邵 留，蘭燕月，姬 芬，張 昊，嚴(yán) 銘，張飲江，2

（1.上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306；2.水域環(huán)境生態(tài)上海高校工程研究中心，上海 201306；3.水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306）

循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)（Recirculating aquaculture systems，RAS）與傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式相比，具有集約化、高產(chǎn)率、節(jié)水、節(jié)地等優(yōu)點，是水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展必然趨勢。但是其集約化養(yǎng)殖模式導(dǎo)致投餌增加，殘餌增多，加之魚體生理代謝產(chǎn)生大量氮磷等營養(yǎng)物質(zhì)，加速水質(zhì)惡化。大多循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，主要采用生物過濾器的硝化作用將毒性較強的氨氮和亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為毒性較弱的硝酸鹽，來保證魚類的安全與有效生長，卻忽略了硝酸鹽大量積累對養(yǎng)殖對象的影響。DAVID等［1］研究表明硝酸鹽濃度的累積明顯抑制蝦類存活率，引發(fā)胰腺病變，降低產(chǎn)量；另外，高濃度的硝酸鹽條件下，水生動物組織發(fā)育減緩、激素分泌功能下降［2］，生理機能變?nèi)跎踔了劳觯?－6］。相關(guān)研究［7］表明循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中硝酸鹽安全濃度為50 mg·L－1以下，但目前循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)應(yīng)用反硝化作用來降低硝酸鹽濃度技術(shù)尚不成熟［8］，一般多采用換水來保證系統(tǒng)中硝酸鹽濃度不超標(biāo)，并不能從根本上解決硝酸鹽積累問題。

本研究設(shè)計了一種可有效降低養(yǎng)殖廢水中氮濃度的新型脫氮技術(shù)工藝，主要針對養(yǎng)殖水體C／N比偏低，溶氧偏高等特點，采用研究較少的農(nóng)業(yè)廢棄物 玉米芯作為反硝化碳源和生物膜載體，通過人工強化掛膜方式建立同步硝化反硝化脫氮系統(tǒng)（Simultaneous nitrification and denitrification，SND），該系統(tǒng)對節(jié)約水資源，減少養(yǎng)殖活動對環(huán)境污染，以及發(fā)展可持續(xù)的生態(tài)漁業(yè)都具有重要意義與學(xué)術(shù)價值。本研究試圖在實驗室條件下通過檢測進(jìn)出水的水質(zhì)變化，探索新型工藝的脫氮效果，并對新型裝置的脫氮機理進(jìn)行初步分析，以期為集約化工廠循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)改善提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 玉米芯脫氮強化反應(yīng)器

新型反應(yīng)器設(shè)計如圖1所示，柱狀反應(yīng)器材質(zhì)為有機玻璃，參數(shù)為20 cm（D）×47 cm（H，有效水深），養(yǎng)殖廢水由儲水池經(jīng)蠕動泵進(jìn)入反應(yīng)器，控制流速為（20±0.31）mL·min－1，裝置運行前將已人工強化掛膜的玉米芯（干重為1 kg）投入柱狀反應(yīng)器內(nèi)。

圖1 裝置示意圖Fig.1 Scheme of a laboratory－scale experiment注：1.儲水池；2.蠕動泵；3.進(jìn)水口；4.出水口；5.玉米芯Note：1.Feed vessel；2.Peristaltic pump；3.Inlet；4.Outlet；5.Corncob

1.2 玉米芯表面掛膜流程

硝化菌富集培養(yǎng)：選取魚塘底泥作為接種物，加入自行配制的培養(yǎng)液后于25℃恒溫培養(yǎng)20 d，控制pH在7.2～7.5之間，充氣使DO保持在4 mg·L－1以上；硝化菌培養(yǎng)液采用改良的Stephenson培養(yǎng)液。

反硝化菌富集培養(yǎng)：實驗所用菌種污泥來源于上海市濱海污水處理廠，取回后的活性污泥用反硝化菌富集培養(yǎng)液（KNO32.0 g·L－1；K2HPO40.5 g· L－1；MgSO4· 7H2O 0.2 g· L－1；C4H4KNaO6·4H2O 20 g·L－1）富集培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)期間充氮氣排除水體溶解氧，維持厭氧環(huán)境。

微生物富集培養(yǎng)成功后，先將玉米芯投入反硝化菌液中充分浸泡1 d，再將富集培養(yǎng)好的硝化菌用噴壺均勻噴灑在已浸泡過反硝化菌的玉米芯外層。

1.3 實驗用水

根據(jù)前期監(jiān)測羅非魚（Oreochromis spp.）RAS系統(tǒng)水質(zhì)指標(biāo)，取上海海洋大學(xué)校內(nèi)湖水經(jīng)0.45 μm膜過濾后，添加適量 KNO3、NH4Cl、KH2PO4配置實驗污水，具體進(jìn)水水質(zhì)指標(biāo)如表1所示。

1.4 實驗分析方法及數(shù)據(jù)處理

裝置進(jìn)出水水樣每2 d取一次，采用國標(biāo)法［9］測定相關(guān)指標(biāo)。其中，TN：過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法，NO－2-N：N-（1－萘基）-乙二胺光度法，NO－3-N：紫外分光光度法，NH＋4-N：納氏試劑光度法；TOC：采用總有機碳分析儀測（TOC-V.CPH，島津）測定；水溫、DO、pH采用多參數(shù)水質(zhì)測量儀（YSI556MPS，美國維賽公司）測定。

實驗共選取6個不同時間點，采集菌液及玉米芯表面生物膜樣品，具體采樣時間見表2。采集后的樣品經(jīng)DNA提取及PCR擴增后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，采用高通量分子測序技術(shù)對微生物群落結(jié)構(gòu)分析（表3）。技術(shù)方法為：提取樣品總DNA→PCR擴增和產(chǎn)物純化→PCR產(chǎn)物定量和均一化→Miseq PE文庫制備→Miseq高通量測序→生物信息分析實驗所得數(shù)據(jù)均記錄為“算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（Mean±SD），利用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表2 樣品序號及采集時間表Tab.2 Sample number and sampling time

表1 實驗用水基本水質(zhì)指標(biāo)Tab.1 Indicators of water quality

表3 PCR擴增引物及序列Tab.3 PCR amplification primer and sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 裝置對氮的去除效果

實驗期間裝置出水NH＋4-N、NO-3-N、TN濃度及去除率變化如圖2（A，B，C）所示，經(jīng)人工強化掛膜后，新型脫氮裝置啟動迅速，運行第1 d裝置氨氮、硝酸鹽和總氮的去除率分別達(dá)到了56.50%、97.63%和86.08%。

實驗前期（1～35 d），系統(tǒng)保持穩(wěn)定運行狀態(tài)，該階段水溫一直穩(wěn)定在20℃以上，TN、NO-3-N、NH＋4-N去除率均保持較高水平。由圖2-A可以看出，實驗前期裝置NH＋4-N最高去除率為64.64%，最低為46.38%，出水NH＋4-N濃度平均為3.50 mg·L－1，裝置具備一定的硝化效果。出水NO-3-N濃度及去除率變化如圖2-B所示，NO-3-N去除率最高達(dá)98.80%，最低為95.25%，出水濃度保持在0.89 mg·L－1左右，這說明即使在高DO（平均DO＞4 mg·L－1）條件下，裝置依舊獲得了良好的反硝化效果；裝置出水TN濃度及去除率變化如圖2－C所示，出水TN平均濃度為7.88 mg·L－1，TN最高去除率為 86.61%，最低時為76.61%；綜上所述，實驗前期新型裝置啟動迅速，且具有良好的同時硝化反硝化脫氮能力。

實驗中期（37～43 d），水溫降至15℃左右，出水水質(zhì)波動較為劇烈，裝置 TN、NO-3-N及NH＋4-N去除率均出現(xiàn)明顯下降。第43天，TN、NO-3-N及NH＋4-N去除率均降至最低，分別僅為43.12%、49.68%和13.35%。第44天，水溫回升后NH＋4-N、NO-3-N、TN去除率均出現(xiàn)不同程度上升，其中NO-3-N和TN去除率最高分別回升至78.79%和63.94%。但去除率依然低于實驗前期，這可能是由于生物膜上微生物受溫度突降影響較大，微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。后續(xù)的微生物分析結(jié)果驗證了這一猜想（圖4）。

實驗后期（≥65 d），NO-3-N、TN去除率出現(xiàn)逐步下降趨勢，系統(tǒng)NH＋4-N去除率維持在（20～30）%之間。結(jié)合圖3可以看出，運行時間超過65 d后，出水TOC濃度下降明顯，含量普遍低于20 mg·L－1，這說明碳源玉米芯中易被分解的有機物已消耗殆盡，導(dǎo)致反硝化碳源不足，從而使得裝置對總氮的去除率出現(xiàn)下降。

圖2 NH＋4-N（A）、NO-3-N（B）、TN（C）濃度和去除率變化Fig.2 Changes of NH＋4-N（A），NO-3-N（B），TN（C）concentration and removal rate during experiment period

圖3 水溫及出水TOC濃度Fig.3 Changes of water temperature and TOC

2.2 生物膜微生物群落動態(tài)分析

不同時期玉米芯表面生物膜微生物群落結(jié)構(gòu)圖如圖4所示，生物膜上脫氮優(yōu)勢種如表4所示。生物膜上硝化細(xì)菌主要由亞硝酸螺菌屬（Nitrosospira）、亞硝酸單胞菌屬（Nitrosomonas）、亞硝酸球菌屬（Nitrosococcus）3個屬組成。反硝化菌主要由產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）、副球菌屬（Paracoccus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、脫氮硫桿菌（Thiobacillus denitrificans）組成。

圖4 微生物門水平（A）及屬水平（B）群落結(jié)構(gòu)及相對豐度Fig.4 Bacterial community and abundance（A：at phylum level；B：at genus level）

表4 脫氮菌優(yōu)勢種類分析Tab.4 Dominant species of nitrobacteria and denitrobacteria

由表4可以看出，代表富集培養(yǎng)的反硝化菌液的3號樣品檢測出4個種類的硝化細(xì)菌和7個種類的反硝化菌；代表富集培養(yǎng)的硝化菌液的4號樣品檢測出4個種類的硝化細(xì)菌和7個種類的反硝化菌；代表掛膜成功的1號樣品共檢出4個種類的硝化細(xì)菌和8個種類的反硝化菌；代表裝置運行前期狀態(tài)的5號樣品檢測出1個種類的硝化細(xì)菌和8個種類的反硝化菌，；代表裝置運行中期狀態(tài)的6號樣品檢測出2個種類的硝化細(xì)菌和8個種類的反硝化菌；代表裝置運行后期狀態(tài)的2號樣品檢測出2個種類的硝化細(xì)菌和6個種類的反硝化菌。綜上所述，從脫氮微生物菌群的種類組成來看，排列順序為：1＞3、4＞5、6＞2，可見隨著運行時間的延長，生物膜上脫氮微生物種類呈下降趨勢。此外，每個樣品中反硝化菌種類明顯比硝化細(xì)菌種類多，這個結(jié)果和硝酸鹽去除率高于氨氮去除率高度對應(yīng)。

從脫氮微生物優(yōu)勢種來分析，代表富集培養(yǎng)的反硝化菌液的3號樣品脫氮微生物優(yōu)勢種為假單胞菌屬（Pseudomonas）反硝化菌和脫氮硫桿菌（Thiobacillus denitrificans）。代表富集培養(yǎng)的硝化菌液的4號樣品脫氮微生物優(yōu)勢種為亞硝酸螺菌屬（Nitrosospira）和亞硝酸單胞菌屬（Nitrosomonas）硝化菌。代表掛膜成功的1號樣品脫氮微生物優(yōu)勢種為假單胞菌屬（Pseudomonas）反硝化菌。代表裝置運行前期狀態(tài)的5號樣品脫氮微生物優(yōu)勢種為假單胞菌屬（Pseudomonas）反硝化菌、脫氮硫桿菌（Thiobacillus denitrificans）以及脫氮副球菌屬（Paracoccus）。代表裝置運行中期狀態(tài)的6號樣品脫氮微生物優(yōu)勢種為假單胞菌屬（Pseudomonas）反硝化菌和脫氮硫桿菌（Thiobacillus denitrificans），以及亞硝酸單胞菌屬（Nitrosomonas）硝化菌。代表裝置運行后期狀態(tài)的2號樣品脫氮微生物優(yōu)勢種為脫氮硫桿菌（Thiobacillus denitrificans）。經(jīng)過對脫氮微生物生物量的統(tǒng)計分析得出，6個樣品脫氮微生物生物量由大到小順序為：5＞4＞1＞3＞6＞2，可見運行初期狀態(tài)的5號樣品脫氮微生物最多，而掛膜成功的1號樣品和硝化菌富集培養(yǎng)液的4號樣品次之，脫氮微生物數(shù)量最少的是試驗結(jié)束后采集的2號樣。這與出水TN濃度變化相一致。

3 討論

3.1 新型工藝優(yōu)缺點分析

本實驗采用玉米芯同時作為反硝化碳源和生物膜載體，借助獨特的人工強化掛膜技術(shù)實現(xiàn)了高DO狀態(tài)下的同步硝化反硝化脫氮。國內(nèi)外學(xué)者對同步硝化反硝化技術(shù)進(jìn)行過不少研究［10－19］，如曹國民等［10－11］以聚乙烯醇為載體，采用冷凍－解凍法混合并固定富集培養(yǎng)的硝化菌和反硝化菌，實現(xiàn)了SND。本研究采用人工富集培養(yǎng)結(jié)合新型強化掛膜方式，實現(xiàn)了SND，并取得了明顯的脫氮凈化效果。HYUNGSEOL等［12］采用間歇曝氣－排出工藝初步實現(xiàn)了亞硝酸型同步硝化反硝化作用，并且通過實驗構(gòu)建了該工藝SND廢水脫氮控制參數(shù)。LIANG等［13］采用垂直生物膜反應(yīng)器研究同步硝化反硝化脫氮效果時，發(fā)現(xiàn)總氮去除率最高達(dá)57.94%。本實驗結(jié)果表明，在進(jìn)水高DO情況下，裝置仍能取得較好的脫氮作用，TN去除率最高達(dá)86.61%，脫氮效果優(yōu)于已有報道。

本實驗采用易獲取、易降解、微生物易附著的農(nóng)業(yè)廢棄物玉米芯作為反硝化碳源，目前針對該外加碳源的研究較少。王芳等［15］在立體生態(tài)浮床中層填料中添加玉米芯，運行2個月后NH＋4-N、TN和CODMn的去除率分別達(dá)到96.77%、95.51%和77.75%，其中玉米芯對總氮去除貢獻(xiàn)率為40%。XU等［16］通過研究玉米芯固體碳源的脫氮效果，發(fā)現(xiàn)硝酸鹽去除率達(dá)80%以上，且表現(xiàn)出較強的持久供碳能力。玉米芯凹凸結(jié)構(gòu)，表面積大，便于微生物附著生長，啟動時間相對縮短，這與其它報道相比節(jié)省了時間［17，20］。另有研究表明［21－22］，以水體中 NO-3-N去除量計算反硝化費用，甲醇、乙醇、乙酸、PHB、PCL、棉花費用分別為 2.0～4.0μkg－1、2.4 μkg－1、8.0μkg－1、21.0～37.2μkg－1、6.6～8.9 μkg－1、2.12μkg－1，而玉米芯僅為 0.113μkg－1。相比而言，本研究工藝極大地簡化了傳統(tǒng)生物脫氮工藝流程，并提高了脫氮效率，節(jié)省了投資和時間，明顯提高了處理效果，為今后養(yǎng)殖水體凈化工藝和農(nóng)業(yè)廢棄物的再利用提供了理論基礎(chǔ)。但本工藝也存在缺陷，如出水有機物含量偏高，存在二次污染隱患，因此后續(xù)研究中將根據(jù)單位體積養(yǎng)殖廢水凈化所需碳源量精確計算玉米芯的投放量。

3.2 溫度及碳源對脫氮效果的影響

本研究發(fā)現(xiàn)溫度對新型工藝脫氮性能影響較大，當(dāng)溫度低于20℃時，裝置脫氮作用明顯降低，TN去除率從85%降至50%以下。溫度回升后裝置脫氮性能又呈上升趨勢，TN去除率重回63%以上。李賢勝［23］研究溫度對同步硝化反硝化過程中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度在6～30℃之間時，氨氮去除率與溫度成正比，而當(dāng)溫度低于6℃或者高于30℃時，去除率下降。也有研究［24］發(fā)現(xiàn)10～20℃硝化菌較為活躍，20～25℃時反硝化菌較為活躍，這與本實驗溫度低于20℃時，TN去除率下降，尤其是硝化作用減弱的現(xiàn)象一致。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)碳源對裝置脫氮效率有較大影響。在實驗后期，碳源出現(xiàn)供應(yīng)不足時，裝置TN去除率明顯下降。碳源作為異養(yǎng)反硝化菌必需的物質(zhì)和能量來源，其含量直接影響反硝化作用的進(jìn)行。裝置運行初期，碳源供應(yīng)較為充足，裝置脫氮能力較高，后期當(dāng)出水TOC濃度降低至20 mg·L－1以下時，總氮、硝酸鹽去除率呈快速下降趨勢，這與出水TOC濃度變化趨勢高度擬合。胡宇華等［25］通過研究同步硝化反硝化體系中有機碳對氨氮去除率的影響，得出在進(jìn)水初始氨氮濃度為35 mg·L－1時，當(dāng)水體有機碳濃度在400～1 000 mg·L－1時，氨氮降解率最高可達(dá)到99.5%。周丹丹等［26］研究有機碳對同步硝化反硝化作用影響時，發(fā)現(xiàn)總氮去除率隨C∶N比增加而增加，碳氮比為10.05時，總氮去除率達(dá)到最高70.39%。趙冰怡等［27］通過實驗證明，當(dāng)增加碳源使C∶N比為6∶1～8∶1時，總氮去除率最高，為79% ～89%，碳源減少時，總氮去除率也隨之降低。魏海娟等［28］通過研究外加碳源對TN削減的影響發(fā)現(xiàn)，葡萄糖作為安全和經(jīng)濟情況下的最佳碳源，TN去除率最高時為80.55%。因此，今后要在延長或改進(jìn)碳源的后續(xù)添加工藝對廢水脫氮的影響方面開展進(jìn)一步研究。

3.3 新型工藝同步硝化反硝化脫氮機理分析

從物理學(xué)角度來看，本研究裝置中實現(xiàn)同步硝化反硝化作用的主要原因為：反應(yīng)器內(nèi)氧氣混合不均勻，且DO在生物膜內(nèi)傳遞時通過滲透擴散，因此形成玉米芯生物膜外部DO較高，內(nèi)部DO較低現(xiàn)象。本研究采用農(nóng)業(yè)廢棄物玉米芯作為新型碳源，人為在玉米芯表面掛膜形成以反硝化菌為主的厭氧生物膜內(nèi)膜及以硝化菌為主的好氧生物膜外膜，從而促進(jìn)SND的實現(xiàn)，本研究結(jié)果也很好地反映了該工藝裝置具有很好的脫氮效果。此外，外層硝化菌在硝化過程中消耗了大量溶氧，進(jìn)一步促進(jìn)了生物膜內(nèi)部缺氧微環(huán)境的產(chǎn)生。本工藝在進(jìn)水高DO情況下仍能維持良好的脫氮效果，另一個因素也同樣不可忽視，即由于載體碳源玉米芯的分解，進(jìn)一步降低了生物膜內(nèi)層的DO水平，從而使得生物膜內(nèi)層始終處于缺氧或厭氧狀態(tài)。經(jīng)微生物分解后的玉米芯源源不斷的為內(nèi)層反硝化菌提供了反應(yīng)所需的電子供體，促進(jìn)了反硝化的順利進(jìn)行。有機碳源越充分，水體C∶N越高，反硝化獲得的碳源越充足，SND越明顯，這一觀點得到了較多研究者的認(rèn)可［26，29－30］。

從生物膜上微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果來看，發(fā)現(xiàn)隨著運行時間延長，生物膜上脫氮微生物的種類和數(shù)量均出現(xiàn)下降。即從脫氮微生物菌群的種類組成來看，排列順序為：代表掛膜成功的1號樣品脫氮微生物種類最多，其次是代表實驗前期和中期的5號和6號樣品，種類最少的是經(jīng)過長期運行后采集的2號樣品。這一結(jié)果表明人工干預(yù)的快速掛膜方式是可行并成功的，且隨著裝置運行時間的延長，生物膜上脫氮微生物種類會有所降低。這可能是水流原因部分生物膜脫落，且實驗中期溫度起伏變化較大對菌種數(shù)量和種類具有一定影響。從脫氮微生物數(shù)量上來看，代表實驗運行前期的5號樣品生物量最多，其次是代表掛膜成功時的1號樣品，脫氮微生物數(shù)量最少的是代表實驗后期的2號樣品。這一結(jié)論與新型脫氮裝置長期運行后脫氮效果有所降低相一致，從生物膜上微生物層面闡述了新型脫氮裝置的脫氮機理。

4 小結(jié)

（1）以農(nóng)業(yè)廢棄物－玉米芯為碳源和載體的養(yǎng)殖廢水脫氮強化工藝，通過人工強化掛膜的方式實現(xiàn)了內(nèi)層以反硝化菌為主，外層以硝化菌為主的微生物群落結(jié)構(gòu)，使玉米芯表面有效形成外層好氧－內(nèi)層厭氧環(huán)境，從而實現(xiàn)SND過程，有效去除養(yǎng)殖水體的硝酸鹽和氨氮，兩者的去除率最高分別達(dá)98.80%和64.64%，新工藝減小了占地面積，降低了能源消耗和基建投資。

（2）溫度變化對裝置脫氮效率影響較大。實驗運行期間，由于外界溫度驟降，導(dǎo)致裝置脫氮效果下降明顯。因此，建議在實際應(yīng)用中需在溫度變化較大區(qū)域安裝控溫裝置。

（3）微生物群落結(jié)構(gòu)分析表明，玉米芯介導(dǎo)的新型裝置生物膜上微生物以反硝化菌為主，硝化菌為輔，且每個樣品中反硝化菌種類明顯比硝化細(xì)菌種類多；不同運行時間，生物膜上脫氮微生物生物量由大到小順序為：前期〉中期〉后期，即隨著運行時間的延長脫氮微生物量呈下降趨勢。

（4）本實驗中，裝置運行前期的出水有機物含量偏高，易造成二次污染，因此在后續(xù)研究中，我們將根據(jù)單位體積污水凈化所需碳源量來深入計算玉米芯的投放量。

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