了J?rvinen的結(jié)論。同時(shí)J?rvinen等[10]發(fā)現(xiàn)了ALA的IgE和IgG都能識(shí)別到的作用表位，本研究同樣定位了牛乳過敏患者IgG和IgE作用表位的重疊區(qū)域（見圖1中黃色區(qū)域），即作用表位aa6～20和aa46～50，可以同時(shí)被牛乳過敏患者血清中的IgE和IgG識(shí)別。這表明，牛乳ALA中引起過敏的區(qū)域與抗原區(qū)域并不完全對應(yīng)，Maynard等[25]也有類似報(bào)道。作用表位aa6～20和aa21～35識(shí)別率為100%，且前者是國外文獻(xiàn)曾經(jīng)報(bào)道過的，后者是本研究新識(shí)別到的，這2 個(gè)作用表位均暴露于ALA過敏原表面，易于與抗體結(jié)合[26-28]，因此本研究重點(diǎn)探究這2 個(gè)作用表位的關(guān)鍵氨基酸。

不同文獻(xiàn)所識(shí)別的抗原表位不同的原因可能有：1）表位定位的方法不同，本實(shí)驗(yàn)采用重疊肽方法進(jìn)行定位，而J?rvinen等[10]采用酶水解法，這2 種方法的不同在于多肽的片段大小及所處的微環(huán)境不同，這種差異可能會(huì)影響多肽與抗體的結(jié)合；2）物種的差異，牛乳過敏患者遺傳背景不同，來源不同的血清，篩選到的表位會(huì)有所不同。

考慮到丙氨酸是中性氨基酸，相對分子質(zhì)量較小，不會(huì)顯著改變肽的溶解度或電荷，所以本研究以丙氨酸作為替換氨基酸來尋找IgG結(jié)合表位的關(guān)鍵氨基酸。這種方法已成功用于其他過敏原關(guān)鍵氨基酸的分析[29-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，作用表位aa6～20第9位的苯丙氨酸、第15位的亮氨酸被丙氨酸取代后合成的多肽與IgG的結(jié)合能力喪失。作用表位aa21～35上有3 個(gè)氨基酸在被丙氨酸取代之后合成的多肽與IgG結(jié)合能力顯著降低（P＜0.05），分別為第24位的脯氨酸、第26位的色氨酸和第32位的組氨酸。本研究結(jié)論可以為食物過敏免疫治療劑的發(fā)展提供理論依據(jù)，或根據(jù)需要修飾設(shè)計(jì)氨基酸、重組蛋白，生產(chǎn)不會(huì)結(jié)合血清和肥大細(xì)胞IgE或者IgG的蛋白，這也是未來研究的重點(diǎn)內(nèi)容。那些沒有被IgG識(shí)別的其他氨基酸，可以為“過敏原沉默”的研究提供思路。另外，我國牛乳過敏癥的低發(fā)病率，增加了收集牛乳過敏患者血清的難度。但是，本研究結(jié)論為未來形成一般性結(jié)論提供了基本數(shù)據(jù)和理論方法。我們將在未來幾年繼續(xù)收集牛乳過敏患者血清，繼續(xù)致力于牛乳過敏機(jī)制的研究。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，ALA的IgE關(guān)鍵氨基酸為第8位的纈氨酸、第9位的苯丙氨酸、第10位的精氨酸、第103位的酪氨酸、第105位的亮氨酸和第107位組氨酸[32]。因此，第9位的苯丙氨酸是ALA的IgE和IgG作用表位的共同關(guān)鍵氨基酸，這個(gè)結(jié)果表明，可以通過修飾此氨基酸，從而降低ALA的致敏性和抗原性。此外，IgE和IgG結(jié)合表位的相同氨基酸殘基可以為IgG和IgE抗體生成關(guān)系的研究提供重要信息。

4 結(jié) 論

通過丙氨酸免疫表位掃描技術(shù)和ELISA方法識(shí)別到降低ALA IgG作用表位的關(guān)鍵氨基酸，為第9位的苯丙氨酸、第15位的亮氨酸、第24位的脯氨酸、第26位的色氨酸和第32位的組氨酸。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，第9位的苯丙氨酸是ALA的IgE和IgG作用表位的共同關(guān)鍵氨基酸，這為通過基因工程技術(shù)重組過敏原蛋白以降低致敏性提供了重要的信息。

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