章碧云 秦麗 羅小莉 鐘時(shí)勛

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，耳鼻咽喉科(重慶400016)

梅尼埃?。∕eniere’s disease，MD）是以眩暈、耳鳴、進(jìn)行性波動(dòng)性聽(tīng)力下降和耳脹滿(mǎn)感為表現(xiàn)的常見(jiàn)內(nèi)耳病，其病理基礎(chǔ)為膜迷路積水。內(nèi)淋巴液中高鉀低鈉的環(huán)境由Na+、K+轉(zhuǎn)運(yùn)維持，Na+、K+代謝失衡常導(dǎo)致內(nèi)淋巴水腫，從而導(dǎo)致膜迷路積水。

上皮鈉通道（Epithelial Na+Channel，ENaC）作為高選擇性Na+通道，是Na+吸收的限速步驟，主要分布腎小管、結(jié)腸、分泌腺管道、呼吸道上皮。我們前期研究表明，ENaC在內(nèi)耳中也有表達(dá)[1]，且參與內(nèi)淋巴水腫的形成[2]。近年通過(guò)對(duì)腎臟的研究表明，ENaC表達(dá)受組蛋白H3K79甲基化轉(zhuǎn)移酶Dot1l（Disruptor of telomeric silencing 1-like）的調(diào)控[3]，然而內(nèi)耳是否也通過(guò)表達(dá)Dot1l、調(diào)控ENaC從而調(diào)節(jié)內(nèi)淋巴代謝仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)期望通過(guò)研究Dot1l在內(nèi)耳中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究?jī)?nèi)淋巴代謝、梅尼埃病發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑

兔抗鼠Dot1l單克隆抗體（Abcam，ab64077），SABC免疫組化試劑盒（博士德，SA1022），過(guò)氧化物酶阻斷劑（博士德，AR1108），DAB顯色液（博士德，AR1022）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇和取材

選取耳廓反射靈敏、聽(tīng)性腦干反應(yīng)（ABR）檢測(cè)聽(tīng)閾不超過(guò)30dB SPL的健康紅目豚鼠6只，體重200-300g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,。豚鼠按40mg/kg 1%戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉，予以生理鹽水心臟灌注至口唇蒼白后換為4%多聚甲醛繼續(xù)灌注，待頸僵直后迅速斷頭、游離顳骨取出耳蝸，同時(shí)取出腎組織。將耳蝸浸于4%多聚甲醛中，在手術(shù)顯微鏡下以精細(xì)鑷戳破圓窗膜，蝸?lái)斻@小孔后由蝸?lái)斁徛等胍后w，至圓窗流出液清亮后置入新的4%多聚甲醛液中固定48小時(shí)，10%乙二胺四乙酸（EDTA）中脫鈣1月，期間隔天更換脫鈣液。將已脫鈣的耳蝸于各梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，以4um的厚度沿蝸軸切片。

1.3 SABC法免疫組化

65℃烤箱烤片2小時(shí)，二甲苯脫蠟2小時(shí)，梯度酒精（100%、95%、80%、75%）至水各1次，每次5分鐘，流水沖洗15分鐘。切片以?xún)?nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑室溫孵育20分鐘，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，每次5分鐘，0.12%胰酶37℃孵育30分鐘，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，每次5分鐘，BSA 37℃孵育20分鐘，甩去血清，加入滴度為1:100的兔抗小鼠Dot1l抗體，4℃過(guò)夜后37℃復(fù)溫1小時(shí)，PBS洗3次，每次5分鐘，SABC室溫孵育20分鐘，PBS洗3次，每次5分鐘，山羊抗兔二抗37℃30分鐘，PBS洗3次，每次5分鐘。DAB顯色后蘇木素復(fù)染90秒，鹽酸分化2秒，飽和碳酸鋰返藍(lán)2分鐘，脫水，封片。腎臟做陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替Dot1l抗體做空白對(duì)照。鏡下組織出現(xiàn)黃色或棕色顆粒為陽(yáng)性。采用Image-Pro Plus 6.0計(jì)算三轉(zhuǎn)免疫組化陽(yáng)性各部位平均光密度值（OD值）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以SPSS 20.0軟件處理，資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。三轉(zhuǎn)間的光密度（optical density，OD）值比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為有差異，Graphpad Prism 6.0作圖。

2 結(jié)果

2.1 ABR豚鼠聽(tīng)閾19.58±4.50dB SPL，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要求。

2.2 免疫組化

以Dot1l在腎臟的表達(dá)作為陽(yáng)性對(duì)照,Dot1l主要表達(dá)于腎小管細(xì)胞質(zhì)（圖1）。以生理鹽水代替Dot1l一抗作為實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照，見(jiàn)耳蝸各部位無(wú)顯色（圖2）。Dot1l在豚鼠耳蝸中廣泛表達(dá)于血管紋（stria vascularis，StV）、螺旋韌帶（spiral ligament,SPL）、前庭膜（Reissner’s membrane,RM）、Corti器（organ of Corti，OC）、螺旋緣（spiral limbus，SLM）（圖3、圖4），螺旋神經(jīng)節(jié)（spiral ganglion，SG）（圖5）、外螺旋溝根細(xì)胞（Root Cell，RC）（圖6）。Dot1l在螺旋神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)由底轉(zhuǎn)向頂轉(zhuǎn)逐漸增強(qiáng)（圖5、圖7），OD值分別為0.100±0.019、0.121±0.008、0.149±0.0060，F(xiàn)=6.22，P=0.0201；在螺旋韌帶中的表達(dá)由底轉(zhuǎn)向中轉(zhuǎn)、頂轉(zhuǎn)逐漸減少（圖4、圖7），OD值分別為0.151±0.006、0.121±0.006、0.106±0.023，F(xiàn)=8.29,P=0.0091。Dot1l在各轉(zhuǎn)血管紋、前庭膜、Corti器、螺旋緣中的表達(dá)無(wú)顯著差異。因部分標(biāo)本切片時(shí)根細(xì)胞處破損，三轉(zhuǎn)根細(xì)胞未能做灰度值統(tǒng)計(jì)分析。

圖1 Dot1l在豚鼠腎臟遠(yuǎn)端集合小管的表達(dá)。Fig.1 Dot1l expresses in renal collecting duct cells as positive control.圖2 以生理鹽水代替Dot1l抗體作為陰性對(duì)照，免疫組化無(wú)陽(yáng)性顯色。Fig.2 No positive area was detected when anti-Dot1l was replaced by saline.圖3 Dot1l在豚鼠耳蝸各轉(zhuǎn)螺旋器、螺旋神經(jīng)節(jié)中均有表達(dá)。Fig.3 Dot1l was found in in spiral organ and spiral ganglion in allturns.圖4 Dot1l表達(dá)于血管紋（StV）、螺旋韌帶（SPL）、前庭膜（RM）、Corti器（OC）、螺旋緣（SLM），在螺旋韌帶中由底轉(zhuǎn)（4a）向中轉(zhuǎn)（4b）、頂轉(zhuǎn)（4c）表達(dá)逐漸降低、分布逐漸集中于近血管紋側(cè)。Fig.4 Dot1l exists in the stria vascularis（StV）,Reissner’s membrane（RM）,spiral ligament（SPL）,organ of Corti（OC）,spiral limbus（SLM）and spiral ganglion.From basal turn to apical turn,Dot1l expression in spiral ligament decreased.圖5 Dot1l在螺旋神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)由底轉(zhuǎn)（5a）向中轉(zhuǎn)（5b）、頂轉(zhuǎn)（5c）增強(qiáng)。Fig.5 Dot1l expression in spiral ganglion increased from basal turn to apical turn.圖6 Dot1l在根細(xì)胞（RC）處呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。Fig.6 Dot1l has a strong expression root cell(RC).

3 討論

Na+、K+離子代謝紊亂是導(dǎo)致膜迷路積水的基礎(chǔ)。1997年Dunnebier首次通過(guò)手術(shù)破壞單側(cè)內(nèi)淋巴囊或內(nèi)淋巴管后全身應(yīng)用醛固酮，未手術(shù)側(cè)仍出現(xiàn)膜迷路積水[4]，隨后蔣子棟[5,6]通過(guò)單純腹腔注射醛固酮也成功誘導(dǎo)出膜迷路積水，推測(cè)醛固酮可能通過(guò)調(diào)節(jié)水鈉平衡引起膜迷路積水。Zhang等通過(guò)對(duì)腎臟的研究表明，醛固酮抑制Dot1l的可變剪切體Dot1a與Af9的作用[7,8]解除Dot1a-Af9對(duì)α-ENaC啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3K79的甲基化，增強(qiáng)α-ENaC表達(dá)，從而調(diào)節(jié)水鈉代謝[3]。我們前期研究證實(shí)ENaC在豚鼠耳蝸中表達(dá)于血管紋、螺旋韌帶、前庭膜、螺旋神經(jīng)節(jié)、Corti器、螺旋緣等部位[1]，且ENaC也參與內(nèi)淋巴積水的形成[2]，醛固酮作用后AF9蛋白在豚鼠耳蝸中表達(dá)減弱[9]本次研究表明Dot1l表達(dá)于豚鼠耳蝸的血管紋、螺旋韌帶、前庭膜、螺旋神經(jīng)節(jié)、Corti器、螺旋緣等ENaC表達(dá)的部位，因此我們推測(cè)可能與腎臟類(lèi)似，ENaC在豚鼠耳蝸中對(duì)內(nèi)淋巴循環(huán)的調(diào)控也與Dot1l-Af9的表達(dá)有關(guān)。

Ten Cate WJ等認(rèn)為，Na+,K+-ATP酶在血管紋的活性由底轉(zhuǎn)向頂轉(zhuǎn)增加[10]，蔣子棟等認(rèn)為其可能與醛固酮引起膜迷路積水的發(fā)生機(jī)制有關(guān)[4]。離子通道的轉(zhuǎn)運(yùn)能力除與活性相關(guān)以外，還與表達(dá)量和分布有關(guān)，我們研究發(fā)現(xiàn)，Dot1l在螺旋韌帶中的表達(dá)由底轉(zhuǎn)（圖4c）向中轉(zhuǎn)（圖4b）、頂轉(zhuǎn)（圖4a）逐漸降低，且表達(dá)逐漸集中于靠近血管紋側(cè)。由于醛固酮可通過(guò)抑制Dot1l來(lái)增強(qiáng)ENaC的表達(dá)[6，7]，因此我們推測(cè)Dot1l在各轉(zhuǎn)螺旋韌帶中的表達(dá)差異可能導(dǎo)致ENaC的表達(dá)或活性由底轉(zhuǎn)向頂轉(zhuǎn)逐漸增強(qiáng)，從而使各轉(zhuǎn)的內(nèi)淋巴代謝能力不同，但還需要進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。

梅尼埃病患者有逐漸加重的波動(dòng)性聽(tīng)力下降，耳蝸電圖多有異常，既往觀點(diǎn)認(rèn)為其聽(tīng)力下降是內(nèi)淋巴液生化代謝紊亂使毛細(xì)胞、傳入神經(jīng)纖維、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生退行性變導(dǎo)致，但無(wú)法解釋聽(tīng)力損失呈早期低頻型、晚期平坦型的頻率特點(diǎn)。Zhang W[7]等證實(shí)醛固酮可下調(diào)Dot1l表達(dá)，劉抗寒等通過(guò)對(duì)腎臟的研究表明下調(diào)Dot1l-AF9表達(dá)可增加 ET-1 的表達(dá)[12，13]。ET-1可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放，增加Ca2+受體的敏感性，造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載從而損傷細(xì)胞，在感音神經(jīng)性耳聾的發(fā)生上有一定作用[11][14,15]。我們推測(cè)：醛固酮作用后螺旋神經(jīng)節(jié)Dot1l表達(dá)減弱、ET-1表達(dá)增強(qiáng)，引起血管收縮、鈣超載等損傷螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，從而影響聽(tīng)力。Dot1l在頂轉(zhuǎn)螺旋神經(jīng)節(jié)（圖5c）中的表達(dá)強(qiáng)于中轉(zhuǎn)（圖5b）、底轉(zhuǎn)（圖5a），因此我們進(jìn)一步推測(cè)：醛固酮在頂轉(zhuǎn)螺旋神經(jīng)節(jié)下調(diào)Dot1l表達(dá)的作用可能比在中轉(zhuǎn)、底轉(zhuǎn)更明顯，使得頂轉(zhuǎn)的ET-1表達(dá)增加進(jìn)而損傷螺旋神經(jīng)節(jié)的效應(yīng)作用更強(qiáng)，因而低頻聽(tīng)力更易受到損害。然而梅尼埃病患者及膜迷路積水動(dòng)物模型內(nèi)耳中是否確有ET-1表達(dá)的增加，仍待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究顯示，Dot1l在外螺旋溝的根細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（圖6）。根細(xì)胞是位于Claudius細(xì)胞深層的根狀細(xì)胞，是外螺旋溝從內(nèi)淋巴液中重吸收Na+、分泌K+、維持內(nèi)淋巴液低鈉高鉀的重要部位16-18]Dot1l在根細(xì)胞的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)可能對(duì)維持根細(xì)胞的正常內(nèi)淋巴液代謝有重要作用。根細(xì)胞在耳蝸各轉(zhuǎn)的形態(tài)、數(shù)量有差異[16]，這也可能導(dǎo)致各轉(zhuǎn)耳蝸的離子代謝能力不同。

圖7 Dot1l在耳蝸各部位的表達(dá)相對(duì)定量分析。在螺旋韌帶中，Dot1l由底轉(zhuǎn)向頂轉(zhuǎn)減弱(F=8.29,P=0.0091)，在螺旋神經(jīng)節(jié)中由底轉(zhuǎn)向底轉(zhuǎn)增強(qiáng)(F=6.22，P=0.0201)。*P＜0.05。**P＜0.01。Fig.7 The relative analysis of Dot1l expression in each position.From basal turn to apical turn,Dot1l expression in spiral ligament decreased(F=8.29,P=0.0091),while that in spiral ganglion increased(F=6.22，P=0.0201).*P＜0.05.**P＜0.01.

本實(shí)驗(yàn)首次研究了Dot1l在豚鼠耳蝸中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Dot1l表達(dá)于豚鼠耳蝸中Na+代謝的關(guān)鍵部位，結(jié)合我們前期對(duì)Af9的研究[8]，我們推測(cè)Dot1l-Af9可能參與維持內(nèi)淋巴循環(huán)。

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