張 婷 蔣世燁 金星星 張文靈 余 納 李曉林 朱國琴 周逸嬋 邵 耘 孫為豪南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年消化科(210029)

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)居惡性腫瘤第四位和第二位［1］。我國是胃癌發(fā)病率最高的國家之一，胃癌已嚴(yán)重影響國人生命健康，是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。目前治療胃癌最有效的方法是根治性手術(shù)和術(shù)后輔助化療，然而手術(shù)治療無法完全避免胃癌局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能性，而傳統(tǒng)化療藥物的不良反應(yīng)則嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。因此尋找無毒或低毒的有效治療藥物對胃癌治療具有重要意義。目前中草藥及其提取物的抗癌作用越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。駱駝蓬為蒺藜科植物駱駝蓬屬多年生草本植物的全草，是維吾爾族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)使用已久的藥材。駱駝蓬堿(harmine)是駱駝蓬中的有效單體化合物，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗腫瘤血管生成等作用，已成為近年腫瘤化學(xué)預(yù)防研究的熱點(diǎn)［2-4］。本課題組前期研究［5］發(fā)現(xiàn)，駱駝蓬堿可通過下調(diào)環(huán)氧合酶-2(COX-2)表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，其具體分子機(jī)制尚未完全明確。

PTEN基因作為一種抑癌基因，在多種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可經(jīng)由PI3K/Akt途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖、分化、凋亡［6-7］。鼠雙微體2(murine double minute 2，MDM2)是原癌基因mdm2的產(chǎn)物，可結(jié)合抑癌基因p53，并誘導(dǎo)其泛素化降解，進(jìn)而對細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡以及DNA損傷修復(fù)等發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。已有研究［8-9］證實(shí)MDM2與多種腫瘤，尤其是胃癌、結(jié)直腸癌等消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究旨在檢測駱駝蓬堿對兩種不同分化程度、COX-2高表達(dá)的人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901、MKN-45增殖和凋亡的影響，探討PTEN/Akt/MDM2信號通路在該過程中的作用。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑

人胃腺癌中分化細(xì)胞株SGC-7901購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，人胃腺癌低分化細(xì)胞株MKN-45購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。駱駝蓬堿、MTT(Sigma-Aldrich LLC.);Hoechst 33342(碧云天生物);COX-2、MDM2、磷酸化MDM2(p-MDM2)、GAPDH抗體和HRP標(biāo)記的二抗(Abcam plc.);PTEN、Akt、磷酸化 Akt(p-Akt)抗體(Cell Signaling Technology，Inc.)。

二、方法

1.藥物配制：駱駝蓬堿以DMSO溶解后加入RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，DMSO終濃度不超過0.1%，以0.22 μm孔徑濾膜過濾除菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.細(xì)胞培養(yǎng)：SGC-7901和MKN-45細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱中培養(yǎng)生長，隔天換液，3 d傳代一次。

3.MTT法檢測細(xì)胞增殖活性：取對數(shù)生長期細(xì)胞，以0.25%胰酶消化，低速離心，收集細(xì)胞，制成濃度2×107/L的單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板(200 μL/孔)，常規(guī)培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁，換無血清RPMI-1640培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h。以駱駝蓬堿(2、4、8、16、32 μg/mL)干預(yù)，并設(shè)置不予藥物處理的對照組。培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h 后，加入 20 μL MTT(5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄上清液，加入 150 μL DMSO終止反應(yīng)。將96孔板移入平板震蕩器，水平震蕩10 min，使MTT充分溶解，于酶聯(lián)免疫檢測儀波長570 nm處測定吸光度(A)值，以未接種細(xì)胞、僅加入培養(yǎng)基的空白孔調(diào)零。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，每組設(shè)4個復(fù)孔。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對照組) × 100%。

4.Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡：取對數(shù)生長期細(xì)胞，制成1×105/L的單細(xì)胞懸液，接種于12孔培養(yǎng)板(2 mL/孔)，常規(guī)培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁，棄培養(yǎng)基，以駱駝蓬堿(4、8、16 μg/mL)干預(yù)，并設(shè)置不予藥物處理的對照組。培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗滌3次，預(yù)冷4%甲醛4℃固定10 min，PBS洗滌3次;加入DNA染料Hoechst 33342(5 mg/L)，室溫避光染色10 min，PBS洗滌3次。于倒置相差熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)，拍照并保存成像記錄。

5.細(xì)胞蛋白提取和蛋白質(zhì)印跡法：取對數(shù)生長期細(xì)胞，以駱駝蓬堿(4、8、16 μg/mL)干預(yù)，并設(shè)置不予藥物處理的對照組;培養(yǎng)48 h后，預(yù)冷PBS洗滌3次，加入100 μL細(xì)胞裂解液(Nonidet P-40 1%，脫氧膽酸鈉 5 g/L，SDS 1 g/L，PMSF 0.1 g/L，抑肽酶10 mg/L)，4℃裂解細(xì)胞1 h，11 000×g 4℃離心10 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。以等量蛋白行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至 PVDF膜，室溫封閉1 h，分別加入一抗(PTEN抗體、Akt抗體、p-Akt抗體、MDM2抗體、p-MDM2抗體、COX-2抗體和GAPDH 抗體，工作濃度分別為：1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶50 000、1∶1 000 和1∶10 000)，4℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h。ECL發(fā)光，X線膠片感光，使用ImageJ圖像分析軟件對蛋白電泳條帶灰度進(jìn)行半定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以ˉx±s表示，兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。藥物濃度與細(xì)胞增殖抑制率關(guān)系的分析采用線性回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、駱駝蓬堿對SGC-7901、MKN-45細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測顯示，隨著駱駝蓬堿濃度的增加和作用時間的延長，SGC-7901、MKN-45細(xì)胞增殖抑制率呈升高趨勢，表明駱駝蓬堿可呈劑量和時間依賴性地抑制胃癌細(xì)胞增殖(圖1)。

對駱駝蓬堿濃度(X)與細(xì)胞增殖抑制率(Y)進(jìn)行一元線性回歸分析，得到直線回歸方程。駱駝蓬堿對SGC-7901細(xì)胞干預(yù)24 h、48 h和72 h的回歸方程分別為：^Y=1.740 776X+2.713 328(R2=0.985，P ＜0.01);^Y=1.953 186X+13.334 820(R2=0.829，P ＜0.01);^Y=2.276 888X+14.559 218(R2=0.847，P＜0.01)。駱駝蓬堿對MKN-45細(xì)胞干預(yù)24 h、48 h和72 h的回歸方程分別為：^Y=2.157 440X+10.069 486(R2=0.892，P ＜0.01);^Y=2.638 137X+18.245 632(R2=0.796，P ＜0.01);^Y=2.559 371X+31.418 852(R2=0.680，P＜0.01)。證實(shí)駱駝蓬堿對胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用具有劑量依賴性。根據(jù)回歸方程計(jì)算駱駝蓬堿對SGC-7901、MKN-45細(xì)胞干預(yù)24 h、48 h和72 h的50%抑制濃度(IC50)，其值分別為(27.16±1.56)μg/mL和(18.51±0.68)μg/mL、(18.77±0.25) μg/mL 和(12.04±0.07) μg/mL、(15.56±0.37) μg/mL和(7.26±0.25) μg/mL。

二、駱駝蓬堿對SGC-7901、MKN-45細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)駱駝蓬堿干預(yù)48 h后，SGC-7901、MKN-45細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞核濃聚深染，核內(nèi)可見致密的顆粒狀熒光，細(xì)胞核固縮形成凋亡小體，細(xì)胞膜和核膜完整(圖2)。

三、駱駝蓬堿對 PTEN、COX-2表達(dá)以及 Akt、MDM2磷酸化的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，駱駝蓬堿可呈劑量依賴性地上調(diào)SGC-7901、MKN-45細(xì)胞的PTEN表達(dá)(圖3A)，抑制 Akt、MDM2 磷酸化(圖 3B、3C)以及COX-2表達(dá)(圖3D)。

討 論

COX-2是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶。本課題組前期研究［5，10-12］發(fā)現(xiàn)，COX-2 在胃癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，特異性COX-2抑制劑可有效抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，駱駝蓬堿可通過下調(diào)COX-2表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。然而，駱駝蓬堿抑制COX-2表達(dá)的具體分子機(jī)制尚不明確。

圖1 駱駝蓬堿干預(yù)對SGC-7901、MKN-45細(xì)胞增殖的影響(MTT法)

圖2 駱駝蓬堿干預(yù)對SGC-7901、MKN-45細(xì)胞凋亡的影響(Hoechst染色，×100)

圖3 駱駝蓬堿干預(yù)對SGC-7901、MKN-45細(xì)胞PTEN、COX-2表達(dá)以及Akt、MDM2磷酸化的影響(蛋白質(zhì)印跡法)

本研究發(fā)現(xiàn)駱駝蓬堿可呈劑量依賴性地上調(diào)人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901、MKN-45 PTEN表達(dá)，抑制Akt、MDM2磷酸化以及COX-2表達(dá)，表明駱駝蓬堿抑制胃癌細(xì)胞COX-2表達(dá)以及胃癌進(jìn)展的機(jī)制可能與PTEN/Akt/MDM2信號通路有關(guān)。PI3K/Akt信號通路可誘導(dǎo)MDM2表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［13-14］，而PTEN可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路調(diào)控胃癌細(xì)胞的分化、增殖［6-7］。本課題組前期研究［15］證實(shí) PI3K/Akt信號通路活化后可促進(jìn)COX-2表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖。Liu等［16］發(fā)現(xiàn)駱駝蓬堿可通過抑制Akt磷酸化，降低惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力并誘導(dǎo)其凋亡。Kuo等［17］證實(shí)黃連素(berberine)可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。Dung等［18］發(fā)現(xiàn)地奧司明(diosmin)可通過阻斷 PI3K/Akt/MDM2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及下調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長。Proietti等［19］證實(shí)褪黑素(melatonin)可通過下調(diào)PI3K/Akt信號通路依賴的MDM2磷酸化，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。Nag等［20］發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)中藥組分人參皂苷(ginsenosides)的抗腫瘤作用與其對PI3K/Akt/MDM2信號通路和COX-2表達(dá)的抑制作用有關(guān)。由此推測，駱駝蓬堿可能通過PTEN/Akt/MDM2信號通路下調(diào)COX-2表達(dá)，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。然而該結(jié)論仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證，如在各信號分子激動劑、抑制劑的作用下檢測PTEN、COX-2表達(dá)以及Akt、MDM2磷酸化水平。此外，由于細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制非常復(fù)雜，駱駝蓬堿對胃癌細(xì)胞COX-2表達(dá)的抑制作用可能還與其他信號通路以及不同信號通路間的交互作用(如cross-talk等)有關(guān)，欲全面了解其分子機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

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