姚世響 - 曹 琦 謝 姣 鄧麗莉 - 曾凱芳 -

(1. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2. 重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

枯水常稱?；?，是柑橘的一種常見生理性病害，多發(fā)生于采后貯藏中[1]?？菟麑?shí)在外觀方面與正常果實(shí)并無二致，果皮表面新鮮，但果肉品質(zhì)顯著劣變，糖酸風(fēng)味變淡，嚴(yán)重時(shí)不堪食用?？菟钱?dāng)前影響柑橘果實(shí)貯藏壽命的重要因子，嚴(yán)重制約柑橘的商品價(jià)值。自1934年報(bào)道柑橘枯水至今，已過去80多年，科學(xué)家[2-5]從多方面對(duì)柑橘枯水進(jìn)行了研究，但對(duì)枯水的發(fā)生機(jī)制仍無明確結(jié)論。

柑橘果肉的香氣物質(zhì)來源于果實(shí)中合成的揮發(fā)性物質(zhì)[6]。目前對(duì)不同柑橘果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的分析研究發(fā)現(xiàn)萜烯類物質(zhì)是含量最大的一類[7-8]。對(duì)柑橘萜烯類物質(zhì)代謝途徑的研究是近年的研究熱點(diǎn)[9-10]。盡管柑橘在貯藏后期發(fā)生枯水時(shí)，會(huì)普遍伴隨著香氣物質(zhì)的變淡，但這種現(xiàn)象缺乏試驗(yàn)證據(jù)的支撐。椪柑(CitrusreticulataBlanco cv. Ponkan)含糖量高、香氣濃郁，深受消費(fèi)喜愛，在重慶地區(qū)有較大面積的栽培[11]。本研究擬以椪柑為試驗(yàn)材料，運(yùn)用氣相-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)(RNA-Sequencing, RNA-Seq)，分析椪柑枯水時(shí)果肉揮發(fā)性物質(zhì)和萜烯類化合物合成相關(guān)基因及基因表達(dá)的變化模式，探討揮發(fā)性物質(zhì)與椪柑枯水的關(guān)系及其機(jī)制，對(duì)闡明椪柑枯水的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

椪柑：2015年12月于重慶市北碚區(qū)柑橘果園采收完全成熟的椪柑果實(shí)(C.reticulataBlanco cv. Ponkan)。果實(shí)在采收后迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，挑選大小、性狀和色澤一致的果實(shí)，經(jīng)咪鮮胺和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)保鮮處理后，單果用聚乙烯薄膜套袋后貯藏于冷庫(8～10 ℃)。在貯藏期間，定期取樣觀察枯水發(fā)生情況，在貯藏90 d后選擇沒有枯水癥狀的果實(shí)作為對(duì)照組，橘瓣大部分枯水的果實(shí)作為枯水樣品；

癸酸乙酯：>98%，上海西格瑪奧德里奇公司；

甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether，MTBE)：色譜純，上海西格瑪奧德里奇公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：GCMS-QP2010 plus型，日本島津制作所；

真空離心濃縮儀：ZLS-1型，湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GC-MS樣品制備 準(zhǔn)確稱取1.00 g果肉樣品，研磨成粉末。加入42.5 μg癸酸乙酯(內(nèi)標(biāo))和5 mL MTBE，充分混勻后于低溫超聲60 min[12]。將有機(jī)相進(jìn)行真空離心濃縮，然后用微孔濾膜(直徑0.22 μm)過濾，供上機(jī)分析。

1.3.2 氣相-質(zhì)譜(GC-MS)條件

(1) 氣相：DB-5MS石英毛細(xì)管柱(長(zhǎng)30 m、內(nèi)徑0.25 mm、厚0.25 μm)為色譜柱。升溫程序：以3 ℃/min升溫至50 ℃(停留1 min)，以2 ℃/min升溫至70 ℃(停留3 min)，以3 ℃/min升溫至160 ℃(停留2 min)，以8 ℃/min 升溫至220 ℃(停留2 min)；高純度氦氣作為載氣，流速為0.80 mL/min)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；采用不分流進(jìn)樣模式。

(2) 質(zhì)譜：EI源，接口溫度250 ℃，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；掃描范圍30～400 (m/z)。

1.3.3 揮發(fā)性物質(zhì)的鑒定與定量 GC-MS獲得的質(zhì)譜圖基于數(shù)據(jù)庫(NIST08和NIST08S)進(jìn)行檢索，對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行鑒定，用內(nèi)標(biāo)法對(duì)各揮發(fā)性組分進(jìn)行定量。

1.3.4 RNA-Seq分析 椪柑樣品RNA用TRIzol試劑提取。cDNA文庫用Ultra RNA Kit for Illumina試劑盒構(gòu)建。高通量測(cè)序用Illumina Hiseq完成。測(cè)序數(shù)據(jù)用TopHat v 2.0.12軟件與基因組序列進(jìn)行比對(duì)，參考基因組用Citrusclementina數(shù)據(jù)(https://www.citrusgenomedb.org/analysis/156)。用FPKM(number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced)表示基因表達(dá)水平。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

揮發(fā)性成分含量的差異顯著性用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)判斷(P<0.05)。基因表達(dá)數(shù)據(jù)的差異顯著性用校正的P值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)判斷。用Excel 2010軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 椪柑果肉揮發(fā)性物質(zhì)組分的鑒定

圖1為果肉正常果實(shí)果肉的TIC圖(總離子色譜圖)。由表1可知，本次試驗(yàn)共鑒定出13種揮發(fā)性物質(zhì)，其中7種萜烯類物質(zhì)、1種醇類物質(zhì)、3種醛類物質(zhì)和2種酯類物質(zhì)。果肉揮發(fā)性物質(zhì)組分似乎要少于果皮，本課題組用相同的GC-MS條件從椪柑果皮中鑒定了52種揮發(fā)性組分[8]；另外前人[13-14]在印度東北地區(qū)和日本高知縣的椪柑果皮中分別鑒定到37和39種揮發(fā)性組分。本研究鑒定的椪柑果肉揮發(fā)性物質(zhì)組分相對(duì)較少，可能與果皮和果肉的差異相關(guān)，因?yàn)楣び桶麑涌梢源罅亢铣芍饕煞譃閾]發(fā)性物質(zhì)的精油；另外也與椪柑果實(shí)已經(jīng)貯藏3個(gè)月有關(guān)，果實(shí)在貯藏中后期揮發(fā)性物質(zhì)含量會(huì)逐漸降低，在研究中也觀察到此時(shí)椪柑果實(shí)香氣較淡。

圖1 椪柑果肉揮發(fā)性物質(zhì)總離子色譜圖

Figure 1 Total ion current chromatogram of volatile compounds in juice sacs of Ponkan fruit

2.2 枯水對(duì)椪柑果肉揮發(fā)性物質(zhì)組分及含量的影響

由表1可知，正常和枯水椪柑果肉中的揮發(fā)性組分均為13種，組分種類完全相同，表明揮發(fā)性物質(zhì)的組成在枯水時(shí)沒有發(fā)生改變。正常椪柑果實(shí)中萜烯類物質(zhì)是最主要的揮發(fā)性物質(zhì)，其相對(duì)含量高達(dá)88%，d-檸檬烯的相對(duì)含量為75%，表明d-檸檬烯是椪柑果實(shí)中豐度最高的萜烯類揮發(fā)性物質(zhì)組分。這種揮發(fā)性物質(zhì)的組成特征在莽山野柑[6]、檸檬[15]、臍橙[8]和柚類果實(shí)[16]也有類似的報(bào)道。本研究用內(nèi)標(biāo)法對(duì)揮發(fā)性組分進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，枯水椪柑果肉的揮發(fā)性物質(zhì)總量?jī)H為正常果實(shí)的32%(P<0.05)，其中d-檸檬烯含量?jī)H為正常果實(shí)的13%(P<0.05)。13種揮發(fā)性組分中的5種在枯水時(shí)的含量有顯著性變化(P<0.05)。

2.2.1 萜烯類物質(zhì) 由表1可知，本研究共鑒定到7種萜烯類物質(zhì)，其中單萜烯類有4種，分別為水芹烯、β-月桂烯、d-檸檬烯和γ-松油烯，倍半萜烯類有3種，分別為α-古巴烯、瓦倫西亞烯和α-芹子烯。這7種萜烯類物在果肉中的相對(duì)含量在枯水時(shí)降為正常果實(shí)的22.1%(P<0.05)。其中單萜烯類物質(zhì)組分β-月桂烯、d-檸檬烯和γ-松油烯在枯水時(shí)含量顯著降低，分別為正常果實(shí)的77.3%，13.1%，41.3%，而水芹烯的含量在枯水時(shí)沒有明顯改變。倍半萜烯類物質(zhì)組分瓦倫西亞烯含量在枯水時(shí)升高為對(duì)照果實(shí)的163%(P<0.05)，而α-古巴烯和α-芹子烯的含量則沒有發(fā)生明顯改變。

表1 椪柑果肉揮發(fā)性物質(zhì)在正常果實(shí)和枯水果實(shí)中的含量?Table 1 Contents of volatile compounds in juice sacs from normal or granulated Ponkan fruit

? “*”表示差異顯著，P<0.05。

2.2.2 醇類物質(zhì)和醛類物質(zhì) 由表1可知，本研究鑒定到1種醇類物質(zhì)，即芳樟醇。芳樟醇為萜烯類衍生物，其含量在枯水時(shí)降低為正常果實(shí)的90.8%，但這種差異并不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)。本研究還鑒定并定量了3種醛類物質(zhì)，相對(duì)含量在枯水時(shí)為正常果實(shí)的110.7%，其中壬醛和檸檬醛含量分別為正常果實(shí)的70.5%和88.0%，但這種差異性并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著性(P>0.05)。十二醛相對(duì)含量在枯水時(shí)則顯著升高，變?yōu)檎９麑?shí)的146.1%(表1)。

2.2.3 酯類物質(zhì) 本研究鑒定到2種酯類物質(zhì)：乙酸香茅酯和乙酸香葉酯。這2種酯類揮發(fā)性物質(zhì)的含量在枯水時(shí)分別為對(duì)照果實(shí)的115.0%和87.9%(P>0.05)，因此酯類物質(zhì)總量在枯水沒有發(fā)生顯著性變化(見表1)。

2.3 枯水對(duì)椪柑果肉萜烯類合成途徑基因表達(dá)的影響

椪柑果肉揮發(fā)性物質(zhì)在枯水時(shí)降低為正常果實(shí)的32%，其中相對(duì)含量為88%的萜烯類物質(zhì)在枯水時(shí)降低為正常果實(shí)的22%。這意味著萜烯類物質(zhì)含量的降低是椪柑果實(shí)枯水時(shí)揮發(fā)性物質(zhì)含量減少的主要原因。為分析萜烯類化合物含量降低的原因，本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)椪柑果實(shí)枯水時(shí)基因的表達(dá)特征進(jìn)行系統(tǒng)分析，共鑒定出8個(gè)枯水特異性表達(dá)的萜烯類物質(zhì)合成途徑關(guān)鍵酶的編碼基因，表達(dá)量均顯著下降，分別是ACAT2(gene encoding acetoacetyl-CoA thiolase，乙酰乙酰輔酶A硫解酶基因)、DXR(gene encoding 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase，1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因)、HDS(gene encoding 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate synthase，4-羥基-3-甲基-2-丁烯-焦磷酸合成酶基因)、HDR(gene encoding 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase，4-羥基-3-甲基-2-鄰苯基二磷酸還原酶基因)、KAO2(gene encoding ent-kaurenoic acid hydroxylase，貝殼杉烯酸羥化酶基因)、KAO3(gene encoding ent-kaurenoic acid hydroxylase，貝殼杉烯酸羥化酶基因)、CYP82G1(gene encoding cytochrome P450 monooxygenase，細(xì)胞色素P450單加氧酶基因)、TCS(terpenoidcyclases，萜類環(huán)化酶基因)。

2.3.1 萜類骨架代謝合成途徑基因 本研究共鑒定出4個(gè)萜烯類骨架代謝合成途徑的差異表達(dá)基因，見圖2。萜烯類化合物主要通過甲羥戊酸(Mevalonate，MVA)途徑和2C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2C-methyl-D-erythritol 4-phosphate，MEP)途徑合成，異戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸酯(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)是萜烯類物質(zhì)合成的前體。本研究鑒定到基因ACAT2(CICLE_v10015452mg)，其編碼的乙酰乙酰輔酶A硫解酶負(fù)責(zé)在IPP合成途徑中將兩分子乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A。ACAT2在枯水時(shí)表達(dá)量由正常果實(shí)的61.5下降到44.9(P<0.05)。本研究鑒定到一個(gè)編碼DXR(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase，1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶)的基因DXR(CICLE_v10028082mg)，參與MEP合成途徑。DXR在枯水時(shí)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，由正常果實(shí)的207.4下降至枯水果實(shí)的99.3。HDS催化 1-羥基-2-甲基-2-丁烯-4-焦磷酸(1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl 4-diphosphate，HMBPP)的合成。本研究鑒定到一個(gè)編碼HDS的基因HDS(CICLE_v10027881mg)，表達(dá)量在枯水時(shí)顯著下調(diào)(P<0.05)，由正常果實(shí)的154.5下降至枯水果實(shí)的84.8。本研究還鑒定到HDR(CICLE_v10028384mg)，編碼的4-羥基-3-甲基-2-鄰苯基二磷酸還原酶參與催化HMBPP生成IPP的反應(yīng)。HDR在枯水時(shí)表達(dá)量由正常果實(shí)的67.9下降至52.0(P<0.05)。

2.3.2 二萜合成途徑基因 本研究共鑒定出3個(gè)二萜合成途徑中的差異表達(dá)基因，見圖3。它們分別是編碼貝殼杉烯酸羥化酶(ent-kaurenoic acid hydroxylase，KAO)和細(xì)胞色素P450單加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase，CYP82G1)的KAO2、KAO3和CYP82G1。這3個(gè)基因在枯水時(shí)均呈顯著下調(diào)的趨勢(shì)(P<0.05)，表達(dá)量從正常果實(shí)中的11.0，47.0，113.3下降為枯水果實(shí)中的4.9，27.3，48.9。

2.3.3 萜類物質(zhì)合成途徑其它基因 本研究還鑒定到編碼萜類環(huán)化酶(terpenoidcyclases，TCS)的基因TCS，見圖4。萜類環(huán)化酶又稱萜類合成酶，是一類包括單萜合成酶、倍半萜合成酶和二萜合成酶在內(nèi)的一大類酶家族。本研究鑒定的TCS在枯水表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，從正常果實(shí)中的5.8下降為枯水果實(shí)中的3.2。

圖2 萜烯類骨架代謝合成途徑基因在椪柑果肉 枯水時(shí)的表達(dá)特征

Figure 2 Changes in expression pattern of genes involved in biosynthesis pathway of terpenoid backbone in pulp of Ponkan fruit during section-drying

果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的含量與其合成和降解速度密切相關(guān)，當(dāng)合成減慢而降解加快時(shí)，總量必然減少。本研究基于以上基因表達(dá)結(jié)果得出結(jié)論：萜烯類物質(zhì)合成途徑在枯水時(shí)顯著下調(diào)，是椪柑果實(shí)香氣喪失和揮發(fā)性物質(zhì)含量降低的重要原因。本研究所鑒定的揮發(fā)性物質(zhì)組分和萜烯類合成途徑差異表達(dá)基因的數(shù)量分別為13種和8個(gè)，數(shù)量較少。這可能與試驗(yàn)樣品有關(guān)，果實(shí)已經(jīng)貯藏3個(gè)月，香味偏淡，如果比較分析貯藏前與貯藏后的果實(shí)，可能會(huì)鑒定到更多的揮發(fā)性物質(zhì)種類和萜烯合成相關(guān)的差異表達(dá)基因。本研究的結(jié)果基于貯藏后的正常和枯水果之間的比較，在以后研究中可對(duì)果實(shí)內(nèi)部正常汁胞和枯水汁胞進(jìn)行比較，結(jié)果能更好地反映枯水時(shí)的生理狀態(tài)[17]。

圖3 二萜合成途徑相關(guān)基因在椪柑果肉枯水時(shí)的表達(dá)特征

Figure 3 Changes in expression pattern of genes involved in biosynthesis pathway of diterpenoid in pulp of Ponkan fruit during section-drying

圖4 萜類環(huán)化酶基因在椪柑果肉枯水時(shí)的表達(dá)特征

Figure 4 Change in expression pattern of gene encoding terpenoidcyclases (TCS) in pulp of Ponkan fruit during section-drying

本研究結(jié)果為后續(xù)深入研究椪柑果實(shí)的枯水機(jī)制提供了新的思路。一方面，可以從揮發(fā)性物質(zhì)合成途徑的相關(guān)基因入手，探討其在枯水時(shí)表達(dá)量下降的調(diào)控機(jī)制，可以利用酵母單雜交技術(shù)篩選上游轉(zhuǎn)錄因子，最終解析枯水時(shí)揮發(fā)性物質(zhì)合成的分子機(jī)制。另一方面，借助高通量代謝組學(xué)技術(shù)[18]，高通量測(cè)序技術(shù)[19]、鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)[20]等，分析不同椪柑種類中不同枯水程度的汁胞揮發(fā)性物質(zhì)的變化規(guī)律、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的動(dòng)態(tài)變化模式，在組學(xué)水平分析椪柑枯水的分子網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控機(jī)制。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)枯水與正常椪柑果實(shí)相比，果肉揮發(fā)性物質(zhì)的含量顯著降低，但是組分種類沒有變化?；虮磉_(dá)分析的結(jié)果表明萜烯類化合物合成的相關(guān)基因(ACAT2、DXR、HDS、HDR、KAO2、KAO3、CYP82G1、TCS)在枯水時(shí)表達(dá)量下調(diào)，意味著萜烯類物質(zhì)的合成在枯水時(shí)受到抑制，這是椪柑枯水時(shí)揮發(fā)性物質(zhì)降低的重要原因。本研究揭示了柑橘果肉揮發(fā)性物質(zhì)在枯水時(shí)的降解特征，并分析萜烯類物質(zhì)代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)特征，初步闡明了椪柑枯水時(shí)揮發(fā)性物質(zhì)降低的生物學(xué)機(jī)制。萜烯類合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)在枯水時(shí)為何下降，目前還不清楚，對(duì)其調(diào)控機(jī)制的研究是未來的重點(diǎn)。

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