左歸丸對糖皮質(zhì)激素致腎陰虛證的初步實驗研究△

張莉莉 郭春榮 朱榮榮 黃文慧 彭垠婷 王 冰

(上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心中藥學(xué)院 上海 201203)

腎陰與腎陽都是腎中精氣的一部分，腎陰滋養(yǎng)濡潤，腎陽溫煦蒸化。一方偏虛，便會造成另一方偏盛，從而影響腎氣的生成并造成病理變化，如腎陰虛證、腎陽虛證、腎氣虛證等[1]。若腎陰不足，則陰不制陽，陽亢內(nèi)生，虛熱內(nèi)擾，表現(xiàn)為腎陰虛，證見腰膝酸痛，頭暈耳鳴，失眠多夢，精泄夢遺、五心煩熱、潮熱盜汗等。明代醫(yī)家張景岳《景岳全書·新方八陣》中記載了左歸丸一方，方有熟地黃、枸杞、川牛膝、山茱萸、鹿角膠、山藥、龜板膠、菟絲子。該方滋陰補腎、填精益髓，常用于腎陰虛諸證，對骨質(zhì)疏松[2～3]、神經(jīng)系統(tǒng)[4～5]、血液系統(tǒng)[6～7]、婦科疾病[8～9]及男性生殖[10～11]系統(tǒng)疾病均有一定療效。

近年來，腎陰虛動物模型主要有甲狀腺機能亢進腎陰虛證模型、腎上腺皮質(zhì)機能亢進腎陰虛證模型、高血壓腎陰虛證模型等，其中甲狀腺機能亢進腎陰虛證模型是目前陰虛造模最常用的方法。然而成功復(fù)制甲亢模型需要的周期較長，例如甲狀腺素結(jié)合利血平法造模周期為10d，單純甲狀腺素法需要21d[12]，造模周期長使得試驗周期相應(yīng)加長，對時間安排、動物飼養(yǎng)、環(huán)境控制等均造成一定困難。本研究通過使用氫化可的松造大鼠腎陰虛模型，給藥左歸丸考察其對大鼠體重、腎體比及對HPA軸的影響，以期建立起一個造模周期適當、左歸丸藥效重復(fù)性好的腎陰虛模型。

1 材料與儀器

DHG-9003電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；Synergy2多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；XS105五位電子天平(梅特勒-托利多國際有限公司)；BS124S電子天平(德國賽多利斯有限公司)；S1352000超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；TDL-50B低速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；SF-400A電子稱(永康市龍蓓工貿(mào)有限公司)。

清潔級SD大鼠60只，雄性，體重(200±20)g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物合格證號SYXK(滬)2014-0008，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心清潔級屏障系統(tǒng)內(nèi)。

氫化可的松(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20121130，BR級)；肝素鈉注射液(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，批號51601114)；左歸丸(上海中醫(yī)藥大學(xué)自制，批號20150108，由熟地黃、枸杞、川牛膝、山茱萸、鹿角膠、山藥、龜板膠、菟絲子配以適當輔料制備而成，每克左歸丸含生藥2.01g)；六味地黃丸(九芝堂股份有限公司，批號201609018，濃縮丸)；大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(伊萊瑞特生物科技有限公司，批號AK0017APR15019)。本實驗所有用到的有機試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，為分析純；蒸餾水為上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心自制。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

按隨機分組法[13]將60只清潔級雄性SD大鼠隨機分為6組，每組10只，分別為正常對照組、腎陰虛模型組、左歸丸低劑量組、左歸丸中劑量組、左歸丸高劑量組和六味地黃丸組。左歸丸推薦劑量以生藥計為20.12g/d，將左歸丸中劑量設(shè)置為推薦劑量，低劑量為其1/2，而高劑量為其兩倍。六味地黃丸推薦劑量以生藥計為9g/d。按體表面積換算人與動物的等效劑量，換算結(jié)果見表1。將左歸丸與六味地黃丸分別粉碎過65目篩，用生理鹽水配制成藥物溶液，大鼠灌胃體積為5 mL/kg體重。左歸丸低劑量組、左歸丸中劑量組、左歸丸高劑量組、六味地黃丸組以表1所示劑量，每日灌胃給藥，正常對照組與腎陰虛模型組每日給予1 mL生理鹽水灌胃，連續(xù)8d。

精密稱取2.5g氫化可的松溶于50%乙醇溶液中，配制成5mg/mL溶液。從第5d起，除正常對照組外，每日每組大鼠按體重給予氫化可的松50mg/kg復(fù)制大鼠腎陰虛模型，連續(xù)造模4d。第8d給藥氫化可的松后，各組大鼠禁食不禁水12h，觀察各組動物體征變化，采集兩側(cè)腎上腺進行腎上腺組織形態(tài)學(xué)檢查，并取血檢查血漿促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)水平。

表1 各組動物的治療給藥劑量

組別藥物劑量(g·kg-1·d-1，以生藥計)正常對照組--腎陰虛模型組--左歸丸低劑量組左歸丸0．91左歸丸中劑量組左歸丸1．81左歸丸高劑量組左歸丸3．62六味地黃組六味地黃丸0．81

2.2 動物采血與血漿CRH水平測定

2.2.1動物采血

動物經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50mg/kg體重)麻醉固定在鼠板上，打開腹腔，用無菌棉球?qū)⒛c管及其他組織向大鼠一側(cè)腹部擦移并擦去筋膜及脂肪組織，使主動脈充分暴露。取10mL一次性注射器，針尖斜面朝下，約25°向心端刺入主動脈抽吸血液。所取血液立刻加入到肝素鈉EP管中，每管約加入1.5mL血液，15min內(nèi)經(jīng)3000r/min離心10min，取血漿備用。

2.2.2大鼠血漿CRH水平測定

取CRH標準品，加入標準品和樣品稀釋液配制成20 ng/mL標準品溶液，再倍比稀釋成10、5、2.5、1.25、0.63、0.31ng/mL標準品溶液，取標準品和樣品稀釋液為空白孔，即0 ng/mL。取大鼠血漿，加入標準品和樣品稀釋液稀釋5倍，備用。

取96孔板加樣，每孔50μL，其中20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0 ng/mL標準孔及空白孔各設(shè)兩空，計算時取兩孔度數(shù)的平均數(shù)。加樣后立刻向每孔中加入生物素化抗體工作液50μL，輕輕晃動混勻，給酶標板覆膜，37℃孵育45min。孵育結(jié)束后，洗板3次。向每孔中加入酶結(jié)合物工作液100μL，加上覆膜，37℃溫育30min，洗板5次。向每孔加入底物溶液(TMB)90μL，酶標板覆膜37℃避光孵育，每5 min觀察一次酶標板顯色情況，當標準孔出現(xiàn)明顯梯度時，停止孵育。最后向每孔中加入終止液50μL，孔內(nèi)顏色由藍色轉(zhuǎn)為黃色，在450nm波長測定各孔的光密度(OD值)并進行計算。

2.3 動物腎上腺采集與組織形態(tài)學(xué)研究

取血完成后處死動物，取出動物兩側(cè)腎上腺，剝離脂肪組織，放入4%甲醛溶液中固定，稱重，按公式1計算大鼠腎上腺-體重比例(腎體比)。將固定后的組織脫水、浸蠟、包埋、切片、染色制成病理切片于顯微鏡下觀察。

腎體比(%)=兩側(cè)腎上腺總質(zhì)量/大鼠體重×100%(公式1)。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本實驗中所有數(shù)據(jù)均使用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，當P<0.05時為有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 動物體征及體重變化

第1～4d預(yù)防性給藥過程中，各組大鼠體重平穩(wěn)增長，體重增長量無顯著性差異。第5～8d給藥氫化可的松，模型組大鼠體重下降明顯、體溫升高、活動頻度增加、毛色枯槁無光澤、飲水量增多的現(xiàn)象，查閱文獻[14]后可知腎陰虛模型造模成功。其中模型組大鼠體重顯著性下降(P<0.05)，左歸丸低劑量組、中劑量組和六味地黃丸組大鼠體重下降較緩，各組大鼠平均體重情況見表2。

組別第1d(g)第5d造模前(g)第8d(g)正常對照組211．40±9．57239．10±7．12256．40±8．77腎陰虛模型組203．67±14．11226．56±13．44211．11±9．81▲左歸丸低劑量組211．11±12．86231．89±15．58216．78±8．12左歸丸中劑量組211．60±8．02235．40±10．24222．00±15．08左歸丸高劑量組208．70±3．37235．40±7．37215．10±8．98六味地黃組211．00±5．95238．00±6．46222．38±9．27

注：▲與正常對照組比，P<0.05。

3.2 大鼠血漿CRH水平

以CRH濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，使用curve expert軟件擬合作大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)標準曲線(公式2)，如圖1，線性范圍0.31 ～ 20 ng/mL。

y=(a+bx)/(1+cx+dχ2)，a=3.61×108，b=8.39×108，c=1.23×108，d=1.49×108(公式2)。

圖1 大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)標準曲線

將各組測定的OD值乘以稀釋倍數(shù)，代入標準曲線得大鼠血漿CRH濃度，結(jié)果見表3。與正常對照組相比，腎陰虛模型組大鼠血漿CRH水平顯著降低(P<0.05)。與腎陰虛模型組相比，左歸丸中劑量組大鼠血漿CRH水平顯著升高(P<0.05)。而左歸丸低劑量、高劑量組及六味地黃丸組，在CRH平均濃度一項上較腎陰虛模型組高，但并不存在顯著性差異(P>0.05)。

3.3 動物腎上腺組織形態(tài)學(xué)研究

大鼠腎體比計算結(jié)果見表4，與正常對照組比，腎陰虛模型組大鼠腎體比顯著下降(P<0.05)。在給于藥物治療后，與腎陰虛模型組相比，左歸丸組和六味地黃丸組大鼠腎體比均升高，且左歸丸高劑量組大鼠腎體比升高顯著(P<0.05)。

各組大鼠腎上腺組織切片見圖2，正常對照組大鼠腎上腺皮質(zhì)與髓質(zhì)清晰可辨，球狀帶、束狀帶、網(wǎng)狀帶的結(jié)構(gòu)明顯。腎陰虛模型組大鼠腎上腺皮質(zhì)明顯薄于模型對照組，且皮質(zhì)與髓質(zhì)的較難區(qū)分。在給藥后，腎上腺皮質(zhì)萎縮情況有所改善，以中劑量的左歸丸對腎上腺皮質(zhì)萎癥狀的干預(yù)情況最好。

組別CRH(ng/mL)正常對照組38．08±11．36腎陰虛模型組27．68±5．03▲左歸丸低劑量組30．50±6．05左歸丸中劑量組35．12±6．11△左歸丸高劑量組31．24±7．59六味地黃組33．29±6．78

注：▲與正常對照組比，P<0.05；△與腎陰虛模型組比，P<0.05。

組別大鼠腎體比(%)正常對照組0．0256±0．0019腎陰虛模型組0．0179±0．0008▲左歸丸低劑量組0．0180±0．0017左歸丸中劑量組0．0181±0．0010左歸丸高劑量組0．0196±0．0027△六味地黃組0．0185±0．0043

注：▲與正常對照組比，P<0.05；△與腎陰虛模型組比，P<0.05。

圖2 各組大鼠腎上腺切面圖(HE,×100)

注：P1：正常對照組；P2：腎陰虛模型組；P3：左歸丸低劑量組；P4：左歸丸中劑量組；P5:左歸丸高劑量組；P6：六味地黃丸組。

4 討論

《景岳全書》中記載的左歸丸是滋陰名方，由熟地八兩、山藥抄四兩、山茱萸四兩、枸杞四兩、菟絲子四兩、川牛膝熟三兩、鹿角膠四兩、龜板膠四兩經(jīng)熬制而成。熟地、山茱萸、山藥、枸杞補腎填精；龜板膠偏于補陰，鹿角膠偏于補陽，取“陽中求陰”之意，兩者峻補精髓；川牛膝“補精填髓，益陰活血”；菟絲子“入肝脾腎三精。補髓填精，助陽固泄[15]?！痹摲阶剃幯a腎、填精益髓，常用于腎陰虛諸證。

氫化可的松作為一種糖皮質(zhì)激素被廣泛運用于臨床治療中，有抗炎、抗毒、抗休克等作用，也有一定的鹽皮質(zhì)激素活性。從中醫(yī)學(xué)角度來講，大劑量使用糖皮質(zhì)激素，會影響陰精內(nèi)斂、不能滋養(yǎng)，從而造成腎陰虧虛[16]。然有研究指出陰虛造模必須要密切觀察時間，因為證型會隨著時間和劑量的改變而發(fā)生演變。應(yīng)用大量糖皮質(zhì)激素的確會造成實驗動物機體的損耗，從而表現(xiàn)去虛損癥狀，早期以陰虛為主，但如果嘗試給予糖皮質(zhì)激素造模則會使證型由陰虛轉(zhuǎn)向陽虛[17]。楊夢玲[18]曾以50mg/kg體重氫化可的松灌胃5d造動物腎陰虛模型，劉旭光[19]以50mg/kg體重氫化可的松灌胃4d造動物腎陰虛模型，而鄒忠杰[20]則以10mg/kg體重氫化可的松腹腔注射15d造腎陽虛模型。

綜合考慮糖皮質(zhì)激素的劑量與時間對造模結(jié)果的影響，本實驗選擇通過短時間內(nèi)對大鼠使用大劑量氫化可的松，成功復(fù)制出大鼠腎陰虛模型。模型組大鼠體重下降明顯、體溫升高、活動頻度增加、毛色枯槁無光澤、飲水量增多的現(xiàn)象，并且出現(xiàn)腎上腺皮質(zhì)萎縮、血漿CRH水平下降，表明大鼠處于腎陰虧虛狀態(tài)且下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA)軸受到了一定的抑制。在給予藥物左歸丸治療后，大鼠血漿CRH水平上升，腎上腺組織病理改變減輕，說明左歸丸的干預(yù)對大鼠HPA軸產(chǎn)生了一定的保護作用，以左歸丸中劑量組治療效果最為顯著。由于機體陰陽平衡的變化是一個長期的過程，因此，建立與臨床病癥更為一致的造模方法是尚需進一步深入研究的。

1 閆志安.腎精、腎氣、腎陰、腎陽析.中國醫(yī)藥學(xué)報,2000,15(3):14～15.

2 Liu MJ,Li Y,Pan JH,et al.Effects of Zuogui Pill on Wnt Singal Transduction in Rats with Glucocorticoid-induced Osteoporosis.Journal of Traditional Chinese Medicine,2011,31(2):98～102.

3 Han N,Xu JH,Xu F,et al.The in Vivo Effects of a Fraction from Dioscorea Spongiosa on Glucocorticoid-induced Osteoporosis.Journal of Ethnopharmacology,2016,185(5):53～59.

4 張曉晶,鐘相根,賈旭,等.左歸丸對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠IL-23/IL-17炎性軸的影響.吉林中醫(yī)藥,2013,33(6):615～618.

5 陳武杰,陳秀玲,孫韶剛,等.左歸丸治療肝腎陰虛型腦梗死恢復(fù)期50例臨床觀察.新中醫(yī),2010,42(8):14～15.

6 姜濤,陳鋼,夏麗娜,等.左歸丸、右歸丸湯劑對輻照后骨髓抑制小鼠造血調(diào)控的實驗研究.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2014,10(7):4～6.

7 許海平.左歸丸加減治療再生障礙性貧血.黑龍江中醫(yī)藥,2015,2:45～46.

8 陽松威,孫曉峰,賀又舜,等.左歸丸對化療致POF模型小鼠卵巢Cx37及mRNA表達的影響.中藥新藥與臨床藥理,2016,27(1):33～38.

9 孫冬莉,林蓓,馬穎,等.中西醫(yī)結(jié)合治療青春期功能失調(diào)性子宮出血療效分析.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2016,18(1):195～197.

10 馬凰富.左歸丸治療少弱精子型男性不育癥的臨床和實驗研究.北京中醫(yī)藥大學(xué),2016.

11 韓亮,李海松,王彬,等.左歸丸治療精液異常男性不育癥200例臨床報道.北京中醫(yī)藥,2012,31(3):192～194.

12 徐志偉.腎陰虛證動物模型造模方法和評價指標規(guī)范化研究.亞洲實驗動物學(xué)會聯(lián)合會(AFLAS)、中國實驗動物學(xué)會(CALAS).亞洲實驗動物學(xué)會聯(lián)合會(AFLAS)第三次會議暨中國實驗動物學(xué)會(CALAS)第八屆學(xué)術(shù)年會論文集.亞洲實驗動物學(xué)會聯(lián)合會(AFLAS)、中國實驗動物學(xué)會(CALAS),2008,1.

13 趙偉,孫國志.常用實驗動物隨機分組方法.畜牧獸醫(yī)科技信息,2009,4:61～62.

14 王萍,王喜軍.腎陰虛證動物模型研究概況.中醫(yī)藥信息,2013,22(4):123～125.

15 默嘯箏,付劍江,劉紅寧.左歸丸創(chuàng)方思想探究及現(xiàn)代研究進展.江西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2016,28(3):114～117;121.

16 王水華,陳幫明,劉永芳,等.養(yǎng)陰益腎顆粒對糖皮質(zhì)激素致腎陰虛證大鼠HPA軸的影響.中國實驗方劑學(xué)雜志,2016,22(11):142～147.

17 付曉伶,方肇勤.陰虛證動物模型的造模方法及評析.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2004,18(2):51～54.

18 楊夢琳.六味地黃湯及“補瀉”藥對對腎陰虛模型小鼠HPA軸的影響.中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會內(nèi)分泌專業(yè)委員會、吳階平醫(yī)學(xué)基金會.2015年國際中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)分泌代謝病學(xué)術(shù)研討會暨第八次全國中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)分泌代謝病學(xué)術(shù)年會講義論文匯編.中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會內(nèi)分泌專業(yè)委員會、吳階平醫(yī)學(xué)基金會,2015.

19 劉旭光,宋開源,劉雨星,等.“陰虛”、“陽虛”模型大鼠體溫晝夜節(jié)律參數(shù)差異的研究.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2001,7(1):71～73.

20 鄒忠杰,龔夢鵑,謝媛媛,等.氫化可的松誘導(dǎo)的腎陽虛大鼠尿液代謝組學(xué)研究.中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(8):133～136.