孫曉瑞 陳博文 張小林 孟俊龍，3

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，太谷 030801；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，太谷 030801；3. 黃土高原食用菌提質(zhì)增效協(xié)同創(chuàng)新中心，太谷 030801）

秀珍菇（Pleurotus geesteraniSinger）是一種可食用的大型真菌，又被稱為印度鮑魚(yú)菇、環(huán)柄香菇、姬平菇。隸屬于真菌門(mén)，擔(dān)子菌綱，傘菌目，側(cè)耳科，側(cè)耳屬，產(chǎn)于印度南部查摩省，是熱帶和亞熱帶地區(qū)蕈菌［1］。1974年，由菌物學(xué)家Jandiaik馴化成功，經(jīng)分離并人工栽培，秀珍菇被證實(shí)是一株高產(chǎn)且性狀優(yōu)良的食用真菌。為更好利用這一珍稀菌物資源，眾多研究者已開(kāi)展了對(duì)其優(yōu)良菌株的選育工作。與常規(guī)育種相比，原生質(zhì)體技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交、擴(kuò)大遺傳物質(zhì)的重組范圍以及基因轉(zhuǎn)化和定向誘變，獲得有突出優(yōu)良性狀的新型菌株，產(chǎn)生更豐富的遺傳變異［2］。原生質(zhì)體因去掉了細(xì)胞壁的障礙而對(duì)外界刺激的敏感度顯著提高，是誘變的良好材料［3］。原生質(zhì)體制備［4］是原生質(zhì)體技術(shù)育種的基礎(chǔ)和重要前提，如何提高原生質(zhì)體產(chǎn)量及同時(shí)保證其較高再生率是此項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵研究點(diǎn)。

秀珍菇中含有的秀珍菇多糖具有抗氧化［5］、防衰老［6］、抗腫瘤等功效，目前國(guó)內(nèi)研究多集中于秀珍菇多糖提?。?］和純化［8］方法的優(yōu)化，以及秀珍菇多糖的結(jié)構(gòu)［9］和生物活性［10］。利用原生質(zhì)體育種［11］進(jìn)行突變、雜交、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)等操作，成為獲取秀珍菇多糖高產(chǎn)菌株的一種有效方法。有關(guān)秀珍菇原生質(zhì)體制備的研究較少，且秀珍菇單孢子菌株原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化與再生的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究從影響酶促反應(yīng)的因素（菌齡、穩(wěn)滲液種類及濃度、酶濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間）出發(fā)，系統(tǒng)地對(duì)影響原生質(zhì)體制備的因素進(jìn)行了研究，以期獲得原生質(zhì)體制備和再生的最優(yōu)條件，為利用原生質(zhì)體融合及基因組改組等選育更為優(yōu)良的菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 秀珍菇188由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌中心提供。

1.1.2 試劑 溶壁酶（廣東省微生物研究所），Tris-HCl（Boster），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 秀珍菇188單孢菌株生長(zhǎng)培養(yǎng)基PDA：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，用水定容至1 L，高壓滅菌。秀珍菇188單孢菌株培養(yǎng)基PDB：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，用水定容至1 L，高壓滅菌。原生質(zhì)體液體再生培養(yǎng)基：PDB添加0.6 mol/L甘露醇和10 mmol/L Tris-HCl。原生質(zhì)體固體再生培養(yǎng)基：PDA添加0.6 mol/L甘露醇和10 mmol/L Tris-HCl。

1.1.4 穩(wěn)滲液制備 甘露醇穩(wěn)滲液：稱取10.9 g甘露醇溶解于100 mL蒸餾水中，制備成0.6 mol/L的甘露醇穩(wěn)滲液，滅菌備用。稱取7.2 g MgSO4溶解于100 mL蒸餾水中，制備成0.6 mol/L的MgSO4穩(wěn)滲液滅菌備用。稱取20.54 g蔗糖溶解于100 mL蒸餾水中，制備成0.6 mol/L的蔗糖穩(wěn)滲液滅菌備用。稱取3.51 g NaCl溶解100 mL蒸餾水中，制備成0.6 mol/L的NaCl穩(wěn)滲液滅菌備用。稱取4.5 g KCl溶解于100 mL蒸餾水中，制備成0.6 mol/L的KCl穩(wěn)滲液滅菌備用。1.1.5 酶解液制備 按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度要求精確稱取溶壁酶溶解于滅菌的穩(wěn)滲液中，制備成酶解液，過(guò)濾除菌備用。

1.2 方法

1.2.1 秀珍菇188單孢菌株獲取 秀珍菇188栽培種培養(yǎng)基配方：棉籽殼81%、麩皮15%、過(guò)磷酸鈣1%、石膏粉1%、石灰1%、葡萄糖1%。秀珍菇188栽培種在22℃培養(yǎng)箱中發(fā)菌，待菌絲滿瓶后置于25℃，65%濕度條件的人工氣候培養(yǎng)箱中出菇。采收菇體健壯的秀珍菇子實(shí)體，剪去菌柄，將子實(shí)體菌褶朝下放置于鋪有無(wú)菌硫酸紙的無(wú)菌平板內(nèi)。12 h以后在硫酸紙上可見(jiàn)白色單孢子印，用無(wú)菌刀片刮取單孢子于無(wú)菌試管中，稀釋涂布于PDA平板上，25℃培養(yǎng)3-4 d后，于顯微鏡下顯微操作挑出單個(gè)孢子菌絲體，接種于PDA試管中培養(yǎng)。單孢菌絲約一周左右長(zhǎng)滿滿管（15 mm×150 mm），菌絲呈放射狀生長(zhǎng)，菌絲體整齊均勻潔白。挑選出優(yōu)良單孢菌絲菌株供原生質(zhì)體制備與再生使用。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備與再生 將秀珍菇188單孢菌株接種于加有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)。收集菌絲于已知重量的離心管中，稱重，用無(wú)菌滲透壓穩(wěn)定劑沖洗2-3次，4 000 r/min離心15 min，除去上液，得到純凈的菌絲，備用。將收集的菌絲置于5 mL離心管中，按菌絲：酶解液=1 g∶5 mL的比例加入酶解液，置于水浴鍋中試驗(yàn)設(shè)計(jì)溫度下水浴酶解，隔10 min振蕩一次，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間酶解結(jié)束后，取0.1 mL原生質(zhì)體稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，重復(fù)3次。將酶解液用5層擦鏡紙過(guò)濾，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的酶解時(shí)間加入8倍體積的穩(wěn)滲液終止酶解后制備成原生質(zhì)懸浮液，原生質(zhì)體懸浮液4 000 r/min離心10 min后去除上清液，沉淀用滲透壓穩(wěn)滲液稀釋再離心，重復(fù)3次后用滲透壓穩(wěn)定劑重懸得到較純的原生質(zhì)體懸液。將上述得到的原生質(zhì)體懸液取等體積2份，一份用滲透壓穩(wěn)定劑稀釋至1×105CFU/mL，取1 mL加入到9 mL含有滲透壓穩(wěn)定劑的液體PDA培養(yǎng)基中，25℃，100 r/min搖床中恢復(fù)再生培養(yǎng)24 h，每個(gè)PDA平板取0.1 mL液體菌液均勻涂布，10 mL共涂布100個(gè)平行（每個(gè)平板上獲得的菌落數(shù)的均值記為A），另一份加入與上述稀釋原生質(zhì)體所用的滲透壓穩(wěn)定劑體積相同的無(wú)菌水作為對(duì)照，同樣條件下液體恢復(fù)再生培養(yǎng)24 h后，每個(gè)PDA平板取0.1 mL液體菌液均勻涂布，10 mL共涂布100個(gè)平行（每個(gè)平板上獲得的菌落數(shù)的均值記為B）。原生質(zhì)體再生率=［（A-B）/C］×100%，選取未染菌的10個(gè)最優(yōu)平板計(jì)數(shù)。C：每個(gè)平板上涂布的原生質(zhì)體數(shù)量（0.1×0.1 mL×105CFU/mL=103CFU）。平板置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 顯微觀察 制片，于顯微鏡100×油鏡下觀察秀珍菇188菌株與其單孢菌株的顯微形態(tài)。取少量原生質(zhì)體懸液于凹玻片中，顯微鏡100×油鏡和40×物鏡下觀察原生質(zhì)體釋放過(guò)程并拍照。

1.2.4 秀珍菇單孢子菌絲體最佳原生質(zhì)體制備和再生單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 菌絲體菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備及再生影響 菌絲體菌齡設(shè)定為：4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d，在酶解液濃度為1.6%，酶解溫度29℃，酶解時(shí)間為160 min的條件下，以0.6 mol/L甘露醇和10 mmol/L Tris-HCl為穩(wěn)滲液酶解制備原生質(zhì)體懸浮液并鏡檢計(jì)數(shù)，以原生質(zhì)體釋放量大和原生質(zhì)體再生率高為優(yōu)選指標(biāo)，篩選優(yōu)化的菌絲體菌齡。

1.2.4.2 酶解液濃度對(duì)原生質(zhì)體制備及再生影響 酶解液濃度設(shè)定為：0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%和3.0%，以菌齡為8 d的秀珍菇188單孢子菌絲體為酶解對(duì)象，在29℃下，酶解時(shí)間為160 min的條件下，以0.6 mol/L甘露醇和10 mmol/L Tris-HCl為穩(wěn)滲液酶解制備原生質(zhì)體懸浮液并鏡檢計(jì)數(shù)，以原生質(zhì)體釋放量大和原生質(zhì)體再生率高為優(yōu)選指標(biāo)，篩選優(yōu)化的酶解液濃度。

1.2.4.3 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備及再生影響 酶解溫度設(shè)定為：23、25、27、29、31、33和35℃，以菌齡為8 d的秀珍菇188單孢子菌絲體為酶解對(duì)象，在酶解液濃度為1.6%，酶解時(shí)間為160 min的條件下，以0.6 mol/L甘露醇和10 mmol/L Tris-HCl為穩(wěn)滲液酶解制備原生質(zhì)體懸浮液并鏡檢計(jì)數(shù)，以原生質(zhì)體釋放量大和原生質(zhì)體再生率高為優(yōu)選指標(biāo)，篩選優(yōu)化的酶解溫度。

1.2.4.4 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備及再生影響 酶解時(shí)間設(shè)定為：40、80、120、160、200、240和280 min，以菌齡為8 d的秀珍菇188單孢子菌絲體為酶解對(duì)象，在酶解液濃度為1.6%，酶解溫度29℃的條件下，以0.6 mol/L甘露醇和10 mmol/L Tris-HCl為穩(wěn)滲液酶解制備原生質(zhì)體懸浮液并鏡檢計(jì)數(shù)，以原生質(zhì)體釋放量大和原生質(zhì)體再生率高為優(yōu)選指標(biāo)，篩選優(yōu)化的酶解時(shí)間。

1.2.4.5 穩(wěn)滲液種類對(duì)原生質(zhì)體制備及再生影響 穩(wěn)滲液種類為：0.6 mol/L的甘露醇、MgSO4、蔗糖、NaCl、KCl穩(wěn)滲液，以菌齡為8 d的秀珍菇188單孢子菌絲體為酶解對(duì)象，在酶解液濃度1.6%，酶解溫度29℃，酶解時(shí)間為160 min的條件下制備原生質(zhì)體懸浮液并鏡檢計(jì)數(shù)，以原生質(zhì)體釋放量大和原生質(zhì)體再生率高為優(yōu)選指標(biāo)，篩選優(yōu)化的穩(wěn)滲液。

1.2.4.6 優(yōu)選穩(wěn)滲液濃度以及Tris-HCl的添加對(duì)原生質(zhì)體制備及再生影響 穩(wěn)滲液濃度為：0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L、0.6 mol/L+T、0.8 mol/L+T，以菌齡為8 d的秀珍菇188單孢子菌絲體為酶解對(duì)象，在酶解液濃度1.6%，酶解溫度29℃，酶解時(shí)間為160 min的條件下制備原生質(zhì)體懸浮液并鏡檢計(jì)數(shù)，以原生質(zhì)體釋放量大和原生質(zhì)體再生率高為優(yōu)選指標(biāo)，進(jìn)行穩(wěn)滲液濃度以及Tris-HCl添加的優(yōu)化篩選。

1.2.5 秀珍菇單孢子菌絲體最佳原生質(zhì)體制備和再生正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，表1設(shè)定不同因素和水平，進(jìn)行L9（33）正交設(shè)計(jì)。在優(yōu)化的菌齡和穩(wěn)滲液條件下，制備原生質(zhì)體懸浮液，進(jìn)行L9（33）正交設(shè)計(jì)，以原生質(zhì)體釋放量和原生質(zhì)體再生率為指標(biāo)，篩選優(yōu)化的酶濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間。

表1 秀珍菇單孢子菌絲體最佳原生質(zhì)體制備和再生L9（33）正交試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果

2.1 顯微觀察

由圖1可見(jiàn)，秀珍菇188單孢菌株菌絲體較秀珍菇188菌株菌絲體纖細(xì)，秀珍菇188菌株菌絲體有明顯的鎖狀聯(lián)合，秀珍菇188單孢菌株菌絲無(wú)鎖狀聯(lián)合。

圖1 秀珍菇188菌株與其單孢菌株顯微觀察

秀珍菇188菌株單孢菌株細(xì)胞壁被酶分解后，原生質(zhì)體的釋放有多種形式，且釋放時(shí)間不同步。在40×物鏡和100×油鏡下可以清楚的看到原生質(zhì)體逐漸從菌絲尖端（圖2-A和2-B）釋放出來(lái)，在100×油鏡下觀察到原生質(zhì)體從菌絲體側(cè)面（圖2-C）釋放出來(lái)，原生質(zhì)體呈球體狀，大小差異較大。在40×物鏡下觀察到，部分原生質(zhì)體內(nèi)含大液泡（圖2-D）。原生質(zhì)體經(jīng)4-6層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾純化后，菌絲殘?jiān)煌耆^(guò)濾掉，40×鏡下可觀察到大量大小不一的原生質(zhì)體（圖2-E）。

圖2 秀珍菇188菌株單孢菌株原生質(zhì)體釋放過(guò)程與方式的觀察

2.2 菌絲體菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備及再生影響

菌齡為4-5 d的單孢子菌絲體過(guò)于幼嫩很難獲得原生質(zhì)體，而且獲得的原生質(zhì)體容易降解；而生長(zhǎng)8-10 d的單孢子菌絲體由于生長(zhǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，過(guò)厚的菌壁使得溶壁酶難以裂解得到大量原生質(zhì)體；取生長(zhǎng)6-8 d的秀珍菇188單孢子菌絲體作為酶解對(duì)象可以成功裂解獲得量大質(zhì)優(yōu)的原生質(zhì)體，菌齡為8 d時(shí)獲得的原生質(zhì)體數(shù)量和再生率都最好（圖3）。

2.3 酶解液濃度對(duì)原生質(zhì)體制備及再生影響

圖3 菌絲體菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備及再生影響

酶濃度從0.4%增大到1.2%時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量迅速增加。酶濃度由1.2%增加到1.6%時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量增加速度趨于緩慢（圖4），原因是酶濃度逐漸達(dá)到飽和。隨著溶壁酶濃度繼續(xù)提升，原生質(zhì)體產(chǎn)量開(kāi)始降低，原生質(zhì)體的完整性逐漸被破壞，伴隨著原生質(zhì)體的活力下降，原生質(zhì)體再生率也下降。所以，最佳酶濃度應(yīng)控制在1.6%。

圖4 酶解液濃度對(duì)原生質(zhì)體制備及再生影響

2.4 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備及再生影響

隨著酶解溫度的提升，溶壁酶活力提高，原生質(zhì)體產(chǎn)量也逐步增加，在酶解溫度為29℃時(shí)，秀珍菇188單孢子菌絲體原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最大且原生質(zhì)體再生率也較高（圖5）。

圖5 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備及再生影響

2.5 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備及再生影響

酶解80-120 min后，由于未被酶解的菌絲體較多，釋放出的原生質(zhì)體較少。酶解240-280 min后得到的原生質(zhì)體有酶解過(guò)度破裂現(xiàn)象，原生質(zhì)體再生率降低；酶解300 min后，原生質(zhì)體開(kāi)始被嚴(yán)重破壞，接著酶解，原生質(zhì)體全部被酶解為碎片殘?jiān)?；酶解時(shí)間為120-200 min時(shí)，可獲得量大質(zhì)優(yōu)的秀珍菇188單孢菌株原生質(zhì)體（圖6）。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備及再生影響

在原生質(zhì)體制備過(guò)程中，菌絲在酶解作用下，細(xì)胞壁不斷被分解形成單個(gè)的原生質(zhì)體。在一定范圍內(nèi)無(wú)論酶解時(shí)間長(zhǎng)短，原生質(zhì)體的獲得量均在原生質(zhì)體制備量最大值左右波動(dòng)變化，繼續(xù)酶解最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁被完全酶解破壞，過(guò)長(zhǎng)的酶解時(shí)間使得原生質(zhì)體的再生率下降，原生質(zhì)體由于無(wú)法合成新的細(xì)胞壁而不能再生?？紤]到節(jié)約實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間以減少雜菌污染，優(yōu)化選擇的酶解時(shí)間為160 min。

2.6 穩(wěn)滲液種類對(duì)原生質(zhì)體制備及再生影響

研究（圖7）發(fā)現(xiàn)，在不加其他成分的PDB中，秀珍菇188單孢子菌絲體原生質(zhì)體無(wú)法再生成功，PDB中添加甘露醇、硫酸鎂、氯化鈉作為滲透壓穩(wěn)定劑時(shí)可以再生成功。穩(wěn)滲液的添加以甘露醇效果最好，可以很好地保護(hù)秀珍菇188、單孢子菌絲體原生質(zhì)體的完好性。

2.7 優(yōu)選穩(wěn)滲液濃度以及Tris-HCl的添加對(duì)原生質(zhì)體制備及再生影響

優(yōu)選穩(wěn)滲液甘露醇的濃度和Tris-HCl的添加對(duì)秀珍菇188單孢子菌絲體原生質(zhì)體形成及再生有很大影響，特別是0.6 mol/L的甘露醇和10 mmol/L的Tris-HCl混合穩(wěn)滲液對(duì)于秀珍菇188單孢子菌絲體原生質(zhì)的獲得及再生效果明顯（圖8）。

圖7 穩(wěn)滲液種類對(duì)原生質(zhì)體制備及再生影響

圖8 優(yōu)選穩(wěn)滲液濃度以及Tris-HCl的添加對(duì)原生質(zhì)體制備及再生影響

2.8 正交試驗(yàn)

原生質(zhì)制備的酶濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。以原生質(zhì)體產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析可知各因素對(duì)原生質(zhì)體制備的影響從大到小的順序?yàn)椋好笣舛龋ˋ）＞酶解溫度（B）＞酶解時(shí)間（C），最佳方案應(yīng)為A2B1C3，此條件下原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最大值3.5×107CFU/mL。以原生質(zhì)體再生率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析可知各因素對(duì)原生質(zhì)體制備的影響從大到小的順序?yàn)椋好笣舛龋ˋ）＝酶解時(shí)間（C）＞酶解溫度（B），最佳方案應(yīng)為A2B2C2，此條件下原生質(zhì)體再生率達(dá)到最大值1.5%。

本試驗(yàn)研究中要同時(shí)考慮到原生質(zhì)體的制備量和原生質(zhì)體的再生率，所以以原生質(zhì)體產(chǎn)量和原生質(zhì)體再生率的乘積數(shù)值為最終評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析可知各因素對(duì)原生質(zhì)體制備和再生的影響從大到小的順序?yàn)椋好笣舛龋ˋ）＞酶解時(shí)間（C）＞酶解溫度（B），最終最佳方案為A2B2C2，此條件下原生質(zhì)體產(chǎn)量和原生質(zhì)體再生率的乘積數(shù)值達(dá)到最大值51。綜合以上評(píng)價(jià)指標(biāo)分析，酶濃度對(duì)原生質(zhì)體制備和再生影響最大。最終得到最佳秀珍菇單孢菌絲體原生質(zhì)體制備和再生指標(biāo)：酶濃度1.6%，酶解時(shí)間160 min，酶解溫度29℃。

2.9 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果選取最佳原生質(zhì)體制備和再生條件：在菌齡為8 d、穩(wěn)滲液為0.6 mol/L甘露醇和10 mmol/LTris-HCl的混合穩(wěn)滲液，酶濃度1.6%，酶解時(shí)間160 min，酶解溫度29℃條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。在此條件下秀珍菇188單孢子菌絲體原生質(zhì)體釋放量為3.5×107CFU/mL，原生質(zhì)體再生率為1.4%，原生質(zhì)體釋放量與原生質(zhì)體再生率乘積數(shù)值為4.9，與正交結(jié)果相近，證明本試驗(yàn)結(jié)論可靠。

3 討論

在育種試驗(yàn)中，當(dāng)需要獲取親本菌株的單核原生質(zhì)體菌株時(shí)，通用方法為制備親本原生質(zhì)體，然后由于在原生質(zhì)體制備過(guò)程中，會(huì)有部分原生質(zhì)體失去一個(gè)細(xì)胞核變成單核原生質(zhì)體。但是在后期的試驗(yàn)操作流程中，需用常規(guī)方法檢測(cè)是否有鎖狀聯(lián)合來(lái)區(qū)分單雙核原生質(zhì)體菌株，試驗(yàn)流程較為緩慢。針對(duì)那些可以產(chǎn)孢子的菌株，就可以先獲取其孢子，然后制備單核原生質(zhì)體菌株，可以保證獲取到的原生質(zhì)體菌株均為單核。而對(duì)于那些不產(chǎn)孢子的菌株，或者是野生條件下難以采集孢子的野生菌株［12］，可以選用原生質(zhì)體單核化技術(shù)獲取其單核菌株。

對(duì)于不同種屬的食用菌，細(xì)胞壁化學(xué)組成不盡相同，因此在制備原生質(zhì)體時(shí)所需酶也會(huì)有差異［13］。許多研究者經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，溶壁酶對(duì)側(cè)耳屬的菌種酶解效果相對(duì)較好。因此本研究采用單一酶溶壁酶［14］來(lái)制備原生質(zhì)體。相比較其他文獻(xiàn)中單一考慮原生質(zhì)體的產(chǎn)量，本研究在單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)中同時(shí)考慮到原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率［15］，為與秀珍菇188單孢子原生質(zhì)體相關(guān)試驗(yàn)中原生質(zhì)體的實(shí)際操作使用提供了數(shù)據(jù)支持，使得研究結(jié)果更符合試驗(yàn)實(shí)際操作的要求。

表2 秀珍菇單孢子菌絲體最佳原生質(zhì)體制備和再生L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在原生質(zhì)體純化上，采用5層擦鏡紙進(jìn)行純化過(guò)濾。相比無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾法［16］，原生質(zhì)體數(shù)量下降幅度較無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾法小，操作更為簡(jiǎn)單，也降低了染菌率。原生質(zhì)體的得率是原生質(zhì)體再生的前提條件，本研究選取加有玻璃紙［17］的PDA作為菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基，菌絲的收集更加方便快捷，縮短了菌絲收集流程，大幅度降低染菌幾率。綜合多個(gè)文獻(xiàn)資料，選擇菌絲體清洗的離心轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，在此轉(zhuǎn)速條件下［18］收集到的原生質(zhì)體量大且活性高。在原生質(zhì)體制備和再生過(guò)程中，沒(méi)有對(duì)pH進(jìn)行調(diào)節(jié)，保持pH自然，避免影響到原生質(zhì)體外膜，進(jìn)而影響原生質(zhì)體再生率。

4 結(jié)論

本研究以原生質(zhì)體產(chǎn)量，原生質(zhì)體再生率以及兩者乘積數(shù)值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)其原生質(zhì)體制備條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定了原生質(zhì)體制備的最佳條件：在菌齡為8 天、穩(wěn)滲液為0.6 mol/L甘露醇和10 mmol/LTris-HCl的混合穩(wěn)滲液，酶濃度1.6%，酶解時(shí)間160 min，酶解溫度29℃。在此條件下，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到3.5×107CFU/mL，原生質(zhì)體再生率達(dá)到1.4%，兩者乘積數(shù)值為4.9。

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