元慧杰 周生儒 劉芝翠 朱海琴 許人超 鄭捷 潘萌
200025上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科
天皰瘡是一種以皮膚、黏膜為靶器官的自身免疫性大皰性皮膚病,通常認為外周血循環(huán)中的特異性抗橋粒芯糖蛋白1(desmoglein1,Dsg1)和(或)Dsg3抗體通過破壞角質(zhì)形成細胞間的橋粒結(jié)構(gòu),導致局部棘層松解,形成表皮內(nèi)水皰[1]。目前多數(shù)學者認為[2?3],天皰瘡的致病性自身抗體來源于外周血循環(huán)中的B細胞,皮膚僅作為靶器官而發(fā)生疾病。因此,目前對于天皰瘡免疫機制的研究多集中于外周血B淋巴細胞及其自身抗體的致病性[4?5],而皮損局部的免疫應答反應則未曾有報道。為明確天皰瘡患者皮損局部是否存在抗原特異性B淋巴細胞的浸潤,是否可以在局部產(chǎn)生特異性抗體,我們對尋常型天皰瘡患者皮損局部B淋巴細胞的表型及其功能進行探討。
(一)對象:2013年9月至2015年6月初診、未經(jīng)治療并隨訪于上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科的35例尋常型天皰瘡患者(皮膚黏膜型),均根據(jù)臨床表現(xiàn)、組織病理、免疫熒光和自身抗體檢測確診。健康對照皮膚組織來自皮膚科門診手術(shù)室接受色素痣切除術(shù)的22例患者。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準,患者均簽署知情同意書。
(二)主要試劑和儀器:別藻藍蛋白(APC)-抗人CD19、異硫氰酸熒光素(FITC)-抗人IgG流式抗體產(chǎn)自美國BD公司,Alexa?Fluor?647-抗人DYKDDDDK標簽抗體、藻紅蛋白(PE)-抗人His標簽抗體產(chǎn)自美國CST公司,RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、透明質(zhì)酸酶、DNA酶及Ⅴ型膠原酶產(chǎn)自美國Sigma?Aldrich公司,抗人Dsg1、Dsg3抗體ELISA試劑盒產(chǎn)自日本MBL公司,LymphoprepTM淋巴細胞分離液產(chǎn)自挪威Axis?shield公司。FACS CantoⅡ及LSR Fortessa型流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。重組人Dsg1、Dsg3由清泓生物技術(shù)(上海)有限公司合成。
(三)方法:
1.皮損局部單個核細胞分離:取12例健康對照正常皮膚和20例尋常型天皰瘡患者初發(fā)水皰或糜爛皮損組織各1 cm×1 cm,在含Ⅴ型膠原酶、DNA酶及透明質(zhì)酸酶的消化液中37℃消化2 h,用淋巴細胞分離液通過密度梯度離心法(800×g,15 min)分離獲得單個核細胞。
2.流式細胞儀檢測CD19+B細胞、CD19+IgG+B細胞、CD19+CD27+記憶B細胞及CD19+IgD+初始B細胞:每2×105個皮損單個核細胞重懸于100 μl RPMI 1640培養(yǎng)液(含5%胎牛血清)中,根據(jù)不同流式抗體組合,按照抗體與培養(yǎng)液的體積比例1∶100分別加入熒光抗體,用FACS CantoⅡ流式細胞儀和FlowJo軟件檢測和分析。
3.流式細胞儀檢測表面識別Dsg1、Dsg3的CD19+B細胞:每2×105個皮損單個核細胞重懸于100 μl RPMI 1640培養(yǎng)液(含5%胎牛血清)中,分別加入0.5 μg重組人Dsg1和Dsg3,室溫孵育1 h,培養(yǎng)液洗滌1次,根據(jù)不同流式抗體組合,按照抗體與培養(yǎng)液的體積比例1∶100分別加入熒光抗體,用FACS CantoⅡ流式細胞儀和FlowJo軟件檢測和分析。
4.皮損局部單個核細胞的體外培養(yǎng)及上清液中抗Dsg1、抗Dsg3抗體檢測:每2 × 105個細胞重懸于200 μl含10%胎牛血清、200 mg/L青霉素和200 U/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)6 d后收集上清液。
按照ELISA試劑盒的抗體檢測說明,將上清液按1∶101稀釋后加入微孔中,于室溫孵育1 h后洗滌,加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗人IgG抗體,于室溫孵育1 h,洗滌孔板后再加入底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)于室溫孵育0.5 h,加入終止液終止反應,采用全自動定量酶標儀在450 nm波長下讀取吸光度(A值),并通過試劑盒說明中的公式(A樣本-A陰參)×100%/(A陽參-A陰參)計算培養(yǎng)上清液中抗體的滴度值。
采用受試者工作特征曲線(ROC)判斷皮損處單個核細胞產(chǎn)生特異性抗體的有效性[6],根據(jù)ROC統(tǒng)計分析輸出的靈敏度與特異度,計算約登指數(shù)(靈敏度+特異度-1),約登指數(shù)最大值所對應的滴度值為臨界值,抗體滴度大于臨界值即為陽性。
5.統(tǒng)計學方法:用Graphpad 5.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以±s表示;用非參數(shù)Mann?WhitneyU檢驗及Welch′sT檢驗比較兩組間差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
(一)尋常型天皰瘡患者皮損局部B淋巴細胞比例:流式細胞儀檢測15例(分離的單個核細胞數(shù)≥2×105)尋常型天皰瘡患者皮損及12例健康對照皮膚分離后的單個核細胞,患者組淋巴細胞比例為(17.95±3.85)%,健康對照組為(7.83±1.29)%(圖1A),兩組差異有統(tǒng)計學意義(t=2.49,P=0.023 4)。患者組CD19+B細胞比例為(4.27±1.13)%,健康對照組為(0.61± 0.31)%(圖1B),差異亦有統(tǒng)計學意義(U=13.00,P=0.000 2)。
(二)患者皮損局部CD19+B細胞為Dsg特異性B細胞:15例天皰瘡患者皮損局部CD19+B淋巴細胞中,表達IgG的細胞比例為(38.33±5.56)%,3例天皰瘡患者皮損局部CD19+B淋巴細胞中表面特異性識別Dsg1與Dsg3的細胞比例分別為(12.87 ± 1.267)%、(10.42 ± 1.243)%。
(三)尋常型天皰瘡患者皮損局部單個核細胞體外培養(yǎng)后產(chǎn)生抗Dsg1及抗Dsg3特異性抗體:將20例尋常型天皰瘡患者皮損與10例健康對照皮膚局部單個核細胞分別體外培養(yǎng)6 d后,患者組培養(yǎng)上清液中抗Dsg1與Dsg3抗體滴度分別為(4.89 ± 1.56)、(35.45 ± 13.03)U/ml,健康對照組分別為(-0.36 ± 0.25)U/ml、(-0.29 ± 0.29)U/ml,兩組間差異有統(tǒng)計學意義(U值為13.0、5.0,P<0.05)。培養(yǎng)上清液中抗Dsg1和Dsg3抗體的曲線下面積分別為0.938與0.975(圖2),滴度臨界值分別為0.64和0.92?;颊咂p單個核細胞培養(yǎng)上清液抗Dsg1和Dsg3抗體分別有17例(85%)、19例(95%)為陽性。
我們在臨床上觀察到,一些復發(fā)天皰瘡患者的皮損通常發(fā)生在與初發(fā)皮疹完全相同的部位,對復發(fā)患者不增加系統(tǒng)糖皮質(zhì)激素用量,僅加強外用治療,皮疹就能得到控制;而部分落葉型或紅斑型天皰瘡患者,僅外用糖皮質(zhì)激素治療,皮疹也可好轉(zhuǎn)。這引起了我們對天皰瘡患者皮損局部免疫環(huán)境研究的興趣。
過去的研究認為,B淋巴細胞通常不在皮膚聚集[7]。但在炎癥性皮膚病的動物模型及人類臨床研究中發(fā)現(xiàn),B細胞可發(fā)揮促炎及抗炎作用[8]。目前已在皮膚利什曼?。?]、彌漫性皮膚硬化[10]和特應性皮炎[11]等皮損真皮部位發(fā)現(xiàn)有B細胞浸潤,B細胞與皮膚固有免疫細胞及T細胞相互作用共同參與皮膚炎癥發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn),B細胞浸潤于天皰瘡患者皮損局部,這可能是因為皮損部位基質(zhì)細胞或T淋巴細胞表達趨化因子(CXCL13、CCL19等)與B細胞表面的趨化因子受體(CXCR5或CCR7)結(jié)合,趨化B細胞至患者皮損部位[12?14]。
圖1 尋常型天皰瘡患者皮損處與健康對照皮膚單個核細胞中淋巴細胞與CD19+B細胞的比例 1A:淋巴細胞比例;1B:CD19+B細胞比例
圖2 體外培養(yǎng)局部單個核細胞產(chǎn)生抗橋粒芯糖蛋白1(Dsg1)、Dsg3抗體的受試者工作特征曲線 曲線下面積分別為0.938、0.975
皮膚局部的免疫過程可能受到機體整體免疫的影響,而Geherin等[15]在綿羊肉芽腫模型中發(fā)現(xiàn),皮膚中聚集的B細胞表型不同于淋巴結(jié)中的B細胞,其表面MHCⅡ、CD1和CD80/86表達增加,有利于T細胞活化,同時皮損局部B細胞和抗體產(chǎn)生細胞的聚集增加了局部抗體的濃度,進而加重了自身免疫的發(fā)生。我們的研究也發(fā)現(xiàn),尋常型天皰瘡患者皮損局部浸潤的B細胞表面高表達IgG,可與Dsg1與Dsg3特異性結(jié)合,可能是由于局部的T、B細胞容易被活化。Mahanonda等[16]發(fā)現(xiàn),正常齒齦及齒齦炎組織有CD20+/27+記憶性B細胞浸潤,表面表達IgG和IgA,在體外用Toll樣受體7/8(R848)及白細胞介素2刺激后可分化為分泌IgG和IgA的抗體分泌細胞。本研究中,天皰瘡患者皮損局部浸潤的B細胞,體外培養(yǎng)6 d后產(chǎn)生抗Dsg1和Dsg3抗體,提示浸潤的B細胞可分化成為抗體分泌細胞,可能參與天皰瘡的發(fā)生。
綜上,本研究發(fā)現(xiàn),尋常型天皰瘡患者皮損局部有大量淋巴細胞浸潤,其中包括B淋巴細胞,這些B細胞表面表達IgG,并以記憶性B細胞為主,可與Dsg1、Dsg3特異性結(jié)合,在體外培養(yǎng)后,可產(chǎn)生抗Dsg1與Dsg3特異性抗體,在皮損形成過程中發(fā)揮重要作用。
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