劉 娜 姚艷粉 原 雙

(山東省交通醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東 濟(jì)南 250031)

急性胰腺炎(AP)根據(jù)嚴(yán)重程度分為輕癥、中癥和重癥AP，其中輕癥AP較為常見(jiàn)，預(yù)后良好，但重癥AP病情多變，常伴有局部并發(fā)癥和臟器功能衰竭，致死率高〔1〕。胰腺腺泡細(xì)胞凋亡與AP的發(fā)生發(fā)展關(guān)系十分密切，已成為AP發(fā)病機(jī)制及治療的一個(gè)研究熱點(diǎn)〔2～4〕。MicroRNA(miRNA)在機(jī)體生理活動(dòng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系緊密。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在AP患者中存在低表達(dá)，且隨病情的發(fā)展而降低，與AP的發(fā)生與發(fā)展有密切關(guān)系〔5〕，但其對(duì)AP腺泡細(xì)胞凋亡影響的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)雨蛙素處理大鼠胰腺腺泡AR42J細(xì)胞構(gòu)建AP環(huán)境后，觀察miR-21表達(dá)，并通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方式下調(diào)其表達(dá)后，觀察其對(duì)AR42J細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠胰腺腺泡AR42J 細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)American Type Culture Collection公司。雨蛙素購(gòu)于美國(guó)sigma公司，胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)和青鏈霉素購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-6酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購(gòu)于上海普盛生物公司，淀粉酶(AMY)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Bio Assay Systems公司，Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒、Trizol試劑、Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)于美國(guó)Millipore公司，β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體、第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(PTEN)抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切caspase)-3抗體及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。RNA 提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司，miRNA-21 inhibitor 購(gòu)于上海吉瑪基因公司，RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)于上海生工生物工程有限公司，NanoDrop2000和細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司，電泳儀和電轉(zhuǎn)儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及AP細(xì)胞模型構(gòu)建 將AR42J細(xì)胞培養(yǎng)在加有RPMI1640培養(yǎng)基(含有10%的胎牛血清和抗生素)的培養(yǎng)瓶中，置于CO2濃度為5%的37℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。造模前1 d，取6孔細(xì)胞板，將培養(yǎng)的AR42J以55 000個(gè)/孔進(jìn)行接種，每孔加入1 ml RPMI1640培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。加濃度為15 nmol/L雨蛙素，震蕩混勻后，置于孵箱中培養(yǎng)至所需時(shí)間點(diǎn)(0、4、8、12和24 h)后收集上清液及AR42J細(xì)胞，備用。

1.2.2AMY、TNF-α和IL-6檢測(cè) 參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟檢測(cè)上述雨蛙素處理后的AR42J細(xì)胞上清液中AMY、TNF-α和IL-6的濃度。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.3RT-qPCR檢測(cè)miR-21表達(dá) 將AR42J細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 ml的EP管，離心后棄上清。經(jīng)PBS洗滌后，加入Trizol試劑抽提總RNA，并以NanoDrop2000定量。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并以其為模板鏈20 μl反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：cDNA 1 μl，2×Master Mix 10 μl，F(xiàn)/R引物各0.5 μl，ddH2O 8 μl。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃ 6 min循環(huán)1次，變性95℃ 15 s循環(huán)40次，退火60℃ 60 s循環(huán)40次。以U6為內(nèi)參，2-△△CT法進(jìn)行分析。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.4轉(zhuǎn)染 在轉(zhuǎn)染前1 d，以6孔板接種550 000個(gè)雨蛙素處理過(guò)的AR42J細(xì)胞，隨機(jī)分為AP組、AP+NC組和AP+miR-21 inhibitor組。先以無(wú)血清培養(yǎng)基分別稀釋Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑、miR-21 inhibitor和陰性對(duì)照miRNA，使miR-21 inhibitor和陰性對(duì)照miRNA終濃度為100 nmol/L。再將稀釋過(guò)的Lipo2000溶液與miR-21 inhibitor混勻加入AP+miR-21 inhibitor組細(xì)胞中，Lipo2000溶液與陰性對(duì)照miRNA混勻后加入AP+NC組細(xì)胞中，而AP組中只加入Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑。置于孵箱中培養(yǎng)，待轉(zhuǎn)染6 h后，更換為完全培養(yǎng)基后再繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.5流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡 取1.2.1中未經(jīng)雨蛙素處理的AR42J細(xì)胞(設(shè)為對(duì)照組)和上述轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的AP組、AP+NC組和AP+miR-21 inhibitor組細(xì)胞，按照Annexin V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取均值。

1.2.6Western印跡檢測(cè)酶切caspase-3和PTEN蛋白表達(dá) 收集AP組、AP+NC組和AP+miR-21 inhibitor組細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后，離心棄上清。加入RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白，并以BCA法進(jìn)行定量。將配制好的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)放入盛有適量 1倍蛋白電泳緩沖液的電泳槽內(nèi)，以每孔50 μg蛋白樣本上樣，進(jìn)入分離膠之前采用90 V電壓，之后改用120 V電壓至電泳結(jié)束。采用半干法將蛋白凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜2 h后，將膜取出，置于含有5% 脫脂牛奶的封閉液中常溫下反應(yīng)2 h。加入1 000倍稀釋的一抗(酶切caspase-3抗體和PTEN)4℃下孵育24 h后，置于TBST溶液中以每次15 min洗膜3次，再置于2 000倍稀釋的二抗中37℃下反應(yīng)2 h。經(jīng)TBST液洗膜后，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，Bio-Rad凝膠電泳成像儀掃描收集圖片，并以β-actin校正，Quantity One軟件分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和多組間ANOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1AP模型檢測(cè) 與0 h相比，雨蛙素處理4、8、12和24 h后，AMY、TNF-α和IL-6的表達(dá)均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，且均在處理8 h時(shí)達(dá)到最大(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 雨蛙素處理不同時(shí)間AR42J細(xì)胞上清液中AMY、TNF-α和IL-6表達(dá)

與0 h比較：1)P<0.05

2.2miR-21在AP環(huán)境下低表達(dá) 與0 h(1.05±0.18)相比，AR42J細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平在4 h時(shí)(0.89±0.12)變化不明顯，但在8、12和24 h時(shí)(0.35±0.07、0.20±0.02、0.18±0.03)顯著降低(P<0.05)，且從1～24 h時(shí)間內(nèi)miR-21的表達(dá)水平幾乎不變。

2.3miR-21抑制雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞凋亡 未經(jīng)雨蛙素處理的對(duì)照組AR42J細(xì)胞的凋亡率(8.37%±1.15%)較低，而經(jīng)雨蛙素處理后的細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，與AP組(21.22%±2.76%)相比，AP+NC組(22.08%±3.14%)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而AP+miR-21 inhibitor組(11.53%±1.32%)顯著降低(P<0.05)。

2.4miR-21對(duì)細(xì)胞中酶切caspase-3和PTEN蛋白表達(dá)的影響 AP組和AP+NC組中酶切caspase-3和PTEN蛋白表達(dá)水平基本相同，而AP+miR-21 inhibitor組酶切caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯低于AP組，PTEN明顯高于AP組(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表2。

圖1 Western 印跡檢測(cè)結(jié)果

組別酶切caspase?3PTENAP組032±003057±006AP+NC組035±002062±005AP+miR?21inhibitor組070±0061)118±0091)

與AP組比較：1)P<0.05

3 討 論

AP是一種急性病，盡管對(duì)其認(rèn)知和治療隨著醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展有所提高，但目前仍沒(méi)有有效的治療手段。AP的發(fā)生機(jī)制是一個(gè)多階段和多基因調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，AP的嚴(yán)重程度與胰腺腺泡細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)〔6〕。AR42J細(xì)胞是一種來(lái)自大鼠胰腺腺泡細(xì)胞瘤的細(xì)胞，因其具有易培養(yǎng)、刺激反應(yīng)大和轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)勢(shì)，多用于AP細(xì)胞模型的構(gòu)建〔7，8〕。

AP的發(fā)生和發(fā)展離不開(kāi)miRNAs的調(diào)控〔9〕。miR-21是一種與炎癥關(guān)系極為密切的miRNAs，在巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞中均有表達(dá)〔10〕。miR-21的異常表達(dá)除與腫瘤的發(fā)生有關(guān)外，還有哮喘、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等有關(guān)〔11～13〕。已有研究證實(shí)，miR-21在肺鱗癌、大腸癌和肝癌等細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔14～16〕。Das等〔17〕指出，miR-21在機(jī)體受到重大創(chuàng)傷時(shí)會(huì)下降，恢復(fù)后則又增加。Sheedy〔10〕也指出miR-21在炎癥的平衡和機(jī)體功能恢復(fù)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)miR-21在AP中低表達(dá)，且與AP的病情發(fā)展關(guān)系密切〔5〕。本研究提示，AP中miR-21可能通過(guò)抑制AP腺泡細(xì)胞凋亡加重病情的發(fā)展。

caspase-3是公認(rèn)的caspase-3家族中的執(zhí)行凋亡蛋白，與AP的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。黃亨燁等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，輕癥AP患者中caspase-3高表達(dá)，且隨著病情進(jìn)展，Caspase-3表達(dá)減弱。PTEN是PI3K信號(hào)通路中一個(gè)重要的負(fù)調(diào)控因子，除在腫瘤中發(fā)揮抑增殖和促凋亡的抑癌作用外，也與炎癥的發(fā)生有關(guān)〔19〕。吳曉鵬等〔20〕發(fā)現(xiàn)，PTEN可能通過(guò)介導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控炎性通路TLR4-NF-κB，進(jìn)而調(diào)控巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥過(guò)程。資料顯示，PTEN是miR-21下游的靶基因〔21〕，因此推測(cè)miR-21可能介導(dǎo)PTEN在調(diào)控AR42J細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究進(jìn)一步提示，在AP中，miR-21可能通過(guò)下調(diào)酶切caspase-3和上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)抑制AP腺泡細(xì)胞凋亡，進(jìn)而加重病情。

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