條件培養(yǎng)基對(duì)氧—葡萄糖剝奪誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元死亡的保護(hù)作用

張鵬 張鵬飛 高琛

【摘要】 目的 研究臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源條件培養(yǎng)基（CM）對(duì)氧-葡萄糖剝奪（OGD）誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元死亡的保護(hù)作用。方法 培養(yǎng) 10 d的皮層神經(jīng)元更換培養(yǎng)基為 EBSS平衡鹽溶液， 后置于37℃低氧（N2∶CO2∶O2=94%∶5%∶1%）培養(yǎng)箱內(nèi)孵育， 4 h后恢復(fù)正常條件培養(yǎng)， 同時(shí)更換為條件培養(yǎng)基作用20 h，

用Hoechst33342 / PI 的染色方法檢測(cè)其死亡情況。結(jié)果 原代培養(yǎng)的 UCMSCs 傳至第三代時(shí)， 細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形的纖維狀， 折光性好;在培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元建立OGD模型， Control組細(xì)胞死亡率為（5.85%±0.41）%， OGD組細(xì)胞死亡率（35.6%±1.75）%， Control組與OGD組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）， OGD模型建立成功;復(fù)氧0 h時(shí)給予臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源條件培養(yǎng)基， 作用24 h后， OGD+CM組細(xì)胞死亡率為（27.98±2.19）%， OGD+CM組與OGD組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）， CM可使皮層神經(jīng)元的死亡率降低21.40%。結(jié)論 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源條件培養(yǎng)基對(duì)氧-葡萄糖剝奪誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元具有保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】 氧-葡萄糖剝奪模型;間充質(zhì)干細(xì)胞;條件培養(yǎng)基;皮層神經(jīng)元

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.12.120

缺血性腦卒中是因各種原因?qū)е麓竽X供血不足， 從而引起腦組織壞死的總稱(chēng)， 具有發(fā)病率高、致死率高和致殘率高的特點(diǎn)。氧-葡萄糖剝奪（Oxygen-Glucose Deprivation， OGD）模型是最常用的缺血性腦卒中的體外模型， 能夠在體外很好的模擬腦卒中的病理狀態(tài)。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells， UCMSCs）來(lái)源于中胚層間充質(zhì)的成體干細(xì)胞， 具有易于獲取， 無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議， 增殖能力較強(qiáng)， 易于體內(nèi)外擴(kuò)增等特性， 成為臨床干細(xì)胞移植的重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象， 然而無(wú)論通過(guò)何種途徑輸入體內(nèi)， 到達(dá)靶器官的細(xì)胞數(shù)量、狀態(tài)及存活時(shí)間尚無(wú)足夠的研究證實(shí)， 而間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)旁分泌途徑分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Basic Fibroblast Growth Factor， bFGF）等大量生物活性物質(zhì)[1， 2]， 近年亦有研究報(bào)道間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell， MSCs）衍生的胞外囊泡可參與細(xì)胞間傳遞、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)以及在體內(nèi)短距離或長(zhǎng)距離運(yùn)輸以改變細(xì)胞或組織的代謝[3]， 因此， 嘗試使用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的條件培養(yǎng)基（Condition Medium， CM）進(jìn)行研究， 觀察其保護(hù)神經(jīng)元的作用。

目前應(yīng)用細(xì)胞模型研究條件培養(yǎng)基保護(hù)OGD中神經(jīng)元死亡的相關(guān)研究較少， 本實(shí)驗(yàn)制備臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源條件培養(yǎng)基， 其中含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的大量細(xì)胞因子成份， 在體外細(xì)胞培養(yǎng)模型中研究其對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用， 從而為缺血性腦血管病的臨床治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)與條件培養(yǎng)基的獲取

UCMSCs的原代分離培養(yǎng)：將無(wú)菌條件下獲取的臍帶組織用無(wú)菌磷酸緩沖液（PBS）沖洗多次， 至無(wú)血跡殘留;仔細(xì)剔除臍帶內(nèi)血管與表面組織;將組織剪碎， 加入Ⅳ型膠原酶，

37℃消化17～20 h， 期間不時(shí)搖晃;再用40 ?m篩網(wǎng)過(guò)濾， 去除較大組織塊;2000 r/min， 離心5 min， 棄去上清， 將沉淀用無(wú)菌PBS清洗2～3次;1000 r/min， 離心5 min， 接種。用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸離心管中的細(xì)胞， 鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)， 使細(xì)胞密度達(dá)到1×106個(gè)/ml， CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 換液， 將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不斷傳代、純化， 得到UCMSCs。

UCMSC-CM的收集：純化后的UCMSCs， 收集每次換液的培養(yǎng)基， 經(jīng)1500 r/min離心去除細(xì)胞碎片后， 放置在-80℃冰箱保存。

1. 2 Elisa檢測(cè)條件培養(yǎng)基中細(xì)胞因子 向96孔板加入100 μl 1×稀釋液， 作為陰性對(duì)照。同時(shí)加入所測(cè)因子的標(biāo)準(zhǔn)品100 μl到96孔板， 然后將所測(cè)樣品100 μl加到96孔板， 每個(gè)樣品2個(gè)微孔， 室溫下避光孵育2 h。孵育結(jié)束后向每個(gè)微孔加入200 μl酶標(biāo)檢測(cè)抗體， 室溫下孵育2 h。然后用400 μl l×沖洗液洗滌， 最后加入200 μl顯色底物（顯色劑A和顯色劑B各100 μl）， 室溫下孵育30 min， 然后加入50 μl終止液， 用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值）， 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中生長(zhǎng)因子的含量。計(jì)算神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-I（IGF-1）、VEGF、bFGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的濃度。每個(gè)樣品重復(fù)4次， 每組取3個(gè)樣品。

1. 3 OGD的構(gòu)建 取培養(yǎng)至10 d的皮層神經(jīng)元， 用無(wú)糖EBSS漂洗 1 次， 將細(xì)胞培養(yǎng)基置換為無(wú)糖EBSS， 原培養(yǎng)液留至復(fù)氧后繼續(xù)使用。于缺氧孵箱（ 94% N2， 1% O2， 5% CO2， 37℃）缺氧 4 h后更換為正常培養(yǎng)基復(fù)氧， 繼續(xù)培養(yǎng)20 h進(jìn)行檢測(cè)。

1. 4 皮層神經(jīng)元死亡的檢測(cè) 向OGD成功后的皮層神經(jīng)元培養(yǎng)液內(nèi)直接加入 Hoechst33342（sigma， 10 μg/ml）， 37℃作用 10 min， 再加入PI（sigma， 5 μg/ml） 37℃作用5 min ， 在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞死亡情況并拍照計(jì)數(shù)。Hoechst33342 標(biāo)記活細(xì)胞及凋亡早期的細(xì)胞， PI標(biāo)記的為壞死細(xì)胞及凋亡晚期細(xì)胞， 細(xì)胞死亡率= PI 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 原代培養(yǎng)的UCMSC-CM中細(xì)胞因子含量的檢測(cè)結(jié)果

原代培養(yǎng)的UCMSCs 傳至第三代時(shí)， 細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形的纖維狀， 折光性好。見(jiàn)圖1。用Elisa法測(cè)定CM內(nèi)多種細(xì)胞因子BDNF、IGF-1、VEGF、bFGF、TGF-β、HGF、IL-6的含量。見(jiàn)表1。從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看， CM中含豐富的BDNF

（220.68±16.80）pg/ml、IGF-1（14.71±1.12）pg/ml、bFGF（16.27±2.89）pg/ml、VEGF（68.53±1.85）pg/ml、TGF-β（73.56±5.59）pg/ml、HGF（116.05±3.32）pg/ml、IL-6（89.48±6.27）pg/ml等多種細(xì)胞因子。

2. 2 條件培養(yǎng)基對(duì)OGD的皮層神經(jīng)元死亡的影響 在培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元建立OGD 模型。見(jiàn)圖2。Control組細(xì)胞死亡率為（5.85±0.41）%， OGD 組細(xì)胞死亡率為（35.6±1.75）%。Control組與OGD組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）， OGD模型建立成功。復(fù)氧0 h時(shí)給予臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源條件培養(yǎng)基， 作用24 h后， 與OGD組進(jìn)行比較， OGD+CM組細(xì)胞死亡率為（27.98±2.19）%， OGD+CM組與 OGD組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）， CM可使皮層神經(jīng)元的死亡率降低21.40%。

3 討論

隨著缺血性腦卒中發(fā)病率越來(lái)越高， 給人類(lèi)健康帶來(lái)了嚴(yán)重威脅， 迫切需要新的有效治療手段的出現(xiàn)。間充質(zhì)干細(xì)胞由于其體外易于獲取， 無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議， 增殖能力較強(qiáng)， 易于體內(nèi)外擴(kuò)增等特性， 常被用于細(xì)胞移植的臨床試驗(yàn)， 目前可從www.clinicaltrials.gov網(wǎng)站上查詢(xún)到的使用間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床試驗(yàn)有600余例。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明， 間充質(zhì)干細(xì)胞可用于治療基于動(dòng)物模型的多種疾病， 并具有很好的安全性， 間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)釋放多種細(xì)胞因子促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)、血管的再生， 促進(jìn)突觸聯(lián)系、髓鞘的再生， 并可抑制細(xì)胞凋亡， 調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[4-6]。既往對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的研究側(cè)重于細(xì)胞的分化替代功能， 很少關(guān)注其旁分泌現(xiàn)象， 本實(shí)驗(yàn)選用間充質(zhì)干細(xì)胞源的條件培養(yǎng)基作用于OGD模型中的皮層神經(jīng)元， 觀察其對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用， 以此證實(shí)條件培養(yǎng)基對(duì)缺血性腦卒中的治療作用， 具有一定的創(chuàng)新性。

大量研究報(bào)道間充質(zhì)源條件培養(yǎng)基對(duì)疾病模型具有與MSC類(lèi)似的作用， Markovic等[7]認(rèn)為MSC-CM通過(guò)抑制免疫細(xì)胞的介入從而減輕順鉑誘導(dǎo)的腎毒性;Shen等[8]通過(guò)大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究， 表明UCMSC可分泌多種可溶性的細(xì)胞因子與趨化因子至CM中， 增強(qiáng)CXCR4或CCR2陽(yáng)性細(xì)胞的遷移與血管形成能力;Li等[9]認(rèn)為MSC-CM可明顯改善角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖與遷移能力。缺血性腦卒中發(fā)生時(shí)， 由于血供突然中斷， 氧氣、葡萄糖供給急劇下降， 使該部位腦組織崩解破壞， 興奮性氨基酸大量釋放， 神經(jīng)元內(nèi)鈣超載， 導(dǎo)致神經(jīng)元損傷;同時(shí)， 自由基的大量產(chǎn)生以及與凋亡相關(guān)基因的表達(dá)和炎癥反應(yīng)的發(fā)生， 進(jìn)一步加劇神經(jīng)元的損傷[10-13]。

本研究中， 運(yùn)用預(yù)存的神經(jīng)元培養(yǎng)液和適量的新鮮培養(yǎng)液為神經(jīng)元復(fù)氧， 谷氨酸大量產(chǎn)生， 給予間充質(zhì)干細(xì)胞源的CM后， 細(xì)胞死亡率明顯下降， 表明CM對(duì)OGD模型中的皮層神經(jīng)元具有顯著的保護(hù)作用， 而CM中經(jīng)檢測(cè)含有大量的活性細(xì)胞因子， 提示CM可能通過(guò)多種活性因子的作用減輕神經(jīng)元在缺血缺氧性環(huán)境中受到一系列損傷[14， 15]。當(dāng)然， 其具體的作用機(jī)制仍須進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述， 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源條件培養(yǎng)基對(duì)OGD模型中的皮層神經(jīng)元具有顯著的保護(hù)作用， 這可能與CM 中含有多種細(xì)胞活性因子發(fā)揮保護(hù)作用有關(guān)。

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[收稿日期：2017-12-29]