段莎莎，徐冬梅，余 馬，舒曉燕，唐志康，劉 丹，侯大斌

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621000）

側(cè)根為植物地上部位提供營(yíng)養(yǎng)及水分，在植物根部生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用[1-2]。外源植物激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以調(diào)控內(nèi)源生長(zhǎng)素水平[3]，從而影響植物根部表型。外源生長(zhǎng)素可促進(jìn)植物根部中柱鞘細(xì)胞脫分化為側(cè)根原基[4]，增加側(cè)根數(shù)目，促進(jìn)側(cè)根形成。TIBA作為生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸?shù)妮敵鲆种苿芤种芇IN蛋白從胞內(nèi)到質(zhì)膜的循環(huán)和移動(dòng)[5]，通過(guò)結(jié)合生長(zhǎng)素輸出復(fù)合體來(lái)有效阻止IAA的極性運(yùn)輸[6]，從而導(dǎo)致IAA在細(xì)胞和組織的積累，可以刺激或者抑制根的生長(zhǎng)。Ca2+作為第二信使，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段，促進(jìn)植物根系發(fā)育。EDTA作為Ca2+螯合劑，阻止Ca2+在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制側(cè)根形成。

柴胡以根入藥，主要藥用成分為皂苷類化合物[7-10]。在柴胡根部中，韌皮部總皂苷含量高于木質(zhì)部。因此，側(cè)根數(shù)目越多，比表面積越大，總根皂苷含量越高[11]。本研究選用狹葉柴胡審定品種川紅柴1號(hào)，直根系，雙子葉，地下部位表現(xiàn)為主根粗大，須根較少，產(chǎn)量相對(duì)偏低。針對(duì)這一問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)研究了川紅柴1號(hào)側(cè)根發(fā)育動(dòng)態(tài)過(guò)程，并討論了生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)IAA、TIBA、Ca2+及EDTA對(duì)川紅柴1號(hào)側(cè)根發(fā)育的影響，以明確川紅柴1號(hào)側(cè)根形成機(jī)理，為川紅柴1號(hào)商品性改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

本研究供試材料為狹葉柴胡審定品種“川紅柴1號(hào)”，該品種系四川德培源中藥科技開(kāi)發(fā)有限公司、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥用植物研究所、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)及西南科技大學(xué)共同選育，是通過(guò)四川省品種審定委員會(huì)審定的首個(gè)狹葉柴胡新品種。

1.2 研究方法

1.2.1 水培法

選取飽滿柴胡種子，置于裝有珍珠巖的紙杯中，每個(gè)杯子放置5顆種子，于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽。待種子根長(zhǎng)至3 cm左右，將幼苗胚軸輕夾于海綿空隙，漂浮在Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中，進(jìn)行水培，并對(duì)根部進(jìn)行遮光處理。培養(yǎng)條件：晝溫（25±2）℃，夜溫（22±2）℃，每日光照時(shí)間16 h，光照強(qiáng)度約為500 μmol/(m2·s)。

1.2.2 側(cè)根原基發(fā)育過(guò)程觀察

選取10株生長(zhǎng)健壯的柴胡幼苗，對(duì)主根成熟區(qū)進(jìn)行石蠟切片，經(jīng)固綠染色后在倒置顯微鏡下觀察與拍攝側(cè)根原基發(fā)育動(dòng)態(tài)圖。

1.2.3 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)側(cè)根發(fā)育影響

幼苗在Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)10 d后，選取根部長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗進(jìn)行生長(zhǎng)素（IAA）、生長(zhǎng)素抑制劑（TIBA）、Ca2+和 Ca2+螯合劑（EDTA）處理，處理濃度見(jiàn)表1，處理時(shí)間12 h，每種濃度處理15株。之后轉(zhuǎn)入Hogland培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)15 d后測(cè)定根系參數(shù)。培養(yǎng)過(guò)程中每3 d換1次營(yíng)養(yǎng)液，每組處理均設(shè)置3次重復(fù)。

1.3 根系參數(shù)測(cè)定

將收獲后的根系樣品立即保存于25%的酒精溶液中，通過(guò)數(shù)字掃描儀（EPSON PERFECTIONV700 PHOTO）將完整的根系圖像存入計(jì)算機(jī)，之后用WinRhizo根系分析系統(tǒng)軟件對(duì)側(cè)根數(shù)目、總根長(zhǎng)度、根表面積及根體積進(jìn)行定量測(cè)定。方差分析采用SPSS處理數(shù)據(jù)，多重比較方法為L(zhǎng)SD法和Ducan法，置信區(qū)間為95%，使用Origin 8.0作圖。

表1 各試劑處理濃度Table 1 Reagent concentrations in different treatments

2 結(jié)果與分析

2.1 川紅柴1號(hào)側(cè)根原基發(fā)育過(guò)程

2.1.1 側(cè)根原基建成

由圖1-A（Ⅰ）可知，中柱鞘細(xì)胞發(fā)生脫分化，進(jìn)行細(xì)胞分裂，此時(shí)細(xì)胞分裂旺盛，細(xì)胞排列密集，且長(zhǎng)度明顯變短，細(xì)胞質(zhì)變濃，細(xì)胞染色性增強(qiáng)。中柱鞘細(xì)胞經(jīng)垂周分裂形成建成細(xì)胞（PFCs）；建成細(xì)胞又經(jīng)平周和垂周分裂形成多細(xì)胞層側(cè)根原基，細(xì)胞排列密集，細(xì)胞質(zhì)變濃，染色加深，原基向外凸起形成拱形（圖1-A-Ⅱ-Ⅲ，圖1-B-Ⅱ）；多細(xì)胞層側(cè)根原基經(jīng)垂周分裂向外側(cè)生長(zhǎng)膨大，原基向外凸起形成圓錐形（圖1-A-Ⅳ，圖1-B-Ⅲ）；圓錐形側(cè)根原基逐漸向外發(fā)育，不斷擠壓表皮，表皮層破碎，并出現(xiàn)明顯裂痕（圖1-A-Ⅴ，圖1-B-Ⅳ）。

2.2.2 側(cè)根原基突破表皮

側(cè)根原基由內(nèi)向外生長(zhǎng)，突破表皮層，露出母體，形成真正意義上的側(cè)根。新生側(cè)根基部與母根中柱相連。（圖1-A-Ⅵ）。

2.2 川紅柴1號(hào)側(cè)根發(fā)育影響因素

2.2.1 IAA和TIBA對(duì)川紅柴1號(hào)側(cè)根發(fā)育的影響

隨IAA濃度增加，川紅柴1號(hào)根系參數(shù)值整體表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。其中，當(dāng)IAA濃度為0.01 μmol/L時(shí)極顯著促進(jìn)側(cè)根數(shù)目和根體積的增大，顯著促進(jìn)總根長(zhǎng)和根表面積的增加，濃度超過(guò)10 μmol/L時(shí)抑制側(cè)根生長(zhǎng)。與對(duì)照組相比，低濃度TIBA促進(jìn)根系發(fā)育，濃度過(guò)高則起抑制作用。其中，0.1 μmol/L TIBA濃度顯著促進(jìn)根系參數(shù)增加，濃度超過(guò)1 μmol/L時(shí)抑制根系發(fā)育，濃度達(dá)到1 000 μmol/L時(shí)完全抑制根系發(fā)育，導(dǎo)致植株死亡。

圖1 川紅柴1號(hào)側(cè)根發(fā)育過(guò)程Figure 1 Lateral root development of“Chuanhongchai No.1”

2.2.2 Ca2+和EDTA對(duì)川紅柴1號(hào)側(cè)根發(fā)育的影響

隨Ca2+濃度增加，川紅柴1號(hào)根系參數(shù)整體表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)。其中，Ca2+濃度為1 μmol/L時(shí)根系參數(shù)值達(dá)到最大，極顯著促進(jìn)側(cè)根數(shù)目、總根長(zhǎng)和根表面積的增加；濃度超過(guò)1 μmol/L時(shí)對(duì)側(cè)根數(shù)目、總根長(zhǎng)、根表面積及根體積無(wú)顯著影響。與對(duì)照組相比，施加Ca2+螯合劑EDTA，總體表現(xiàn)為抑制柴胡根系發(fā)育。其中，10 μmol/L EDTA濃度極顯著抑制側(cè)根數(shù)目發(fā)育，而對(duì)總根長(zhǎng)、根表面積及根體積無(wú)影響；100 μmol/L EDTA濃度極顯著抑制側(cè)根數(shù)目、根體積增加，顯著抑制總根長(zhǎng)增加；超過(guò)100 μmol/L EDTA濃度極顯著抑制側(cè)根發(fā)育。

3 討論

在擬南芥等雙子葉植物中，側(cè)根起始于原生木質(zhì)部中柱鞘細(xì)胞[12]；在水稻、玉米等單子葉植物中，側(cè)根起始于原生韌皮部中柱鞘細(xì)胞[13]。對(duì)川紅柴1號(hào)研究表明，側(cè)根原基起始于靠近原生木質(zhì)部中柱鞘細(xì)胞，此發(fā)育模式與雙子葉植物側(cè)根發(fā)育模式一致，說(shuō)明側(cè)根起始位置在不同物種中既具有保守性，又具有差異性。

圖2 側(cè)根數(shù)目、總根長(zhǎng)、根表面積及根體積隨IAA濃度的變化Figure 2 Dynamic changes of lateral roots number,total root length,root surface area androot volumeof primary roots with the concentration gradient of IAA

圖3 側(cè)根數(shù)目、總根長(zhǎng)、根表面積及根體積隨TIBA濃度的變化Figure 3 Dynamic changes of lateral roots number，total root length，root surface area androot volumeof primary roots with the concentration gradient of TIBA

圖4 側(cè)根數(shù)目、總根長(zhǎng)、根表面積及根體積隨Ca2+濃度的變化Figure 4 Dynamic changes of lateral roots number，total root length，root surface area androot volumeof primary roots with the concentration gradient of Ca2+

圖5 側(cè)根數(shù)目、總根長(zhǎng)、根表面積及根體積隨EDTA濃度的變化Figure 5 Dynamic changes of lateral roots number，total root length，root surface area androot volumeof primary roots with the concentration gradient of EDTA

柴胡以根入藥，主要藥效成分為柴胡皂苷。TanX.[14]等人研究發(fā)現(xiàn)多支根柴胡側(cè)根數(shù)目較單支根柴胡多，且皂苷含量高，因此培育多支根柴胡尤為重要。歐陽(yáng)立明等人[15-16]對(duì)黃瓜幼苗施加生長(zhǎng)素發(fā)現(xiàn)，適宜濃度生長(zhǎng)素顯著促進(jìn)黃瓜主根伸長(zhǎng)，增大根系比表面積；周索等[17-18]也發(fā)現(xiàn)適當(dāng)濃度生長(zhǎng)素可抑制擬南芥主根生長(zhǎng)，促進(jìn)不定根的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)0.01 μmol/L IAA可顯著促進(jìn)川紅柴1號(hào)側(cè)根數(shù)目和根表面積增加，增大根系比表面積。Ca2+作為第二信使，幾乎參與所有植物細(xì)胞對(duì)激素及環(huán)境刺激的響應(yīng)過(guò)程[19-20]。江玲等[21]對(duì)萵苣幼苗施加CaCl2發(fā)現(xiàn)，4 mg/L的CaCl2濃度有利于誘導(dǎo)萵苣幼苗側(cè)根原基的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，1 μmol/L Ca2+濃度可顯著促進(jìn)川紅柴1號(hào)側(cè)根數(shù)目增加。TIBA作為生長(zhǎng)素輸出抑制劑，可以刺激或者抑制側(cè)根原基的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，0.1 μmol/L TIBA濃度極顯著促進(jìn)側(cè)根發(fā)育，這與H.A.Abdelgadir等[22-23]人研究結(jié)果基本一致；濃度高于1 μmol/L TIBA完全抑制川紅柴1號(hào)側(cè)根發(fā)育，在棉花[24]、大豆[25]、香石竹[26]中也起同樣抑制作用?？赡芤?yàn)門(mén)IBA阻止了生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸，導(dǎo)致生長(zhǎng)素在細(xì)胞和組織的積累，從而刺激或者抑制側(cè)根發(fā)育。EDTA作為Ca2+螯合劑，阻止Ca2+在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，間接影響植物體內(nèi)IAA濃度，來(lái)影響植物側(cè)根發(fā)育[27]。本研究中EDTA對(duì)側(cè)根發(fā)生主要起抑制作用。

綜上所述，0.01 μmol/L IAA，1 μmol/L Ca2+及0.1 μmol/L TIBA濃度均促進(jìn)柴胡側(cè)根發(fā)育，因此適宜培育多支根型柴胡。此外在柴胡實(shí)際生產(chǎn)種植中，可因地適宜添加適當(dāng)濃度的外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，刺激側(cè)根發(fā)育，從而培育出多支根型柴胡。此外，本研究方法可還應(yīng)用到人參、當(dāng)歸等以根入藥的藥用植物中，對(duì)調(diào)控中藥材商品性具重大意義。

參考文獻(xiàn)：

［1］廖濤，楊玉平，程薇，等.蘋(píng)果中多菌靈、噻菌靈和甲基托布津的高效液相色譜法分析［J］.分析測(cè)試技術(shù)與儀器，2010，16（4）：257-261.

［2］李華.高效液相色譜法測(cè)定葡萄及其制品中多菌靈殘留量［J］.福建分析測(cè)試，2012，21（3）：33-35.

［3］時(shí)向東，孫軍偉，謝曉波，等.煙草漂浮育苗基質(zhì)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)煙草科，2008，29（5）：64-68.

［4］BEECKMAN T，BURSSENS S，INZéD，et al.The peri-cell-cycle in Arabidopsis［J］.Journal of Experimental Botany，2001，52（suppl）：403-411.

［5］ZA?íMALOVáE，MURPHY A S，YANG H，et al.Auxin Transporters-Why So Many［J］.Cold Spring Harbor Perspectives in Biology，2010，2（3）：a001552.

［6］VAN DOORN W G，DOLE I，?ELIKEL F G,et al.Opening of Iris flowers is regulated by endogenous auxins［J］.Journal of Plant Physiology，2013，170（2）：161-164.

［7］CONTRERAS SS，LANZA A M D，PAJARES M B，et al.Bioactive components of Bupleurumrigidum L.subsp.Rigidum［J］.Studies in Natural Products Chemistry,2002，27：659-696.

［8］EBATA N，NAKAJIMA K，HAYASHI K，et al.Saponins from the root of Bupleurumfalcatum［J］.Phytochemistry，1996，41（3）：895-901.

［9］PISTELLI L，BILIA A R，MARSILI A，et al.Triterpenoidsaponins from Bupleurumfruticosum［J］.Journal of natural products，1993，56（2）：240-244.

［10］DING J，F(xiàn)UJINO H，KASAI R，et al.Chemical evaluation of BupleurumspeciescollectedinYunnan，China［J］.Chemicalandpharmaceutical bulletin，1986，34（3）：1158-1167.

［11］孟杰，陳興福，楊文鈺，等.柴胡主根與側(cè)根中柴胡皂苷a及皂苷d含量測(cè)定［J］.藥物分析雜志，2013，33（7）：1219-1222.

［12］石英，韓毅強(qiáng)，鄭殿峰，等.赤霉素對(duì)擬南芥主根分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)的調(diào)控［J］.植物生理學(xué)報(bào)，2015，25（1）：21-28.

［13］DE SMET I，VANNESTE，INZé D，et al.Lateral root initiation or the birth of a new meristem［J］.Plant molecular biology，2006，60（6）：871-887.

［14］TAN X，CALDERON-VILLALOBOS L I A，SHARON M，et al.Mechanism of auxin perception by the TIR1 ubiquitin ligase［J］.Nature，2007，446（7136）：640-645.

［15］歐陽(yáng)立明，張舜杰，陳劍峰，等.不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)水培黃瓜幼苗生長(zhǎng)和根系發(fā)育的影響［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（3）：161-166.

［16］陳平芳，王連潤(rùn)，高飛，等.高山杜鵑RED JACK試管苗生根研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012，24（2）：171-177.

［17］周索，龐振凌，龐發(fā)虎，等.不同生長(zhǎng)素誘導(dǎo)對(duì)對(duì)擬南芥根生長(zhǎng)發(fā)育的影響［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（9）：1816-1818.

［18］李小方，何玉科，湯章城.生長(zhǎng)素和模擬微重力效應(yīng)對(duì)大白菜不定根形態(tài)發(fā)生的影響［J］.實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，2000，33（2）：179-186.

［19］KIM M C，CHUNG W S，YUN D J，et al.Calcium and calmodulin-mediated regulation of gene expression in plants［J］.Molecular Plant，2009，2（1）：13-21.

［20］TOYOTAM，F(xiàn)URUICHIT，TATSUMIH，etal.Cytoplasmiccalcium incerases in response to changes in the gravity vector in hypocotyls and petioles of Arabidopsis seedlings［J］.Plant Physiology，2008，146（2）：505-514.

［21］江玲，管曉春.Ca2+-CaM系統(tǒng)在生長(zhǎng)素誘導(dǎo)萵苣側(cè)根原基形成中的作用［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26（1）：6-9.

［22］彭瓊.花生開(kāi)花下針期生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸及分布研究［D］.長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［23］ABDELGADIR H A，JOHNSON S D，VAN STADEN J.Promoting branching of a potential biofuel crop Jatrophacurcas L.by foliar application of plant growth regulators［J］.Plant Growth Regulation，2009，58（3）：287-295.

［24］DJANAGUIRAMAN M，SHEEBA J A，DEVI D D，et al.Response of cotton to Atonik and TIBA for growth，enzymes and yield［J］.Journal of Biological Sciences，2005，5（2）：158-162.

［25］TANNER J W，AHMED S.Growth analysis of soybeans treated with TIBA［J］.Crop Science，1974，14（3）：371-374.

［26］馬智宏，李艾君，劉振林，等.PP333、TIBA、Pix對(duì)盆栽香石竹矮化效應(yīng)的研究［J］.河北農(nóng)業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào),1999，13（1）：33-36.

［27］劉大同，荊彥平.水稻的側(cè)根發(fā)育及其影響因素［J］.作物學(xué)報(bào)，2014，40（8）：1403-1411.