黃小梅，孫 龍，吳孝兵

1皖南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，安徽蕪湖 241000 2安徽師范大學(xué)生命科學(xué)院安徽省重要生物資源保護和利用重點實驗室，安徽蕪湖 241000

ActaAcadMedSin，2018,40(2)：201-210

胃蛋白酶原是胃蛋白酶的前體，由成年脊椎動物胃黏膜中的主細(xì)胞合成、分泌，在胃腔中胃液的酸性條件下，自動水解形成有活性的胃蛋白酶。胃蛋白酶是胃的一種具有消化功能的蛋白酶，其活性部位具有兩個天冬氨酸殘基，屬于天冬氨酸蛋白酶家族[1]。運用一些分離技術(shù)(如硫酸銨分餾法)可以從胃黏膜中分離胃蛋白酶原，從胃液中純化胃蛋白酶[2]。胃蛋白酶原和胃蛋白酶的蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能均有研究[3- 5]。胃蛋白酶原用于觀察胃上皮細(xì)胞發(fā)育[6]，并作為胃疾病尤其胃癌診斷的分子標(biāo)記[7- 8]。目前，在哺乳動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)5種類型的胃蛋白酶原：胃蛋白酶原A、胃蛋白酶原B、胃蛋白酶原C(前胃亞蛋白酶)、胃蛋白酶原F和胃蛋白酶原Y(凝乳酶原)[9]。揚子鱷(Alligator sinensis)隸屬爬行綱鱷目，是我國特有的珍稀爬行動物，揚子鱷穴居池沼，為一種兇猛的肉食性動物，研究其消化酶的結(jié)構(gòu)和消化生理功能，為其今后配合飼料的研制提供科學(xué)依據(jù)，具有重要的生態(tài)價值和經(jīng)濟價值。國內(nèi)學(xué)者對揚子鱷消化系統(tǒng)組織結(jié)構(gòu)和酶的組織化學(xué)定位已有一些研究[10- 11]。然而，有關(guān)揚子鱷胃蛋白酶原的基因結(jié)構(gòu)及分子特征等方面報道較少。本研究通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR) 和cDNA末端快速擴增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)，從揚子鱷胃黏膜組織中克隆一種編碼胃蛋白酶原C(pepsinogen C，PGC)的基因序列，并利用生物信息學(xué)相關(guān)網(wǎng)站及軟件，對其蛋白序列進行相似性比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；采用同源建模法，建立該胃蛋白酶原的三維結(jié)構(gòu)模型，預(yù)測其活性位點；應(yīng)用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)和實時定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)法對該揚子鱷PGC的定位、定量表達進行分析；為進一步研究揚子鱷胃蛋白酶原的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

實驗動物2015至2016年1、3、5、7、9、11月共采集12條成年揚子鱷，取自安徽宣城揚子鱷養(yǎng)殖中心。待工作人員屠宰完成后，取出完整內(nèi)臟，立即按下列 8個部位取材：食道、胃體、十二指腸、直腸、肝、胰腺、卵巢和皮膚。生理鹽水快速洗凈，一部分組織剪碎保存于RNA樣品儲存液，放置于-80℃?zhèn)溆茫灰徊糠至羧〗M織塊，大小2.5 cm×2.0 cm，依其體積大小浸入4%多聚甲醛液中充分固定約8 h/cm3，梯度濃度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，切片厚約5 μm，用于HE和IHC染色。

主要試劑瓊脂糖凝膠回收試劑盒及E.coliDH5α購于天根生物有限公司；Taq DNA聚合酶、RACE cDNA 擴增試劑盒購自生工生物工程(上海)技術(shù)服務(wù)有限公司；總RNA抽取試劑盒和cDNA單鏈合成試劑盒、pMD18-T載體試劑盒均由Takara公司生產(chǎn)。濃縮型PGC兔單抗、濃縮型SP免疫組織化學(xué)試劑盒和抗體稀釋液均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。Trizol、定量PCR用cDNA單鏈合成試劑盒、SYBR Green定量PCR試劑盒、PCR八連管均購自寶生物工程(大連)公司；BIO-RAD CFXTM熒光定量PCR儀借用公共實驗室儀器。

胃總RNA提取活體解剖揚子鱷，取10～20 mg胃黏膜組織于1.5 ml不含RNA水解酶的離心管中，用Trizol試劑盒提取總RNA，所有操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank上預(yù)測的鱷類胃蛋白酶原C基因序列，設(shè)計了1對用于PCR擴增部分序列的引物(F和R)，3條特異性5’RACE引物(5’-GSP1、5’-GSP2和5’-GSP3)，兩條特異性3’RACE引物(3’-GSP1和3’-GSP2)，以及qPCR引物(PGCF和PGCR)。內(nèi)參核糖體蛋白L8[12]引物(RPL8F和RPL8R)。所有引物(表1)均由生工生物工程(上海)技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

RT-PCR及5’，3’-RACE擴增按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的方法合成cDNA作為PCR擴增模板。PCR反應(yīng)體系(30 μl)：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 1.0 μl，3.0 μl 10× PCR Buffer，2.0 μl MgCl2，2.0 μl dNTP，1.0 μl各種引物，1.0 μl Taq DNA聚合酶和19.0 μl ddH2O；PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，然后進入32個循環(huán)：95℃變性40 s，55℃退火50 s，72℃延伸50 s；最后72℃延伸10 min。5’-RACE和3’-RACE使用SMARTerTMRACE cDNA 擴增試劑盒，具體步驟按試劑盒說明書進行，PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR產(chǎn)物克隆及測序?qū)⒁陨?RT-PCR 產(chǎn)物、5’-RACE和 3’-RACE 擴增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，對目的條帶進行切膠回收純化，純化后的DNA片段與載體pMD18-T進行連接構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α，經(jīng)LB 平板(含氨芐西林、異丙基硫代半乳糖苷和二甲基甲酰胺溶液)培養(yǎng)后，篩選重組子進行插入片段檢測。序列測定由生工生物工程(上海)技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

生物信息學(xué)分析應(yīng)用DNASTAR軟件EditSeq程序進行開放閱讀框分析并將其推導(dǎo)為相應(yīng)的氨基酸序列；通過NCBI(http：//www.ncbi.nlm.gov)BLASTX進行cDNA和蛋白質(zhì)序列相似性檢索；氨基酸序列比對應(yīng)用GeneDoc軟件及Clustal W(http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html)進行分析；使用ProtParam(http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html)預(yù)測蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、等電點等理化參數(shù)和基本性質(zhì)分析；信號肽分析利用Signal P 3.0 server 程序(http：//www.cbs.dtu.dk/service/SignalP)；使用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化N-J樹；利用基于 SWISS-MODEL 服務(wù)器(http：//www.swissmodel.expasy.org/)的同源建模法[13]，構(gòu)建揚子鱷胃蛋白酶的三級結(jié)構(gòu)模型，利用PyMol軟件對模型進行相關(guān)分析及顯示。

表 1 揚子鱷胃蛋白酶原C基因PCR擴增所用引物Table 1 Primers used for PCR amplification of the pepsinogen C gene of Alligator sinensis

RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)；RACE：cDNA末端快速擴增；qPCR：實時定量聚合酶鏈反應(yīng)

RT-PCR：reverse transcription-polymerase chain reaction；RACE：rapid amplification of cDNA ends；qPCR：quantitative real-time polymerase chain reaction

HE與IHC取7月成年揚子鱷食道、胃體、十二指腸、直腸、肝、胰腺、卵巢和皮膚組織蠟塊，5 μm厚切片，每個標(biāo)本切3張，1張用于常規(guī)HE染色，2張用于免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)采用SP法，具體操作按試劑盒說明書進行。用磷酸鹽緩沖溶液替代一抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。在Olympus 顯微鏡下觀察并攝片。

統(tǒng)計學(xué)處理采用Excel建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 16.0軟件包統(tǒng)計處理，計數(shù)資料采用率和構(gòu)成比表示，計量資料采用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。

結(jié) 果

揚子鱷PGC基因cDNA部分序列的合成從揚子鱷胃組織中提取總RNA后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色顯示28s和18s rRNA條帶清晰，說明所提取的總RNA完整性良好，可作為RT-PCR的模板。以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，利用上游引物F和下游引物R進行PCR擴增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在750～1000 bp有一條明顯的目的條帶，與預(yù)期的片段長度大小相符。測序得到一個長度為874 bp的序列。通過 NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)BLAST進行DNA 序列相似性搜索，結(jié)果表明該序列與密河鱷、灣鱷胃蛋白酶或酶原DNA序列相似性分別為98%、91%，故可推測該序列為揚子鱷胃蛋白酶原cDNA部分序列。

揚子鱷PGC基因cDNA全長序列的獲得和分析利用特異性5’-RACE引物進行5’端巢式擴增，電泳在250～500 bp有一條明顯的目的條帶，與預(yù)期大小相符，測序得到一個長度為347 bp的序列(圖1A)。同樣以通用引物和特異性3’-RACE引物進行3’端擴增，測序得到一個長度為679 bp的序列(圖1B)。

根據(jù)RT-PCR和RACE結(jié)果，獲得揚子鱷PGC基因cDNA全長序列。通過NCBI比對分析預(yù)測出該基因的起始密碼子ATG和終止密碼子TGA位置。應(yīng)用DNASTAR軟件EditSeq程序進行開放閱讀框分析并將其推導(dǎo)為相應(yīng)的氨基酸序列，結(jié)果表明揚子鱷PGC基因cDNA序列全長1568 bp，包含編碼 388個氨基酸殘基的1167 bp開放閱讀框，5’端非翻譯區(qū)79 bp，3’端非翻譯區(qū)322 bp，在多聚腺苷酸尾上游81 bp處存在加尾信號序列AATAAA(圖2)。將該序列遞交GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為KY799383。

揚子鱷PGC蛋白的理化參數(shù)及其結(jié)構(gòu)預(yù)測利用ProtParam預(yù)測揚子鱷PGC的理化性質(zhì)，推測該蛋白的分子式為 C1887H2845N465O590S16，相對分子質(zhì)量為41 998，理論等電點為4.16，理論半衰期大于 10 h，不穩(wěn)定參數(shù)為43.37，屬于不穩(wěn)定蛋白。信號肽分析結(jié)果表明第1～16個氨基酸為揚子鱷PGC信號肽序列。采用CFSSP工具(http：//www.biogem.org/tool/chou-fasman)預(yù)測該蛋白二級結(jié)構(gòu)中包含α螺旋、延伸帶和隨機卷曲3種形式，分別占46.9%、54.9%和12.9%。

M：DNA marker；1：RACE產(chǎn)物

M：DNA marker；1：RACE products

圖15’-RACE(A)和3’-RACE(B)產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖

Fig11.0% agarose gel electrophoresis of 5’-RACE(A) and 3’-RACE(B) products

PGC：胃蛋白酶原C；小寫字母代表3’、5’端非翻譯區(qū)；大寫字母部分為編碼區(qū)，上排為核苷酸序列，下排為氨基酸序列；下劃線區(qū)域為信號肽；★表示終止密碼子；多聚核苷酸加尾信號(AATAAA)用細(xì)線框標(biāo)出；活性部位的天冬氨酸殘基(D90、D275)用細(xì)線圓框標(biāo)出；形成3個二硫鍵的6個半胱氨酸殘基(C103、C108、C266、C270、C309、C343)用粗線方框標(biāo)出

PGC：pepsinogen C；3’-，5’-untranslated regions are shown as lowercases；coding region is shown as uppercases，where the upper sequence indicates the nucleotide and the lower shows the amino acids;the region of putative signal peptide is underlined;a sterisk(★) indicates stop codon;putative polyadenylation signal(AATAAA) is marked with a thin line box;two aspartic acid residues associated with the active site motifs(D90，D275) are marked with a thin round frame;the six cysteine residues(C103，C108，C266，C270，C309，and C343) involved in forming three disulphide bonds characteristic of pepsinogen are indicated with a box of rough lines

圖2揚子鱷PGC的cDNA序列及氨基酸序列

Fig2The cDNA sequences and deduced amnio acid sequences of PGC ofAlligatorsinensis

根據(jù)豬的胃蛋白酶原(蛋白數(shù)據(jù)庫PDB編碼為2PSG)的三級結(jié)構(gòu)即模板蛋白(圖3A)，利用 Swiss PdbViewer軟件和 SWISS-MODEL 服務(wù)器構(gòu)建揚子鱷PGC的三級結(jié)構(gòu)模型(圖3B)，結(jié)果表明所預(yù)測的揚子鱷PGC三級結(jié)構(gòu)與模板蛋白非常相似，利用PyMol軟件對模型進行相關(guān)分析，推測揚子鱷PGC的催化位點由Asp90和Asp2752個天冬氨酸殘基組成；維持其空間結(jié)構(gòu)的3個二硫鍵分別由Cys103和Cys108、Cys266和Cys270、Cys309和Cys343共6個半胱氨酸殘基形成(圖3B)。

基于脊椎動物PGC氨基酸序列同源性比對及系統(tǒng)進化關(guān)系分析從NCBI網(wǎng)站上搜索下載其他脊椎動物的PGC氨基酸序列，通過GeneDoc、Clustal X軟件對不同物種的PGC氨基酸序列進行相似性比對,結(jié)果表明獲得的序列與密河鱷PGC的相似性為98%，與灣鱷PGC的相似性為90%，與紅邊束帶蛇PGC的相似性為55%；而與其他脊椎動物(如爬行類、鳥類、魚類、哺乳類、兩棲類)等PGC的相似性在51%～78%(表2、圖4)。

Asp：天冬氨酸；Cys：半胱氨酸

Asp：aspartic acid；Cys：cysteine

圖3根據(jù)2PSG蛋白三級結(jié)構(gòu)(A)為模板構(gòu)建揚子鱷PGC三級結(jié)構(gòu)模型(B)

Fig3The predicted three-dimensional structure of the PGC fromAlligatorsinensis(B) with the three-dimensional structure of 2PSG as a template(A)

表 2 揚子鱷與GenBank中其他物種PGC氨基酸序列的同源性比對Table 2 Homology of the amino acid sequence of Alligator sinensis pepsinogen C to those of other organisms in GenBank

*代表絕對保守的氨基酸殘基；：和.分別表示高度保守和低度保守的氨基酸殘基；活性部位的天冬氨酸殘基用方框標(biāo)出；形成3個二硫鍵的6個半胱氨酸殘基用灰色背景標(biāo)出

*indicates the conserved residues;amnio acid subsititution leading to strong or no conservation of physiology chemical properties are indicated by：and.;two aspartic acid residues associated with the active site motifs are marked with a box;the six cysteine residues involved in forming three disulphide bonds characteristic of pepsinogen are indicated with a gray background

圖4不同物種PGC cDNA 編碼的氨基酸序列比對

Fig4Comparative analysis of putative amino acid sequences of PGC cDNA in different species

使用MEGA6軟件鄰位相連法對不同物種的PGC氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖5)。用Bootstrap方法對構(gòu)建的鄰接樹進行評估，參數(shù)設(shè)置如下：random number generator seed：111；number of bootsrap trials：1000。結(jié)果顯示揚子鱷與密河鱷緊密聚為一支，再與其他鱷類聚在一起，然后與鳥類形成姐妹群(圖5)。

揚子鱷PGC基因定位表達情況7月成年揚子鱷食道、胃體、十二指腸、直腸、肝、胰腺、卵巢和皮膚組織均進行了HE及IHC染色，結(jié)果顯示只在胃黏膜組織中檢測到PGC陽性反應(yīng)，即在胃黏膜固有腺體上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色顆粒(圖6)。

用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，節(jié)點旁數(shù)據(jù)為鄰位相連法分析1000次bootstrap檢查后的置信度；比例尺等于Kimura雙參數(shù)距離的0.05(鄰位相連)單位

Phylogenies were determined with MEGA 6 software by bootstrap analysis using neighbor-joining(1000 replicates)；scale bar equals 0.05(neighbor-joining) unit of Kimura’s two-parameter distance

圖5基于脊椎動物PGC氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹(鄰位相連法)

Fig5Rooted the neighbor-joining tree based on the amino acid sequences of PGC from the vertebrates

A.胃黏膜組織(HE，×400)；B.胃黏膜組織PGC呈陽性(免疫組織化學(xué)染色，×400)

A.gastric mucosa tissue(HE，×400)；B.gastric mucosa was positive for PGC(immunohistochemical staining，×400)

圖6PGC在揚子鱷胃組織中的分布

Fig6The location of PGC in the stomach tissues ofAlligatorsinensis

揚子鱷PGC基因定量表達水平

組織特異性表達水平：以核糖體L8為參比基因?qū)悠愤M行RNA量校正，以食道為控制參量，分別對7月來源于同一條鱷的食道、胃體、十二指腸、直腸、肝、胰腺、卵巢與皮膚共8種組織進行qPCR，3次重復(fù)，實時定量PCR結(jié)果，7月成年揚子鱷不同組織中，PGC mRNA存在組織表達差異(圖7)。結(jié)果表明同一月食道、胃體、十二指腸、直腸、肝、胰腺、卵巢和皮膚共8種組織中，胃的表達水平最高，其余幾個器官均無表達(圖7)。

生長周期特異性表達水平：以核糖體蛋白L8為參比基因?qū)悠愤M行RNA量校正，1月胃為控制參量，分別取各月胃組織進行qPCR，3次重復(fù)。實時定量PCR結(jié)果顯示，不同月成年揚子鱷胃組織中，PGC mRNA存在時期表達差異(F=35.95，P<0.05)(圖8)。經(jīng)LSD法兩兩比較分析顯示7月胃中PGC的表達量最高，其次是9月，1、3、5和11月PGC mRNA表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖8)。

圖7實時定量PCR方法檢測成年揚子鱷不同組織PGC mRNA的表達

Fig7PGC mRNA expression in various tissues ofAlligatorsinensisby quantitative real-time polymerase chain reaction

與1、3、5、11月比較，aP<0.05

aP<0.05 compared with data in January，March，May，and November

圖8實時定量PCR方法檢測不同生長周期揚子鱷胃組織PGC mRNA的表達

Fig8The mRNA levels of PGC in the stomach ofAlligatorsinensisat different life stages by quantitative real-time polymerase chain reaction

討 論

目前，在哺乳動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)5種類型的胃蛋白酶原：胃蛋白酶原A、胃蛋白酶原B、胃蛋白酶原C(前胃亞蛋白酶)、胃蛋白酶原F和胃蛋白酶原Y(凝乳酶原)[9]。胃蛋白酶原的多樣性在很多脊椎動物中已經(jīng)得到了證實。最早在1970年，人們在豬胃組織中發(fā)現(xiàn)了4種胃蛋白酶原：胃蛋白酶原A、胃蛋白酶原B、胃蛋白酶原C和胃蛋白酶原Y[14]。隨后在人的胃中發(fā)現(xiàn)了3種胃蛋白酶原：胃蛋白酶原A、胃蛋白酶原C和胃蛋白酶原Y[15- 17]。Gildberg等[18]、Tanji等[19]、Douglas等[20]、Bobe 和 Goetz[21]分別在鱈、金槍魚、美洲黃蓋鰈、美洲紅點鮭有胃真骨魚類中發(fā)現(xiàn)有多種形式的胃蛋白酶原。本研究運用RACE法快速擴增，首次從揚子鱷胃黏膜中克隆并獲得了一條長1568 bp的揚子鱷PGC基因cDNA全長序列，開放閱讀框長1167 bp，編碼388 個氨基酸；遞交GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為KY799383。在揚子鱷胃組織中是否存在多種胃蛋白酶原，有待進一步研究。

為了獲得揚子鱷PGC結(jié)構(gòu)與功能的信息，本研究利用相關(guān)生物信息學(xué)軟件預(yù)測揚子鱷PGC的相對分子質(zhì)量為41 998，理論等電點為4.16等理化參數(shù)；還利用已經(jīng)純化的豬胃蛋白酶原[13](PDB編碼為2PSG)的三級結(jié)構(gòu)為模板，構(gòu)建了揚子鱷PGC的三級結(jié)構(gòu)模型，推測揚子鱷PGC蛋白的催化活性中心由2個天冬氨酸殘基Asp90和Asp275組成，而Cys103和Cys108、Cys266和Cys270、Cys309和Cys343形成的3個二硫鍵，可能對該蛋白的正常折疊、蛋白質(zhì)構(gòu)象的確定、空間結(jié)構(gòu)的維持以及有效生理功能的發(fā)揮等有重要作用。這些結(jié)果為深入研究揚子鱷胃蛋白酶原結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供了有用的數(shù)據(jù)。

本研究獲得的揚子鱷PGC氨基酸序列，與GenBank中其他物種PGC氨基酸序列進行同源性比對，并構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹。從基于PGC氨基酸序列系統(tǒng)進化鄰接樹圖中可以看出，脊椎動物PGC系統(tǒng)進化樹基本上遵循傳統(tǒng)進化分類，脊椎動物中魚綱、鳥綱、爬行綱、哺乳綱和兩棲綱分別聚成相近的進化分支，只是在個別目上存在特殊分支；揚子鱷與密河鱷親緣關(guān)系最近，再與其他鱷類聚在一起，然后與鳥類形成姐妹群。本研究中的鱷類、鳥類及其他爬行類的PGC進化關(guān)系，與傳統(tǒng)分類學(xué)存在分歧，傳統(tǒng)分類學(xué)認(rèn)為鱷類屬于爬行綱，與其他爬行類的親緣關(guān)系相對更近，而基于PGC氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹卻發(fā)現(xiàn)，鱷類先與鳥類聚到一起，再與其他爬行類相聚，即鱷類相對于爬行類與鳥類親緣關(guān)系更近。這個結(jié)果與現(xiàn)在從分子生物學(xué)角度探討系統(tǒng)進化關(guān)系所得結(jié)果一致[22- 25]。

胃蛋白酶原主要分布在胃，但也有報道胃蛋白酶原在其他器官中表達。例如，Bobe 和Goetz[21]發(fā)現(xiàn)美洲紅點鮭的多種胃蛋白酶原不僅在胃中表達，而且在卵巢中也有表達。Kurokawa等[26]在沒有胃的紅鰭東方鲀中發(fā)現(xiàn)了一種胃蛋白酶原mRNA 不在消化器官表達，而是在皮膚組織表達。Inokuchi等[27]和Yakabe等[28]發(fā)現(xiàn)牛蛙的胃蛋白酶原不僅在胃，還存在于食管組織中。本研究對成年揚子鱷食道、胃體、十二指腸、直腸、肝、胰腺、卵巢和皮膚組織分別進行了IHC染色和qPCR檢測，結(jié)果均表明PGC特異性地分布于胃黏膜組織。PGC mRNA組織特異性表達情況可能與組織特異性功能有關(guān)。

本研究用qPCR檢測不同月(1、3、5、7、9、11月)成年揚子鱷胃組織中PGC mRNA的表達情況，結(jié)果顯示PGC mRNA在7月胃中的表達量最高，其次是9月胃，其余幾個月胃的PGC mRNA表達量低且差異無統(tǒng)計學(xué)意義。筆者推測得到這個結(jié)果的可能原因如下：1月為揚子鱷的冬眠期，3月處于冬眠后期、5月處于產(chǎn)卵前期、7月處于產(chǎn)卵期、9月處于產(chǎn)卵后期、11月份處于冬眠前期。PGC的表達量與揚子鱷的不同生產(chǎn)生活狀況所需蛋白質(zhì)的量不同密切相關(guān)，在產(chǎn)卵期前后都有所降低，只在產(chǎn)卵期升高，在冬眠前后期較產(chǎn)卵前后期更低。7月處于揚子鱷的產(chǎn)卵期，此生殖活動需要大量食物供應(yīng)能量和營養(yǎng)，胃蛋白酶分泌增多，胃蛋白酶原在胃組織中表達量相應(yīng)增加。11月和3月分別處于冬眠前期和冬眠后期，體內(nèi)新陳代謝速率明顯低于其他月，能量的產(chǎn)生與新陳代謝速率同步，這時能量限制會自動調(diào)整調(diào)節(jié)蛋白mRNA的表達[29]，進一步調(diào)整蛋白的含量。揚子鱷的不同生產(chǎn)生活狀況下，胃蛋白酶原C的表達量不同，其調(diào)節(jié)機制尚不清楚。

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