張鶴 宋正波 呂鏜烽 陸志偉 吳娟 宋勇

肺癌是全球發(fā)生率和病死率最高的惡性腫瘤之一，其中85%肺癌為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)[1-3]，而且50%～60%在就診時(shí)已處于晚期[4]，而晚期NSCLC患者已失去了手術(shù)根治的機(jī)會(huì)。近幾年由于分子檢測(cè)的發(fā)展，晚期NSCLC的治療從以往基于組織病理學(xué)的細(xì)胞毒化療，轉(zhuǎn)變?yōu)橐苑肿臃中蜑榛A(chǔ)的分子靶向治療與放化療、抗血管和免疫治療相結(jié)合的治療新模式。在2007年，Soda等[5]發(fā)現(xiàn)間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)基因重排或融合是NSCLC另一種較為常見的分子亞型，ALK重排患者約占NSCLC的5%，其中棘皮動(dòng)物微管相關(guān)類蛋白4(EML4)基因與ALK融合(EML4-ALK)為最常見類型[6-8]。克唑替尼作為第一代靶向藥用于ALK陽性的NSCLC患者，由于臨床研究結(jié)果表明其客觀有效率(objective response rate, ORR)高達(dá)約60%[9]，因此克唑替尼在ALK融合基因陽性晚期NSCLC患者的一線治療中占有首選地位[10]。 但是關(guān)于EML4-ALK融合基因，已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)存在多種變異體，包括變異體1，2，3a，3b，4，5a和5b等[11]。根據(jù)目前的研究，ALK變異體之間是否與克唑替尼療效相關(guān)仍然存在爭(zhēng)議[11-14]。 因此，本研究收集來自皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院、南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院南京軍區(qū)南京總醫(yī)院自2013年9月至2017年5月收治的68例ALK陽性晚期NSCLC患者的臨床病理特征及服用克唑替尼的近期療效和不良反應(yīng)進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)于有足夠初治標(biāo)本的患者進(jìn)行二代測(cè)序，分析其EML4-ALK變異體的發(fā)生率和與克唑替尼療效的相關(guān)性，從而為克唑替尼的臨床進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

本研究共納入68例患者，其中男性32例，女性36例，年齡28～62歲，中位年齡49歲；43例(63.2%)患者無吸煙史；美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組體能狀況(Eastern Cooperative Oncology Group performance status, ECOG PS)評(píng)分為0～1分的患者有57例(83.8%)。60例(88.2%)患者的病理類型為腺癌；臨床分期包括ⅢB期4例，Ⅵ期64例。68例患者中，54例用Ventana ALK(羅氏，D5F3)融合蛋白IHC診斷ALK基因融合陽性，4例用FISH法檢測(cè)ALK陽性，10例用RT-PCR法檢測(cè)ALK陽性。38例患者既往接受過化療，30例患者一線服用克唑替尼。初治時(shí)伴有腦轉(zhuǎn)移患者有13例(19.1%)，見表1。

表1 68例患者的一般特征

二、病例納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)： ①經(jīng)組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實(shí)的ⅢB～Ⅵ期NSCLC；②經(jīng)Ventana ALK免疫組化法(immunohistochemistry, IHC)或熒光原位雜交法(fluorescence in situ hybridization, FISH)或RT-PCR檢測(cè)ALK基因融合陽性；③至少有1個(gè)可測(cè)量的臨床病灶；④ECOG PS評(píng)分≤3分；⑤骨髓造血功能和肝腎功能基本正常。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)： ①患者任何可證實(shí)的嚴(yán)重心肺疾病；②患有嚴(yán)重的習(xí)慣性腹瀉或便秘，以及其他影響藥物吸收的消化系統(tǒng)疾病。

三、 治療方案及評(píng)估

1. 藥物治療： 患者口服克唑替尼膠囊250 mg/次，2次/d，直至出現(xiàn)任何疾病進(jìn)展(progressive disease, PD)的客觀證據(jù)，或發(fā)生不可耐受的不良事件。

2. 二代測(cè)序： 收集肺癌患者甲醛固定石蠟包埋(FFPE)組織，從甲醛固定的石蠟切片中提取腫瘤DNA，并將其打斷，擴(kuò)增，從而建立含目標(biāo)基因的全基因組文庫。然后采用Illumina Hiseq 4000 (Illumina, San Diego, USA) 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，將得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾并行生物信息學(xué)分析。

3. 近期療效： 根據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1(Response Evaluation Criteria in Solid Tumours1.1, RECIST 1.1)評(píng)價(jià)療效，分為完全緩解(complete response, CR)、部分緩解(partial response, PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease, SD)和疾病進(jìn)展(progressive disease, PD)。客觀有效率(objective response rate, ORR)包括CR和PR; 疾病控制率(disease control rate, DCR)包括CR、PR、SD。

4. 不良反應(yīng)評(píng)估： 按照美國(guó)國(guó)立癌癥研究所制定的通用毒性標(biāo)準(zhǔn)4.0(common toxicity criteria 4.0，CTC 4.0)評(píng)價(jià)不良反應(yīng)，分為0～Ⅵ度共5個(gè)等級(jí)。

5. 隨訪： 68例患者均獲得隨訪。患者無進(jìn)展生存期通過門診或電話隨訪獲得，末次隨訪時(shí)間為2017年10月30日?？偵嫫?overall survival, OS)指患者自首次治療起到患者死亡或末次隨訪的時(shí)間。無進(jìn)展生存期(progression free survival, PFS)定義為患者自服用克唑替尼開始到明確疾病進(jìn)展的時(shí)間。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)于不同亞組間療效比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)；對(duì)生存時(shí)間分析應(yīng)用Kaplan-Meier、Log-rank和Cox回歸進(jìn)行檢驗(yàn)和多因素分析；P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 NGS檢測(cè)結(jié)果

42例ALK陽性患者可獲取初治標(biāo)本進(jìn)行NGS檢測(cè)，其中35例(83.3%)檢測(cè)出ALK融合，7例患者未檢測(cè)出ALK陽性結(jié)果。35例EML4-ALK融合患者中，15例(42.9%)為變異體1(EX13︰EX20)，7例(20.0%)為變異體2(EX20︰EX20)，6例(17.1%)為變異體3(EX6︰EX20)，3例為變異體5(EX2:EX20)，1例為變異體7(EX14︰EX20)，3例為新變異體(EX13︰EX19；EX18︰EX17；EX21︰EX20)。

二、 臨床療效評(píng)價(jià)

68例患者治療28 d后評(píng)價(jià)療效，其中CR 4例，PR 38例，SD 16例，PD 10例。ORR達(dá)61.8%，DCR為85.3%。68例患者中位PFS為10.5個(gè)月(95% CI: 7.47 ～13.5個(gè)月)，中位OS為33.9個(gè)月 (95% CI: 25.85～42.08個(gè)月)。單因素和COX多因素回歸分析表明是否吸煙、性別、年齡、PS評(píng)分、是否腦轉(zhuǎn)移、是否一線使用克唑替尼是否影響PFS的獨(dú)立因素，結(jié)果顯示均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

三、變異體與臨床療效分析

將35例EML4-ALK融合二代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果分為變異體1(15例)和非變異體1(20例)兩組，其中兩組在性別、年齡、吸煙、PS評(píng)分、既往化療、是否腦轉(zhuǎn)移均沒有差異(P>0.05)，見表 2。35例患者中位PFS為10.7個(gè)月(95% CI: 8.22～13.23個(gè)月)，中位OS為27.3個(gè)月(95% CI: 17.40～37.25個(gè)月)。變異體1和非變異體1兩組的中位PFS分別是10.7個(gè)月和9.8個(gè)月，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.647)，見圖1。兩組的中位OS無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(27.33個(gè)月vs. 22.40個(gè)月，P=0.831)。

圖1 35例EML4-ALK變異體1和非變異體1患者的中位PFS比較(10.7vs. 9.8個(gè)月，P=0.647)

四、不良反應(yīng)

克唑替尼治療的主要不良反應(yīng)是視覺影響和消化道反應(yīng)；共25例(36.8%)患者發(fā)生視覺閃爍；惡心嘔吐發(fā)生率為30.9%(21/68)，腹瀉發(fā)生率為26.5%(18/68)；共17例(25.0%)患者有輕度肝功能異常；6例患者出現(xiàn)雙下肢浮腫。2例患者出現(xiàn)骨髓抑制；3例患者出現(xiàn)竇性心動(dòng)過緩，但未觀察到Q-T間期延長(zhǎng)。1例患者因Ⅱ度食管潰瘍減量至200 mg/次，2次/d。Ⅲ～Ⅳ度不良反應(yīng)發(fā)生率較低，3例患者出現(xiàn)了Ⅲ～Ⅳ度肝功能異常。1例患者因間質(zhì)性肺炎而停藥，見表3。

表2 35例患者EML4-ALK變異體的一般特征[n(%)]

表3 68例患者克唑替尼治療后的不良反應(yīng)

討 論

目前，精準(zhǔn)個(gè)體化治療已經(jīng)成為肺癌治療的研究熱點(diǎn)，對(duì)于有驅(qū)動(dòng)基因陽性的患者，相對(duì)應(yīng)的靶向藥物成為治療的首選。EML4-ALK基因融合繼EGFR基因突變之后常見于非小細(xì)胞肺癌的患者，而針對(duì)EML4-ALK重排的第一代靶向藥物就是克唑替尼[15]?？诉蛱婺崾强诜男》肿佣喟悬c(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，是全球首個(gè)針對(duì)ALK融合基因開發(fā)的分子靶向藥物，也是第一代ALK-TKI，對(duì)ALK和c-MET具有高選擇性抑制作用[16]。PROFILE1029的研究是對(duì)比培美曲塞聯(lián)合順鉑化療一線治療ALK陽性患者，該研究約90%受試者來自中國(guó)，研究結(jié)果顯示克唑替尼的PFS比化療明顯延長(zhǎng)(11.1個(gè)月vs. 6.8個(gè)月，P<0.001)，兩組的ORR分別是88%和46%。但是，在ALK陽性的患者中療效不盡相同，存在個(gè)體化差異，探索療效差異也是目前臨床的熱點(diǎn)。其中一個(gè)方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EML4-ALK融合基因存在多種變異體，至少有15種變異體的存在[17]，根據(jù)研究表明不同變異體的表達(dá)對(duì)療效可能有一定的影響，但是何種變異體對(duì)克唑替尼的治療有影響仍然存在爭(zhēng)議。因此，本研究在分析克唑替尼治療ALK陽性患者的療效和安全性的同時(shí)，利用二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步探究EML4-ALK變異體對(duì)克唑替尼的療效是否存在影響。

本研究中，克唑替尼治療ALK陽性患者的ORR是61.8%，中位PFS為10.5個(gè)月，以及中位OS為33.9個(gè)月?？诉蛱婺嶙鳛槎€治療的隨機(jī)Ⅲ期臨床研究PROFILE1007顯示克唑替尼的中位PFS為7.7個(gè)月[18]，ORR達(dá)65%。作為一線治療的隨機(jī)Ⅲ期臨床研究PROFILE1014和PROFILE1029分別顯示克唑替尼治療的中位PFS為10.9個(gè)月和11.1個(gè)月，ORR分別是74%和88%。本研究中38例患者既往接受過化療，但其臨床療效仍與既往報(bào)道類似，克唑替尼與傳統(tǒng)化療治療的方案在ALK陽性晚期NSCLC治療上具有明顯優(yōu)勢(shì)。

在2010年第一次有文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)在ALK變異體患者中采用克唑替尼治療的療效分析[19]，但發(fā)現(xiàn)了1例變異體2的患者。隨后有幾項(xiàng)回顧性的研究探索了變異體與克唑替尼之間的療效。Yoshida等[14]用RT-PCR的方法對(duì)35例使用克唑替尼治療的患者進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ALK變異體1最常發(fā)生(54%)，然后是變異體2(14%)和變異體3(12%)，在療效分析中顯示變異體1與非變異體1相比，不僅ORR更高(74%vs. 63%)，中位PFS也明顯延長(zhǎng)，并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(11.0個(gè)月vs. 4.2個(gè)月，P<0.05)。Lei等[16]的研究發(fā)現(xiàn)克唑替尼的療效與變異體之間沒有相關(guān)性，他們將61例患者分成3組，變異體1、變異體3和其他變異體，3組的中位PFS分別是11.0個(gè)月、10.9個(gè)月和7.4個(gè)月(P=0.795)。Cha等[20]的研究納入52例ALK陽性患者，發(fā)現(xiàn)變異體1最常見(19.2%)，其次是變異體3a/b占19.2%，變異體2占5.8%。上述研究表明變異體之間與克唑替尼的療效沒有差異。此外，在Woo等[13]研究中，他們利用RT-PCR方法檢測(cè)54例晚期ALK陽性患者，變異體3a/b是最常見類型(44.4%)，其次是變異體1(33.3%)和變異體2(11.1%)，而在ALK-TKI(克唑替尼、色瑞替尼、艾樂替尼)治療的2年生存率(26.4%vs. 76.0%，P=0.034)和2年P(guān)FS率(32.7%vs. 69.0%，P=0.108)均是變異體3a/b低于變異體1/2/其他，這提示變異體3可能和ALK抑制劑的耐藥相關(guān)。在本研究中，變異體1和非變異體1兩組的中位PFS(10.7個(gè)月和9.8個(gè)月，P=0.647)和兩組的中位OS(27.33個(gè)月vs. 22.40個(gè)月，P=0.831)均沒有差異。因此，我們認(rèn)為ALK抑制劑與EML4-ALK融合基因中的療效相關(guān)性仍未有定論，也可能與不同研究納入的患者接受ALK抑制劑治療的線數(shù)不同影響結(jié)果有關(guān)。在將來可以采用擴(kuò)大樣本量進(jìn)行前瞻性研究，同時(shí)采用高通量測(cè)序，進(jìn)一步了解是否變異體之間的不同會(huì)伴有不同的其他基因突變影響抑制劑的療效，尚值得進(jìn)一步探索。

在不良反應(yīng)方面，本研究中克唑替尼主要是視覺影響(36.8%)和消化道的不良反應(yīng)，包括惡心嘔吐(30.9%)和腹瀉(26.5%)，且均為輕度，與之前的一些研究報(bào)道的常見不良反應(yīng)類似[9-10,18]。此外，在克唑替尼治療過程中出現(xiàn)少數(shù)患者(25.0%)肝功能異常，主要體現(xiàn)在轉(zhuǎn)氨酶升高，但轉(zhuǎn)氨酶升高通常是可逆的，經(jīng)對(duì)癥治療后仍能以同樣劑量繼續(xù)治療，但需要在治療中關(guān)注。報(bào)道表明應(yīng)用克唑替尼可發(fā)生Q-T間期延長(zhǎng)和心動(dòng)過緩等心律失常，但本研究中未有Q-T間期延長(zhǎng)發(fā)生，僅3例出現(xiàn)心動(dòng)過緩，且在未出現(xiàn)不能耐受的情況仍繼續(xù)治療。另一方面，僅1例患者出現(xiàn)Ⅱ度食管潰瘍?cè)跍p量200 mg bid后能繼續(xù)接受治療。1例患者因間質(zhì)性肺炎而停藥。因此，克唑替尼的治療是具有較好的安全性，大多數(shù)患者均能耐受。

本研究尚存在一定的局限性，對(duì)于二代測(cè)序的例數(shù)仍較小樣本，尚需要更大樣本量的研究探索。此外利用二代測(cè)序中有7例患者未檢測(cè)出ALK融合，這可能與腫瘤異質(zhì)性相關(guān)。今后，可以選擇合適的病例、搜集足夠的大樣本并利用高通量測(cè)序，設(shè)計(jì)研究來進(jìn)一步證實(shí)ALK陽性在我國(guó)患者中變異體的最常見類型以及與ALK抑制劑的相關(guān)性。

總之，對(duì)于ALK陽性晚期NSCLC患者可選擇克唑替尼作為首選治療，其療效明顯，不良反應(yīng)可耐受。EML4-ALK變異體之間與克唑替尼的相關(guān)性不明顯，尚需要大樣本的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

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