申惠蓮, 卡哈爾5阿里木(1. 遼寧民族師范高等??茖W(xué)校, 遼寧 沈陽 11003; . 新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 新疆 昌吉 831100)
蛋白質(zhì)的磷酸化是最普遍、最重要的翻譯后修飾方式,與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程密切相關(guān)[1-3]。異常的蛋白質(zhì)磷酸化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。因此研究蛋白質(zhì)磷酸化意義重大。生物樣品中磷酸化肽的含量非常低;在質(zhì)譜分析磷酸化肽時(shí),磷酸化肽的信號(hào)受到非磷酸化肽的抑制?;谏鲜鰞蓚€(gè)原因在質(zhì)譜檢測之前需要對(duì)磷酸化肽進(jìn)行高效富集。用于磷酸化肽的富集方法很多,主要包括金屬氧化物親和色譜(MOAC)[5,6]、固定化金屬離子親和色譜(IMAC)[7,8]和強(qiáng)陽離子交換色譜法[9]。其中,IMAC是應(yīng)用最廣泛的方法之一[10-13],但由于IMAC在富集磷酸化肽時(shí)存在酸性肽段的非特異性干擾,因此降低了對(duì)磷酸化肽的富集選擇性。這些酸性肽段中含有多個(gè)酸性氨基酸如天冬氨酸(Asp)和谷氨酸,如何克服這些酸性肽段的干擾是IMAC材料富集磷酸化肽所面臨的問題。針對(duì)這一問題,科研工作者從材料官能團(tuán)組成和親水性等方面做出改進(jìn),提高了IMAC材料對(duì)磷酸化肽的選擇性[14-16]。
氨基酸是生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位。自然界里組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中只有2種酸性氨基酸,分別是天冬氨酸和谷氨酸。相比于谷氨酸,天冬氨酸的酸性和親水性更強(qiáng)。因此,本文應(yīng)用自然界中親水性、酸性氨基酸Asp作為IMAC材料的連接臂,通過點(diǎn)擊化學(xué)的方法在硅球上鍵合Asp(Click Asp),然后在此材料螯合上Fe3+后(Fe3+-Click Asp)用于磷酸化肽富集。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,所開發(fā)的基于Fe3+-Click Asp的IMAC材料能選擇性富集磷酸化肽。
硅球(5 μm, 10 nm)、α-酪蛋白(α-casein)、牛血清白蛋白(BSA)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、鹽酸胍、胰蛋白酶、碳酸氫銨(NH4HCO3)、氨水(NH3. H2O)、丙烯酰氯、(3-巰基丙基)、甲酸銨(NH4FA)、甲酸(FA)、乙腈(ACN)和三甲氧基硅烷購于Sigma公司。所有溶液均用Milli-Q水配制。離心管和移液槍槍頭購于Axygen公司。超純水由美國Millipore公司Milli-Q超純水系統(tǒng)制備得到。
按照文獻(xiàn)[17]合成Click Asp。反應(yīng)結(jié)束后,離心棄掉上層清液,于真空干燥箱中60 ℃干燥過夜。將真空干燥的硅球懸浮于15 mL無水乙醇中,超聲分散后,加入0.1 g九水硝酸鐵Fe(NO3)359H2O,室溫振蕩0.5 h。反應(yīng)結(jié)束后,于60 ℃干燥過夜,制備得到Fe3+-Click Asp。
所合成的材料分別經(jīng)如下儀器表征:日立SM-5610LV掃描電鏡(SEM)(日立高新技術(shù)公司);Vertex 80v傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀(德國Bruker公司); Smart Lab9 X射線衍射分析儀(美國Smart Lab公司)。
稱取1 mg蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶解于100 μL含8 mol/L尿素的50 mmol/L NH4HCO3緩沖液中,加入5 μL含200 mmol/L二硫蘇糖醇的25 mmol/L NH4HCO3緩沖液,于56 ℃條件下孵化45 min;加入20 μL含200 mmol/L碘代乙酰胺的25 mmol/L NH4HCO3緩沖液,暗室常溫反應(yīng)30 min;用25 mmol/L NH4HCO3緩沖液將溶液稀釋至10倍體積,并與30 μg胰蛋白酶充分混合后于37 ℃下反應(yīng)9 h,加入5 μL甲酸終止酶解反應(yīng),-80 ℃保存。
脫脂牛奶(產(chǎn)地德國)用3倍體積的乙腈沉淀,離心,棄去上清液,保留沉淀,用旋轉(zhuǎn)離心濃縮揮去乙腈。沉淀后的蛋白質(zhì)用8 mol/L尿素溶解后,采用上述蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的酶解過程進(jìn)行酶解。
HeLa細(xì)胞裂解液中蛋白質(zhì)的提取和胰蛋白酶的酶解參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。
稱取2.5 mg Fe3+-Click Asp材料,用30 μL ACN-H2O-FA(50∶49∶1,體積比)活化,用30 μL ACN-H2O-TFA(80∶19.9∶0.1,體積比)平衡,以30 μL ACN-H2O-TFA(80∶19.9∶0.1,體積比)為上樣溶液,溶解上樣(樣品為α-酪蛋白或者HeLa細(xì)胞裂解液的酶解物)后,依次用30 μL ACN-H2O-TFA (80∶19.9∶0.1,體積比)、30 μL ACN-H2O-TFA (50∶49.9∶0.1,體積比)、30 μL H2O淋洗,再用20 μL NH35H2O-H2O(5∶95,體積比)洗脫,然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。
從α-酪蛋白和牛奶中富集的磷酸化肽采用納升級(jí)ESI Q-TOF MS (美國Waters公司)進(jìn)行分析;質(zhì)譜采用正離子(ESI+)掃描模式;納升級(jí)電噴霧電壓為2.3 kV;質(zhì)量掃描范圍為600~1 800 Da。從HeLa細(xì)胞裂解液中富集到的磷酸化肽采用液相色譜儀及LTQ-Orbitrap Velos質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)進(jìn)行分析。肽段溶解在FA-H2O (0.1∶99.9,體積比)溶液中,上樣至捕獲柱(3 cm×100 μm, C18AQ色譜填料)。在納升級(jí)的分離柱(10 cm×75 μm, C18AQ色譜填料)上進(jìn)行梯度分離;流動(dòng)相A為FA-H2O(0.1∶99.9,體積比),流動(dòng)相B為ACN-H2O-FA(90∶9.9∶0.1,體積比),流速約為0.2 μL/min。洗脫梯度為:0~3 min, 2%B; 3~95 min, 35%B; 95~100 min, 50%B; 100~105 min, 90%B, 90%B保持5 min。
LTQ-Orbitrap Velos質(zhì)譜在正離子、Survery模式下采集數(shù)據(jù)。ESI噴針電壓為1.9 kV,碰撞能量為35%。MS掃描范圍為450~2 000 Da,分辨率為6 000,僅對(duì)豐度前15的離子進(jìn)行二級(jí)碎片掃描分析。將所采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Maxquant軟件轉(zhuǎn)化為“*. mgf”文件,并在Uniprot數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索。搜庫時(shí)參數(shù)設(shè)置如下:允許最多兩個(gè)漏切位點(diǎn);固定修飾設(shè)定為半胱氨酸被碘代乙酰烷基化,可變修飾為磷酸化;磷酸化肽的score>20,假陽性率<1%。
所合成的材料分別采用傅里葉紅外光譜(FTIR)、X射線電子能譜(XPS)和SEM進(jìn)行表征。從紅外譜圖(圖1a)可以判斷3 450 cm-1處的峰為-NH-振動(dòng)峰,3 200 cm-1處寬而強(qiáng)的峰為羧基上-OH的伸縮振動(dòng),2 980 cm-1和2 850 cm-1處的峰為-CH3的對(duì)稱、不對(duì)稱伸縮振動(dòng)且包含-CH單鍵的振動(dòng)的峰,1 720 cm-1處的峰為酮上C=O的伸縮振動(dòng)(飽和)峰,1 490 cm-1處中等強(qiáng)度的峰為-CH2剪式振動(dòng),1 440 cm-1處的峰為羧基上C-O伸縮振動(dòng)峰。XPS譜圖表明所合成材料中含有C、N和Fe等元素的存在(見圖1b)。SEM譜圖說明硅球的形貌在修飾前后沒有發(fā)生顯著變化(見圖2),說明修飾沒有破壞硅球的形貌。上述這些結(jié)果表明Fe3+-Click Asp被成功合成。
圖 2 (a)硅球和(b)Fe3+-Click Asp材料的掃描電鏡圖Fig. 2 Images of (a) scanning electron microscope of silica microsphere and (b) the Fe3+-Click Asp materials
圖 3 α-酪蛋白的胰蛋白酶酶解液(a)處理前和經(jīng)過(b)TiO2和(c)Fe3+-Click Asp處理后的質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectra of tryptic digests of α-casein (a) before and after treatment with (b) TiO2 and (c) Fe3+-Click Asp Phosphopeptides are labeled with xP. Other peaks are non-phosphorylated peptides. x indicates the number of phosphate group, and P indicates phosphate groups.
因?yàn)镃lick Asp材料本身具有很好的親水性[17],所以Fe3+-Click Asp材料對(duì)磷酸化肽的富集實(shí)驗(yàn)在親水作用色譜的操作模式下進(jìn)行。我們以α-酪蛋白的胰蛋白酶酶解液為模式樣品,首先采用酸性、高有機(jī)溶劑的上樣溶液(ACN-H2O-TFA,80∶19.9∶0.1,體積比)降低酸性非磷酸化肽的吸附,接著降低乙腈的含量(ACN-H2O-TFA, 50∶49.9∶0.1,體積比)淋洗保留在材料上的非磷酸化肽,最后采用NH35H2O-H2O(5∶95,體積比)洗脫保留在材料上的磷酸化肽。結(jié)果如圖3所示,未經(jīng)過Fe3+-Click Asp處理的α-酪蛋白酶解液的質(zhì)譜圖中只能鑒定到一條磷酸化肽,大量高豐度的非磷酸化肽信號(hào)占據(jù)著整個(gè)質(zhì)譜圖,如m/z692.98(1+)、880.64(1+)和1 267.85(1+)等。同樣的α-酪蛋白的酶解液經(jīng)過Fe3+-Click Asp富集后,高豐度的非磷酸化肽被有效去除,使得磷酸化的信號(hào)顯著提高,能夠鑒定到15條磷酸化肽(具體信息見表1)的信號(hào),如m/z733.82(2+)、830.92(2+)、976.60(2+)、964.39(2+)和1 310.01(2+)。與此相比,采用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中廣泛使用的TiO2材料,我們只檢測到10條磷酸化肽的信號(hào)。上述結(jié)果表明我們合成的Fe3+-Click Asp能實(shí)現(xiàn)磷酸化肽的選擇性富集,其對(duì)磷酸化肽的富集效果優(yōu)于商品化的TiO2材料。
為了驗(yàn)證所建立的磷酸化肽富集方法在實(shí)際樣品中的效果,我們分別選取了脫脂牛奶和HeLa細(xì)胞裂解液作為分析對(duì)象。對(duì)于牛奶樣品,我們首先采用乙腈沉淀的方法從脫脂牛奶樣品中得到蛋白質(zhì),并對(duì)所得蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解;然后采用Fe3+-Click Asp對(duì)牛奶蛋白酶解液中的磷酸化肽進(jìn)行富集。從圖4中可以看出,富集前的牛奶蛋白質(zhì)酶解液中只有一條磷酸化肽的信號(hào);與此相對(duì),經(jīng)過Fe3+-Click Asp富集后的質(zhì)譜圖中能檢測到17條磷酸化肽信號(hào),這些信號(hào)不僅包括m/z830.89(2+)、976.48(2+)、964.18(2+)、1 339.31(2+)和1 373.79(2+)等α-酪蛋白中的磷酸化肽,還鑒定到m/z1 041.24(3+)、1 044.56 (3+)、1 561.44 (2+)和1 580.43 (2+)等已報(bào)道的磷酸化肽。將Fe3+-Click Asp用于更加復(fù)雜的HeLa細(xì)胞裂解液,從50 μg樣品中共鑒定出1 855個(gè)磷酸化位點(diǎn),這些位點(diǎn)來源于1 269條磷酸化肽,方法的富集選擇性為65.8%。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明我們合成的Fe3+-Click Asp材料對(duì)磷酸化肽具有較高的富集選擇性。
表 1 α-酪蛋白胰蛋白酶酶解液中所含磷酸化肽的詳細(xì)信息Table 1 Detailed information of phosphopeptides contained in tryptic digests of α-casein
本文合成了一種Fe3+-Click Asp用于磷酸化肽的富集,并應(yīng)用紅外光譜、X射線衍射電子能譜和掃描電鏡對(duì)材料進(jìn)行了表征,結(jié)果表明材料合成成功。此外,這種基于Fe3+-Click Asp的富集材料能實(shí)現(xiàn)磷酸化肽的選擇性富集。本工作為磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的磷酸化肽富集提供了新材料和新方法。
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