王蔚 呂青山 郁勤龍 陳恒威 沈偉鋒

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病，以肺結(jié)核多見。2017年WHO報(bào)告最新數(shù)據(jù)表明，我國2016年肺結(jié)核發(fā)病患者近87萬例，位居全球第三位，防治疫情仍較嚴(yán)峻[1]。目前，疑似肺結(jié)核患者篩查方法仍以痰涂片鏡檢和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)為主，前者敏感度低，后者耗時長，均不能滿足臨床早期、快速診斷的需求。2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，我國目前活動性肺結(jié)核患者約有75%為涂陰肺結(jié)核[2]，采用傳統(tǒng)涂片鏡檢方法無法及時發(fā)現(xiàn)該類患者，極易延誤病情，對結(jié)核病疫情控制極為不利，如何早期發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核成為亟需解決的難題。利福平耐藥實(shí)時熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)(GeneXpert MTB/RIF，簡稱“Xpert檢測”)為基于熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)，直接檢測標(biāo)本中有無結(jié)核分枝桿菌感染及利福平耐藥基因，逐漸引起國內(nèi)外關(guān)注。已有多家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室、臨床研究中心采用涂陽或培陽標(biāo)本對該檢測系統(tǒng)進(jìn)行評估，認(rèn)為該技術(shù)具有較高的敏感度和準(zhǔn)確性[3-4]，但是對于初診疑似患者，尤其是涂陰肺結(jié)核患者的檢測效能的系統(tǒng)評估仍較少。筆者基于此背景，收集初診疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本，以臨床診斷和傳統(tǒng)藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)比例法為標(biāo)準(zhǔn)，分析Xpert檢測結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥性的效能，綜合評價Xpert檢測對初診疑似及涂陰肺結(jié)核患者的快速診斷價值。

資料和方法

一、臨床資料

收集2015年1月至2016年12月浙江省嘉興市第一醫(yī)院就診的361例初診疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本(均按照規(guī)范留取)，分別進(jìn)行涂片熒光金胺O染色鏡檢(簡稱“涂片鏡檢”)、結(jié)核分枝桿菌MGIT 320液體培養(yǎng)(簡稱“液體培養(yǎng)”)和GeneXpert MTB/RIF檢測(簡稱“Xpert檢測”)，納入患者均為初次來我院就診，伴有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、低熱、盜汗等臨床癥狀，或胸部影像學(xué)檢查的表現(xiàn)與活動性肺結(jié)核相似，且近2年內(nèi)未使用過抗結(jié)核藥物的患者。361例疑似患者最終臨床診斷為：肺結(jié)核184例(50.97%)，包括男103例(55.98%)、女81例(44.02%)，年齡11～79歲、平均(44.67±12.03)歲；肺部感染162例(44.88%)；非典型分枝桿菌肺部感染15例(4.15%)。

二、診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.涂陰肺結(jié)核[5]：必須具備以下標(biāo)準(zhǔn)：①至少3份痰標(biāo)本抗酸桿菌涂片鏡檢陰性；②符合活動性肺結(jié)核病變的胸部X線攝影表現(xiàn)；③臨床上可排除其他非結(jié)核性肺部疾病。同時滿足以下輔助指標(biāo)中的任何一項(xiàng)即可確診：①結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(PPD 5TU)強(qiáng)陽性；②血清結(jié)核抗體陽性；③痰結(jié)核分枝桿菌PCR熒光探針檢測陽性；④肺外組織病理學(xué)檢查證實(shí)結(jié)核病變。

2.肺部感染[6]：患者出現(xiàn)咳嗽、咳痰等癥狀，肺部可聞及濕性啰音，可出現(xiàn)發(fā)熱或白細(xì)胞計(jì)數(shù)增高或影像學(xué)檢查提示有炎性反應(yīng)等。

3.非典型分枝桿菌肺部感染[7]：具有呼吸系統(tǒng)癥狀和(或)全身癥狀，胸部影像學(xué)顯示炎性病灶及單發(fā)或多發(fā)薄壁空洞，病變多累及上葉尖段和前段，CT可有結(jié)節(jié)影、斑片及小斑片樣實(shí)變影、空洞影、支氣管擴(kuò)張、樹芽征、磨玻璃影、線狀及條索影等多種形態(tài)病變混雜存在，實(shí)驗(yàn)室查痰菌2次培養(yǎng)到同一種非結(jié)核分枝桿菌。

三、儀器與試劑

金胺O染色液(杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)，CX40FL型熒光顯微鏡[寧波舜宇光學(xué)科技(集團(tuán))有限公司]；結(jié)核分枝桿菌BACTECT MGIT 320液體培養(yǎng)儀及配套試劑(美國BD公司)；GeneXpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)和配套試劑(美國 Cepheid公司)；結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑盒膠體金法(杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)。

四、檢查方法

按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[8](簡稱“《規(guī)程》”)分別進(jìn)行以下檢查。

1.痰涂片鏡檢：留取痰液3～5 ml進(jìn)行涂片、熒光染色及LED顯微鏡鏡檢(物鏡“×40”，目鏡“×10”)，暗視野下呈黃色熒光，桿狀略彎曲菌體為陽性結(jié)果；判讀標(biāo)準(zhǔn)為：0條/50個視野為陰性；1～9條/50個視野報(bào)告實(shí)際條數(shù)；10～49條/50個視野為“1+”；1～9條/每個視野為“++”；10～99條/每個視野為“+++”；100條及以上/每個視野為“++++”；報(bào)告“++”至少觀察50個視野，“+++”及以上的陽性結(jié)果至少觀察20個視野。

2.痰結(jié)核分枝桿菌液體培養(yǎng)：取痰液1～1.5 ml用N-乙酰半胱氨酸(NALC)-NaOH處理后，接種于BACTECT MGIT 320液體培養(yǎng)基進(jìn)行液體快速培養(yǎng)，儀器自動報(bào)陽后對陽性管涂片抗酸染色鏡檢確認(rèn)，同時采用結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑盒鑒定菌種。

3.Xpert檢測：取備用痰液1 ml置于無菌螺紋管中，加入樣本試劑(sample reagent)處理液2 ml，旋緊螺紋管，漩渦震蕩15～30 s，室溫靜置15 min，使痰標(biāo)本充分液化。取2 ml 處理后樣品加入反應(yīng)盒，將反應(yīng)盒置于檢測模塊，儀器開始自動檢測。以ropB基因?yàn)榘行蛄?，同時采用6種分子信標(biāo)探針檢測，上述探針循環(huán)閾值(Ct值)≤38即為陽性，即5個探針中至少2個探針Ct值≤38即為檢測到結(jié)核分枝桿菌；對利福平的藥敏試驗(yàn)：再根據(jù)特異性分子信標(biāo)早期Ct值和晚期Ct值之差，即△Ct值確定是否對利福平耐藥，當(dāng)△Ct值>3.5時提示對利福平耐藥，△Ct值≤3.5時提示對利福平敏感。由于終止循環(huán)數(shù)為38個循環(huán)，當(dāng)早期探針Ct值>34.5或晚期探針Ct值>38時，結(jié)果為不確定[9]。

4.結(jié)核分枝桿菌固體藥敏試驗(yàn)比例法：將培養(yǎng)陽性菌株采用比例法對4種一線抗結(jié)核藥物(利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇)進(jìn)行耐藥性測試，判斷藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

5.菌種鑒定：采用免疫法，將培養(yǎng)陽性菌液滴入結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑盒，判斷是否為結(jié)核分枝桿菌。

6.病理學(xué)和影像學(xué)檢查：參照文獻(xiàn)[5]和[10]中的步驟及標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢查及判讀。

五、相關(guān)公式

敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；正確指數(shù)=敏感度+特異度-1

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，采用卡方檢驗(yàn)對涂片鏡檢法、培養(yǎng)法和Xpert檢測的結(jié)果進(jìn)行比較分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、361例初診疑似肺結(jié)核患者的檢測情況

在361例初診疑似肺結(jié)核患者中，涂片鏡檢、液體培養(yǎng)和Xpert檢測的陽性率分別為22.71%、26.32%、32.41%；涂片鏡檢與Xpert檢測比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.49，P<0.05)；液體培養(yǎng)與Xpert檢測比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.23，P=0.072)，涂片鏡檢法與液體培養(yǎng)法比較差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.26，P=0.261)。184例肺結(jié)核患者中，涂片鏡檢(36.41%)和液體培養(yǎng)的陽性率(48.91%)分別和Xpert 檢測結(jié)果(63.59%)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=27.17，P<0.01；χ2=8.05；P<0.05)(表1)。

二、不同檢測方法對初診疑似肺結(jié)核患者的檢測效能：以臨床確診患者為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算3種方法的檢測效能，見表2。

三、Xpert檢測對涂陰肺結(jié)核患者的檢出情況

在184例肺結(jié)核患者中，涂片鏡檢陰性的117例標(biāo)本中液體培養(yǎng)陽性29例，則涂陰肺結(jié)核患者的培養(yǎng)陽性率為24.79%；涂陰的117例標(biāo)本中Xpert檢測陽性50例，Xpert檢測對涂陰肺結(jié)核患者的陽性檢出率為42.74%，具體見表3。液體培養(yǎng)和Xpert檢測對117例涂陰肺結(jié)核患者的陽性檢出率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.43，P=0.004)。

表1 三種檢測方法對361例疑似肺結(jié)核患者的檢測結(jié)果

注括號外數(shù)值為“患者例數(shù)”，括號內(nèi)數(shù)值為“比率(%)”

表2 三種方法以臨床確診患者為金標(biāo)準(zhǔn)的檢測效能

表3 涂陰肺結(jié)核液體培養(yǎng)和Xpert檢測的陽性檢出情況

注括號外數(shù)值為“患者例數(shù)”，括號內(nèi)數(shù)值為“構(gòu)成比(%)”

四、固體藥敏試驗(yàn)比例法與Xpert檢測對培陽患者利福平藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析

按操作規(guī)程，以固體藥敏試驗(yàn)比例法為標(biāo)準(zhǔn)，對90株培養(yǎng)陽性菌株進(jìn)行固體藥敏試驗(yàn)和Xpert檢測利福平ropB耐藥基因。結(jié)果顯示，固體藥敏試驗(yàn)比例法有5株對利福平耐藥，其中4株Xpert檢測利福平耐藥、1株敏感，該敏感株經(jīng)基因芯片檢測，檢測到ropB基因531(TCG-TTG)突變位點(diǎn)；另85株固體藥敏試驗(yàn)比例法敏感菌株中有2株Xpert檢測利福平耐藥、83株敏感，對結(jié)果不相同的2株Xpert 檢測耐藥株進(jìn)行基因芯片檢測，1株未檢測到ropB基因突變位點(diǎn)，1株為ropB基因531(TCG-TTG)突變。以固體藥敏試驗(yàn)比例法結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert 檢測利福平耐藥的敏感度為4/5，特異度為97.70%(85/87)，正確指數(shù)為0.97(87/90)。因?qū)嶒?yàn)室條件限制，進(jìn)行基因芯片檢測的結(jié)果數(shù)據(jù)未進(jìn)行測序。

討 論

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的傳染病，細(xì)菌學(xué)檢查是診斷的確切依據(jù)。我國目前主要依賴于痰涂片鏡檢進(jìn)行肺結(jié)核的診斷與隨訪時療效的監(jiān)測[11]。痰涂片鏡檢陰性的疑似肺結(jié)核患者診斷需根據(jù)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果及患者臨床癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)、病理學(xué)檢查等結(jié)果，耗時較長，對疾病控制極為不利。Xpert檢測系統(tǒng)基于熒光定量PCR技術(shù)，整合樣本制備、核酸純化濃縮和熒光定量PCR擴(kuò)增的檢測過程，在一個封閉的試劑盒中自動完成，2 h內(nèi)可得到檢測結(jié)果。早在2010年，WHO就發(fā)表聲明認(rèn)可并推薦Xpert檢測在結(jié)核病防治規(guī)范中的應(yīng)用，認(rèn)為它對肺結(jié)核的診治具有里程碑式的意義[12]。

國內(nèi)外已有較多文獻(xiàn)報(bào)道Xpert檢測系統(tǒng)在涂陽或培陽患者中的檢測效能。有資料顯示，Xpert檢測在肺結(jié)核涂陰培陽患者中的敏感度可達(dá)57%～76.9%，涂陽培陽患者中達(dá)98%～100%[13]。菌陰肺結(jié)核患者尤其是涂陰肺結(jié)核患者臨床表現(xiàn)不典型，胸部影像的空洞情況明顯少于涂陽患者[14]，癥狀較輕，個人不重視檢查，不能被及時發(fā)現(xiàn)；同時又缺乏細(xì)菌學(xué)診斷依據(jù)，臨床上診斷難度較大，極易造成漏診誤診。有研究報(bào)道，涂陰肺結(jié)核患者傳染性僅次于痰菌陽性的肺結(jié)核患者，與該群體密切接觸者被感染的概率達(dá)7.3%～21%[15]。因此，及時發(fā)現(xiàn)初診涂陰肺結(jié)核患者，對于控制結(jié)核病傳播，提高患者規(guī)范治療機(jī)會有著重要意義。

本研究通過對初診為疑似肺結(jié)核的患者進(jìn)行痰涂片、結(jié)核分枝桿液體菌培養(yǎng)及Xpert檢測，發(fā)現(xiàn)在臨床診斷肺結(jié)核患者中，Xpert檢測方法的敏感度(63.59%)和特異度(100.00%)明顯高于涂片鏡檢(分別為36.41%和91.52%)和液體培養(yǎng)(分別為48.91%和91.52%)，但比文獻(xiàn)報(bào)道95%的敏感度略低[16]，分析原因可能與本研究患者選擇以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，將臨床診斷為肺結(jié)核的初診患者納入研究，存在一定比率的菌陰或涂陰肺結(jié)核患者，而文獻(xiàn)中是以培陽或涂陽的患者為研究對象；Xpert檢測結(jié)果陽性預(yù)測值(100.00%)和陰性預(yù)測值(72.54%)均高于涂片鏡檢(分別為81.71%和58.06%)和液體培養(yǎng)(分別為85.71%和63.28%)，表明Xpert在初診疑似肺結(jié)核患者實(shí)驗(yàn)室檢測中的效能遠(yuǎn)高于涂片鏡檢和液體培養(yǎng)。

同時本研究顯示，對于117例初診涂陰肺結(jié)核患者，Xpert檢測的陽性率為42.74%(50/117)，即有近1/2的初診肺結(jié)核患者無法通過涂片鏡檢進(jìn)行篩查，需根據(jù)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、臨床癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)、血清學(xué)抗體檢測及組織病理學(xué)等方法相結(jié)合進(jìn)行診斷?，F(xiàn)通過Xpert技術(shù)可以直接檢測痰標(biāo)本，降低了對患者的有創(chuàng)診療操作，可快速檢測到患者體內(nèi)的少量結(jié)核分枝桿菌，及時進(jìn)行干預(yù)。有文獻(xiàn)報(bào)道，與涂片鏡檢法相比，Xpert技術(shù)能使結(jié)核分枝桿菌檢出率提高11.7%～50.0%[17]。另有研究表明，對于菌陰肺結(jié)核采用支氣管灌洗液進(jìn)行Xpert 檢測優(yōu)于痰液標(biāo)本，陽性率可達(dá)70%以上；但是對于存在采用纖維支氣管鏡支氣管灌洗液檢查禁忌證和其他特殊患者，仍建議采用痰液檢查，無創(chuàng)傷，標(biāo)本易采集[18]。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)曾在2015年發(fā)文表示，肺結(jié)核患者治療后可采用Xpert檢測痰標(biāo)本，結(jié)果陰性作為早期解除呼吸道隔離的標(biāo)準(zhǔn)，對于可疑肺結(jié)核患者，可依Xpert檢測痰結(jié)果判斷是否需要進(jìn)行呼吸道隔離[19]。我國2018年即將實(shí)施的最新肺結(jié)核診斷行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定分子生物學(xué)檢測結(jié)核分枝桿菌陽性，同時滿足影像學(xué)表現(xiàn)的患者，即可確診肺結(jié)核[20]。因此，對于疑似肺結(jié)核患者，Xpert檢測結(jié)果可直接明確診斷，達(dá)到早期診斷、及時治療的目的；尤其對于初診涂陰患者，意義更加重大。

另一方面，在對培陽肺結(jié)核患者耐藥檢測中，以固體藥敏試驗(yàn)比例法為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert檢測利福平耐藥的敏感度為4/5，特異度為97.70%(85/87)，與比例法檢測利福平藥敏試驗(yàn)結(jié)果的正確指數(shù)達(dá)0.97，與文獻(xiàn)報(bào)道相似[9]。傳統(tǒng)固體藥敏試驗(yàn)比例法耗時需4周，通過Xpert檢測的使用，可以快速預(yù)測利福平耐藥性，早期制定用藥方案。

綜上所述，作為結(jié)核病診治基層醫(yī)院，可推薦采用Xpert技術(shù)對疑似結(jié)核病患者進(jìn)行檢測，及早發(fā)現(xiàn)結(jié)核感染與耐利福平肺結(jié)核，為患者創(chuàng)造治療與治愈結(jié)核病的機(jī)會，防止耐藥結(jié)核病的形成與播散。

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