早孕期孕婦外周血的胎兒游離DNA檢測(cè)分析

郭 輝

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院(河南省婦幼保健院) 鄭州 450000)

產(chǎn)前篩查是檢查母嬰雙方健康的一種方法，能夠?qū)μ涸谀阁w時(shí)進(jìn)行缺陷預(yù)測(cè)，結(jié)合產(chǎn)前診斷，盡可能的減少存在先天缺陷嬰兒的出生，為更多的家庭帶來長(zhǎng)久的幸福。傳統(tǒng)的產(chǎn)前篩查對(duì)孕婦及胎兒均具有一定的創(chuàng)傷，還存在導(dǎo)致流產(chǎn)的可能[1]。近幾年，產(chǎn)前檢查流行的新方法為：從孕婦的血液中提取胎兒的DNA，從而檢測(cè)胎兒在母體中的情況[2]。本研究采用孕婦外周血中的胎兒游離DNA進(jìn)行檢測(cè)分析，現(xiàn)做如下報(bào)告。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2016年3月～2017年3月在我院進(jìn)行產(chǎn)前篩查高危的100例孕婦，9～13周孕齡的50例孕婦定為早孕組，15～20周孕齡的50例孕婦定為中孕組。早孕組中初產(chǎn)婦24例，經(jīng)產(chǎn)婦26例，平均年齡(27.3±2.2)歲，平均孕周(7.5±1.6)周；中孕組中初產(chǎn)婦25例，經(jīng)產(chǎn)婦25例，平均年齡(27.3±2.3)歲，平均孕周(15.5±1.7)周。對(duì)兩組孕婦的外周血中游離胎兒的DNA進(jìn)行檢測(cè)。所有孕婦無其它合并癥，并根據(jù)我國倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，患者及家屬均知情并同意。對(duì)兩組患者的年齡、孕周等一般資料進(jìn)行比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組患者可以進(jìn)行比較。

1.2 方法

1.2.1采集標(biāo)本

采集孕婦外周血10mL于Cell-FreeDNA BCTTM采血管中，用來提取游離DNA。在4℃溫度條件下離心10min，離心后將上層的血清分裝到多個(gè)離心管(1.5mL)中；重復(fù)上一步驟，在4℃溫度條件下依舊經(jīng)過10min用離心方式清除殘余細(xì)胞，分離后的上清液存入新的離心管中。保存于-80℃溫度的冰箱中[3]，借助干冰運(yùn)送至貝瑞和康檢測(cè)中心進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2檢測(cè)方法

對(duì)采集的孕婦外周血采用美國Illumina公司測(cè)序儀進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序法檢測(cè)。通過大規(guī)模核酸比對(duì)軟件對(duì)比結(jié)果，對(duì)DNA片段的染色體的位置進(jìn)行確定，計(jì)算出每一個(gè)染色體來源的DNA序列數(shù)量，借助正態(tài)分布模型，比較妊娠正常二倍體胎兒的孕婦群體以及二倍體胎兒的置信區(qū)間和檢測(cè)閾值，對(duì)受檢樣本是否懷有染色體的非整倍體胎兒得出結(jié)論。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均在貝瑞和康檢測(cè)中心完成，數(shù)據(jù)可靠、詳細(xì)、有意義。

1.2.3隨訪

對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)性的孕婦進(jìn)行隨訪，主要方式有電話隨訪[4]和住院生產(chǎn)病歷兩種，對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)孕婦建議在妊娠中期行羊膜腔穿刺羊水細(xì)胞染色體核型檢測(cè)確認(rèn)[5]，存在異常的孕婦建議終止妊娠。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 孕婦外周血胎兒游離DNA檢測(cè)

表1 孕婦外周血胎兒游離DNA檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)與羊水穿刺結(jié)果對(duì)比

組別年齡孕周游離DNA檢測(cè)羊水穿刺是否一致結(jié)果早孕組33921?三體綜合征21?三體綜合征是引產(chǎn)中孕組351718?三體綜合征18?三體綜合征是引產(chǎn)312021?三體綜合征(嵌合)21?三體綜合征(嵌合)是引產(chǎn)

在早孕組50例孕婦外周血游離胎兒DNA檢測(cè)結(jié)果顯示，有1例染色體數(shù)目異常檢測(cè)為21-三體綜合征，與羊水染色體核型檢測(cè)分析結(jié)果完全相同；中孕組50例游離胎兒 DNA檢測(cè)結(jié)果顯示，1例孕婦染色體數(shù)目表現(xiàn)異常，1例染色體結(jié)構(gòu)異常，均與羊水染色體核型檢測(cè)分析結(jié)果相同，見表1。

2.2 孕婦外周血中的SRY濃度

對(duì)孕婦外周血中的SRY濃度進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果顯示中孕組濃度(149.25±59.17)copies/mL遠(yuǎn)高于早孕組的(26.42±35.31)copies/mL，結(jié)果顯示t=14.3604，P=0.0025，數(shù)據(jù)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 早孕期母體血漿中胎兒基因濃度(copies/mL)

組別病例數(shù)實(shí)測(cè)范圍均值早孕組5014．3～73．526．42±35．31中孕組5043．6～326．8149．25±59．17t值14．3604P值0．0025

3 討論

孕婦外周血胎兒游離DNA檢測(cè)可以安全、準(zhǔn)確、快速的進(jìn)行胎兒染色體疾病檢測(cè)，能夠直接針對(duì)孕婦外周血液中游離的胎兒DNA進(jìn)行測(cè)序和分析[6]。目前臨床上常常用來檢測(cè)21-三體綜合征(唐氏綜合征)、18-三體綜合征(愛德華氏綜合征)、13-三體綜合癥(帕陶氏綜合征)的危險(xiǎn)率。胎兒游離DNA在母體血漿中的有3種來源：(1)母體血漿中的胎兒有核細(xì)胞；(2)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞；(3)凋亡的胎兒組織細(xì)胞[7]。母體血漿中胎兒游離DNA濃度較胎兒有核細(xì)胞濃度高，且在懷孕5周時(shí)就可被檢測(cè)出來，并隨孕周數(shù)的增加，濃度也呈升高的趨勢(shì)[8]。相比于胎兒有核細(xì)胞，產(chǎn)后的胎兒游離DNA能夠更快速度的清除，半衰期平均只有16.3min。在母體血漿中，較多的胎兒游離DNA分子長(zhǎng)度短于母體的DNA，DNA長(zhǎng)度大的更易于檢測(cè)，檢測(cè)效果也相對(duì)更好[9]。

以上眾多的生物學(xué)特性使得胎兒的游離DNA成為臨床無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的新趨勢(shì)。但目前該技術(shù)尚未完全成熟，存在某些較難克服的問題：對(duì)于本身存在染色體數(shù)目異常的孕婦和懷有兩個(gè)胚胎的孕婦并不適用；而且對(duì)于血漿中胎兒游離DNA含量低于10%的孕婦，敏感性和特異性較差，常檢測(cè)不出來。

綜上所述，盡管孕婦外周血胎兒游離DNA檢測(cè)存在一些不足，胎兒游離DNA依然是產(chǎn)前篩查的重點(diǎn)研究方向，研究表明，在染色體非整倍體的診斷中，該技術(shù)的準(zhǔn)確度極高，符合臨床報(bào)道得出的結(jié)論。故孕婦外周血胎兒游離DNA對(duì)于早孕期染色體非整倍體具有準(zhǔn)確的、高精度的檢測(cè)率，能夠作為產(chǎn)前篩查起到檢測(cè)胎兒疾病的方法，值得臨床推廣使用。

1 歐俚倩. 3470例孕中期產(chǎn)前篩查結(jié)果初步分析.河南醫(yī)學(xué)研究,2017,26(7):1201～1202.

2 時(shí)偉麗,張卉,吳東,等.孕婦外周血胎兒游離DNA在產(chǎn)前篩查胎兒染色體非整倍體疾病中的價(jià)值.中華實(shí)用診斷與治療雜志,2017,31(9):859～861.

3 劉俊濤.無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)國際指南與中國規(guī)范.中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志,2017,33(6):564～567.

4 王敏,張聞,梅瑾.全面二孩政策對(duì)21-三體綜合征的產(chǎn)前診斷影響分析.中國優(yōu)生與遺傳雜志,2017,25(4):74～76.

5 林洋洋,徐婉芳,劉彥慧,等.大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)在產(chǎn)前無創(chuàng)檢測(cè)胎兒染色體異常中的臨床應(yīng)用.中國優(yōu)生與遺傳雜志,2016,24(1):52～54.

6 盧守蓮,黃歡,王玨,等.孕婦外周血游離DNA深度測(cè)序在胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)檢測(cè)中的應(yīng)用研究. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2014,34(4):499～503.

7 徐宏燕,劉凱波.北京地區(qū)6家產(chǎn)前診斷中心孕婦外周血胎兒游離DNA篩查情況分析.中國優(yōu)生與遺傳雜志,2017,25(9):72～73;109.

8 劉喜平. 優(yōu)生教育與產(chǎn)前篩查的應(yīng)用價(jià)值分析.河南醫(yī)學(xué)研究,2016,25(3):499.

9 陸海燕,鄭建麗,楊芳芳,等.孕婦外周血胎兒游離DNA檢測(cè)在無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用.中國優(yōu)生與遺傳雜志,2014,22(10):78～79;8.