栗婷婷,徐彥軍,王 倩,林珈好,林德貴

(1.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 海淀 100193;2.中國農業(yè)大學理學院,北京 海淀 100193)

1 儀器與藥品

安捷倫1100高效液相色譜儀。TAX(純度:99.5%);TAX對照品(美侖生物,批號20121213,純度>99%);CUR(純度:95%);CUR對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號1100823-201405,純度:98.9%);正硅酸四乙酯(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);十六烷基三甲基溴化銨(化學純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);大豆卵磷脂(德國Lipoid公司,純度>94%);膽固醇(美國Amresco分裝);甲醇(色譜純,Fisher公司);乙腈、甲酸(色譜純,Merck公司)。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 取TAX、CUR對照品,用甲醇精確配制濃度為600 μg/mL的TAX、CUR混合對照品儲備液,記為1號。移液管取1號儲備液,以甲醇精確配制得 300 μg/mL、60 μg/mL、30 μg/mL、15 μg/mL、6 μg/mL、3 μg/mL、1.5 μg/mL 系列濃度TAX、CUR對照品溶液,標記為2至8號。各濃度對照品溶液均經0.22 μm微孔濾膜過濾至HPLC進樣瓶。

2.1.2 供試品溶液 將3 mg TAX、30 mg CUR 及適量介孔SiO2(MSNs)加入20 mL氯仿中超聲混勻。220 r/min搖床震蕩19 h后 14 000 r/min離心20 min。 量取0.2 mL 上清,加1.8 mL 甲醇混勻,經0.22 μm濾膜過濾至HPLC進樣瓶。藥物總量減去上清中藥物含量即藥物載入量。

2.1.3 陰性對照溶液 精密稱取處方量的MSNs,制備空白 MSNs,量取 0.2 mL 參照“2.1.2”項下操作,制備陰性對照溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱:Eclipse XDB-C18 柱(150 mm ×4.6 mm,5 μm);流動相:A相為乙腈,B相為0.1%甲酸水溶液,梯度洗脫見表1;流速:1 mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:227 nm;進樣體積:5 μL。

表1 流動相梯度洗脫時間

結果見圖l,TAX、CUR保留時間分別為14.95 min、14.4 min,峰型良好,無明顯前延或拖尾。 分離度為2.81,理論塔板數與拖尾因子均符合要求。MSNs等輔料不影響二者檢測。

南京明城墻是明太祖朱元璋（1328－1398）定都南京的產物和象征，是中國歷史上唯—建造在江南的統(tǒng)一全國的都城城墻。

圖1 專屬性試驗高效液相色譜圖

2.3 標準曲線繪制 按2.2項下 HPLC方法,取2.1.1 項下 4～8 號(1.5～30 μg/mL)溶液各進樣 3次,以峰面積平均值X為橫坐標,濃度Y(μg/mL)為縱坐標,繪制標準曲線,回歸統(tǒng)計。TAX低濃度回歸方程(n=5):Y=(X-1.840 0)/10.860 1,R2=0.999 7。CUR低濃度回歸方程(n=5):Y=(X+4.652 0)/10.3471,R2=0.999 9。 取2-6 號(6～300 μg/mL)溶液重復上述操作,得TAX高濃度回歸方程(n=5):Y=(X-14.867 4)/10.277 5,R2=1.000 0。CUR高濃度回歸方程(n=5):Y=(X+32.374 7)/11.9262,R2=0.999 9。 兩藥高、低濃度標準曲線見圖2。

2.4 精密度試驗 取 2.1.1項下 3號溶液(60 μg/mL),經 0.22 μm 濾膜過濾至 HPLC 進樣瓶,以建立的HPLC方法,連續(xù)進樣6次,每次5 μL,記錄峰面積。結果TAX、CUR的RSD分別為0.63%、0.34%(n=6),均小于2%,說明此方法精密度良好。

圖2 TAX、CUR標準曲線

2.5 穩(wěn)定性試驗 取2.1.1 項下3 號溶液(60 μg/mL),經0.22 μm濾膜過濾至HPLC進樣瓶,以建立的 HPLC 方法,分別將樣品在0、3、6、9、12、15、18、21 h室溫進樣測定,記錄峰面積。結果TAX、CUR在室溫21 h內的 RSD分別為 1.37%、1.76%(n=8),均小于2%,說明樣品在21 h內檢測性質穩(wěn)定。

2.6 加樣回收試驗 取 300 μg/mL、60 μg/mL、6 μg/mL對照品溶液各 0.6 mL,加 0.6 mL 甲醇混勻,制得高、中、低濃度的TAX、CUR混合溶液,每個濃度平行操作3份,以建立的HPLC方法測定TAX、CUR含量,計算加樣回收率,結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果

高、中、低 3個濃度 TAX的 RSD值分別為1.53%、1.02%、0.70%,CUR 的 RSD 值分別為0.04%、1.04%、0.47%,均不超過 2%,方法回收率合格。

2.7 含量測定 取3批MSNs樣品離心后上清各0.2 mL,分別按2.1.1項下方法制備供試品溶液,測定其中TAX、CUR含量。結果見表3,3批樣品上清中 CUR 含量為(1 051.50 ±43.90)μg/mL(RSD=4.17%,n=3),TAX含量低于最低檢測限,故以標準曲線最低濃度計算,為(15 ±0)μg/mL(RSD=0%,n=3)。

表3 MSNs中TAX、CUR含量及包封率

3 討論

TAX在甲醇、乙醇、乙腈中的檢測波長一般為227 nm左右,CUR在甲醇中的檢測波長一般為420 nm左右。為能在同一色譜條件下同時測定TAX與CUR含量,我們在227 nm及420 nm左右摸索了多個檢測波長,發(fā)現227 nm處兩者均有較大吸收,故以其為本方法的檢測波長。

選擇色譜條件時,根據2010版藥典及多篇參考文獻[9-11],嘗試多種方法。根據文獻,檢測TAX、CUR均常用C18色譜柱(250 mm或150 mm×4.6 mm,5 μm),考慮儀器條件,最終選擇Eclipse XDB-C18柱(150 mm ×4.6 mm,5 μm)。 檢測 TAX 常用甲醇、水、乙腈以適當比例組合作為流動相。檢測CUR常用乙腈、4%～5%冰醋酸、水以適當比例組合作為流動相。且大多文獻采用等度洗脫的方法。因此,我們最初嘗試了甲醇、乙腈、甲酸等多種流動相及多種比例組合進行等度洗脫,發(fā)現兩藥不能很好的分離。在此基礎上,進一步嘗試梯度洗脫的方法,最終確定乙腈-0.1% 甲酸水梯度洗脫系統(tǒng),分離效果最佳。

本研究建立了HPLC法同時測定TAX-CUR介孔SiO2/脂質復合遞藥系統(tǒng)中兩藥含量的方法,該方法操作簡便、快速、準確、重復性好,可以用于TAX-CUR介孔SiO2/脂質復合遞藥系統(tǒng)的質量控制。

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