宋青玲曲騰飛張偉于樹(shù)夔何志洲,2龔樹(shù)生

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100050）2 Creighton大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究所（美國(guó) 奧馬哈NE68178）

遺傳性耳聾目前是導(dǎo)致新生兒出生缺陷的主要疾病之一，目前已有大約1/3的遺傳性耳聾致病基因得到驗(yàn)證，但仍有大約300個(gè)疑似致病基因有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)[1]。我們?cè)谇捌诘难芯抗ぷ髦?，通過(guò)Microarray基因芯片技術(shù)分別對(duì)小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞與外毛細(xì)胞中可能發(fā)揮重要作用的基因的RNA水平進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)：c-Maf蛋白為表達(dá)于耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞中的、在二者轉(zhuǎn)錄水平均有較高表達(dá)（表達(dá)量均為8.0左右）的轉(zhuǎn)錄因子。據(jù)此我們推測(cè)：c-Maf基因的突變有可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的遺傳性耳聾[2]。

c-Maf蛋白是Maf轉(zhuǎn)錄因子家族大Maf家族成員之一，其基因片段位于人類第16號(hào)染色體長(zhǎng)臂23.2位點(diǎn)（16q23.2），共包含27個(gè)外顯子。c-Maf蛋白的結(jié)構(gòu)域從N端到C端分別為：酸性轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，組氨酸/甘氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域，擴(kuò)展同源區(qū)以及堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域[3,4]。c-Maf及其家族成員最具特征性的結(jié)構(gòu)為位于C端的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，其在進(jìn)化上高度保守，能夠單獨(dú)作用或與細(xì)胞核內(nèi)其他含有b-Zip結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合形成同源二聚體，與DNA上的Maf識(shí)別元件以及富含5-AT的Maf半識(shí)別元件的結(jié)合，從而調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能與生長(zhǎng)發(fā)育[5]。

目前研究顯示，c-Maf蛋白在生物體生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中對(duì)細(xì)胞分化與組織器官的形態(tài)形成均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，其在肝臟[6]、腎臟[6]、眼晶狀體[7]、T細(xì)胞[8]和感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)[9,10]中廣泛表達(dá)且均起到了調(diào)控發(fā)育與功能維持的關(guān)鍵作用，但是其在聽(tīng)神經(jīng)科學(xué)中的表達(dá)與功能的研究尚屬于空白。在外周感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)中，c-Maf是一個(gè)關(guān)鍵的、能夠?qū)ｉT調(diào)控皮膚機(jī)械感受器（特別是高頻感受器）的發(fā)育和功能的轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)，結(jié)合c-Maf在內(nèi)外毛細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的高表達(dá)水平，我們推測(cè)，c-Maf可能在毛細(xì)胞機(jī)械感受的過(guò)程中同樣也會(huì)發(fā)揮重要的作用。因此，我們擬針對(duì)c-Maf基因在耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞的表達(dá)部位以及時(shí)間相關(guān)性進(jìn)行更加深入的研究。

本研究中，我們首先分析了Microarray基因芯片的檢測(cè)數(shù)據(jù)，對(duì)內(nèi)、外毛細(xì)胞中c-Maf基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析、比較；隨后，通過(guò)c-Maf蛋白免疫熒光染色、全耳蝸標(biāo)記、鋪片，我們確定了c-Maf基因在耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞的表達(dá)部位，并通過(guò)對(duì)毛細(xì)胞特定區(qū)域的熒光強(qiáng)度分析，對(duì)成年小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞中c-Maf在不同部位的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行初步分析。另外，我們對(duì)其在各發(fā)育時(shí)期（P0，P7，P12）的表達(dá)與定位進(jìn)行了染色分析，觀察c-Maf蛋白表達(dá)與耳蝸發(fā)育時(shí)間的相關(guān)性，為進(jìn)一步深入研究其在耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)6周齡成年C57BL/6J小鼠3只，P0,P7,P12乳鼠各2只（維通利華，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)：生產(chǎn)許可SCXK（京）2016-0006）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

兔源c-Maf抗體（美國(guó)proteintech公司，55013-1-AP）；Alexa Fluorence羊抗鼠抗體（美國(guó)Life公司，A-11034）；免洗 DAPI（4',6-Diamidino-2-phenylindole,4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染液（中杉金橋，ZLI-9557）。

1.2 方法

1.2.1 耳蝸基底膜制備

小鼠深度麻醉后頸椎離斷，用剪刀斷頭后取出雙側(cè)顳骨，解剖顯微鏡下用鑷子迅速清除多余的軟組織，并用1ml注射器針頭蝸尖打孔，并捅破圓窗和卵圓窗，用10%甲醛蝸尖灌流，并置于4℃固定過(guò)夜12h。放入10%EDTA溶液中脫鈣12h-18h，之后于解剖顯微鏡下從頂回向底回剝除蝸殼，切除螺旋韌帶，并清除前庭膜及蓋膜。取出基底膜放于EP管中待染色。

1.2.2 免疫熒光染色

將分離好的基底膜置于0.3%Triton X-100中30 min后，10%山羊血清封閉1h；換用一抗：兔源性c-Maf抗體（1:50）4℃過(guò)夜，PBS沖洗3次，15min/次；加二抗，37℃孵育1h，PBS沖洗3次，15min/次。DAPI染色：載玻片上滴加一滴免洗DAPI封片液，解剖顯微鏡下鋪片后，將蓋玻片倒扣于載玻片上。1.2.3激光共聚焦顯微鏡成像

激光共聚焦顯微鏡：使用63倍油鏡，顯微鏡型號(hào)（TCS SP5 II;Leica Microsystems,Wetzlar,Germany）。于顯微鏡下選擇目標(biāo)區(qū)域，選擇激發(fā)光波長(zhǎng)分別為358nm和488nm，對(duì)此區(qū)域設(shè)定層掃的距離及層厚，從上到下依次掃描，層厚0.35μm/層，最后對(duì)圖片進(jìn)行疊加，所獲取的最終圖像在軟件Photoshop CS5進(jìn)行后處理。

1.2.4 免疫熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)

使用軟件Image Pro Plus（IPP）測(cè)量熒光強(qiáng)度：①采集圖片：控制需要測(cè)量熒光強(qiáng)度的圖片為同一批標(biāo)本且為在同一條件下制作，共聚焦顯微鏡拍照過(guò)程中采用統(tǒng)一強(qiáng)度的激發(fā)光，按照需求采集圖片。②計(jì)算熒光強(qiáng)度：選定需要計(jì)算熒光強(qiáng)度的圖片，點(diǎn)擊Invert contrast對(duì)圖片進(jìn)行黑白反相處理，應(yīng)用此處理后即可測(cè)量熒光強(qiáng)度。首先，測(cè)量圖片背景強(qiáng)度，設(shè)置背景強(qiáng)度為基礎(chǔ)值，之后選定目標(biāo)區(qū)域，測(cè)量此處熒光強(qiáng)度并與背景強(qiáng)度進(jìn)行對(duì)比，從而計(jì)算出此區(qū)域的熒光強(qiáng)度（IOD值），軟件同時(shí)會(huì)計(jì)算出此區(qū)域的面積（area），依次對(duì)每一幅圖的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行測(cè)量。最后計(jì)算單位面積的熒光強(qiáng)度：?jiǎn)挝幻娣e熒光強(qiáng)度=所選區(qū)域總熒光強(qiáng)度/區(qū)域面積（OD=IOD/area），采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理。

1.2.5 Microarray基因芯片技術(shù)

采用微管吸引技術(shù)在顯微鏡下采集6周齡大小CBA/J小鼠的2000個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞與2000個(gè)外毛細(xì)胞，分別提取其總RNA（約3-5ng），經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后經(jīng)體外擴(kuò)增合成新的RNA后熒光分子標(biāo)記，分別分成3組后與2.0基因芯片（GeneChip Mouse Gene 2.0 ST Arrays）進(jìn)行雜交，待芯片完全干燥后，利用掃描儀進(jìn)行掃描，掃描后將圖像轉(zhuǎn)化為基于熒光強(qiáng)度的數(shù)字信號(hào)。在芯片實(shí)驗(yàn)中，由于影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素較多，無(wú)法將幾個(gè)芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直接比較，故將每組芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，對(duì)兩組樣品的檢測(cè)信號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)信號(hào)進(jìn)行回歸分析并由此得到相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)信號(hào)的基因表達(dá)數(shù)值，結(jié)果均為相對(duì)值（此項(xiàng)工作于美國(guó)Creighton大學(xué)聽(tīng)覺(jué)研究中心完成），最后對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。c-Maf基因的轉(zhuǎn)錄水平為其中的一組數(shù)據(jù)。

1.2.6 SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，主要統(tǒng)計(jì)方法為Student’s t檢驗(yàn)。P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 單獨(dú)采集成年小鼠2000個(gè)耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞與2000個(gè)外毛細(xì)胞，分別提取細(xì)胞內(nèi)的RNA進(jìn)行Microarray基因芯片檢測(cè)(每種分為三組)，其中內(nèi)毛細(xì)胞與外毛細(xì)胞中的c-Maf表達(dá)量相近，均為8左右，表達(dá)水平較高。Fig.1 2000 inner hair cells and 2000 outer hair cells from adult mice cochlear were collected individually,and the RNA of two cells was extracted from each of the two cells.GeneChip microarray was used to detect the expression of total RNAs.The expression of c-Maf in inner hair cells and outer hair cells was close to 8,indicating a high level of expression.

2 結(jié)果

首先，我們根據(jù)Microarray基因芯片技術(shù)對(duì)2000個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞與2000個(gè)外毛細(xì)胞中小鼠各基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA的量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)c-Maf在內(nèi)外毛細(xì)胞中均有較高表達(dá)：內(nèi)毛細(xì)胞中的表達(dá)量為8.12±0.05，外毛細(xì)胞中的表達(dá)量為8.15±5.35，其在內(nèi)外毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平相近，無(wú)明顯差別（P＞0.05）（圖1）。

在此基礎(chǔ)上，我們開(kāi)展了c-Maf蛋白在內(nèi)耳毛細(xì)胞中的表達(dá)的研究，成年C57BL/6J小鼠耳蝸基底膜鋪片可見(jiàn)：c-Maf蛋白信號(hào)分布于成年小鼠耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞胞質(zhì)中（圖2，圖3，圖4），經(jīng)熒光度值計(jì)算后發(fā)現(xiàn)：c-Maf的熒光信號(hào)在內(nèi)毛細(xì)胞的核下區(qū)強(qiáng)于核上區(qū)（圖2）；其在外毛細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度與內(nèi)毛細(xì)胞相差并不大，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3）。

在小鼠出生后各時(shí)間點(diǎn)（P0，P7，P12）的耳蝸基底膜鋪片中可以觀察到：c-Maf蛋白從P0開(kāi)始即表達(dá)耳蝸于內(nèi)外毛細(xì)胞胞質(zhì)中，并在P7、P12持續(xù)表達(dá)，各時(shí)間點(diǎn)中c-Maf蛋白隨著內(nèi)外毛細(xì)胞形態(tài)的生長(zhǎng)變化持續(xù)分布于細(xì)胞質(zhì)中（圖5）。

圖2 c-Maf在內(nèi)毛細(xì)胞的表達(dá)情況，由圖可知：c-Maf表達(dá)于內(nèi)毛細(xì)胞胞質(zhì)，在細(xì)胞核上區(qū)域與核下區(qū)域均有表達(dá)，經(jīng)熒光強(qiáng)度分析可見(jiàn)：核下區(qū)熒光強(qiáng)度強(qiáng)于核上區(qū)（核下區(qū)2.298±0.694，核上區(qū)0.643±0.372），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05。Fig.2 The expression of c-Maf in the inner hair cells:c-Maf was expressed in the cytoplasm of inner hair cells,and it was distributed in both supernuclear region and the subnuclear region.By fluorescence intensity analysis,the fluorescence intensity in the subnuclear region 2.298 ± 0.694 was stronger than that in the supernuclear region 0.643±0.372,which was statistically significant,P＜0.05.

3 討論

感音神經(jīng)性聾是最常見(jiàn)的感覺(jué)障礙，全球大約有3億人受感音神經(jīng)性聾的困擾。感音神經(jīng)性聾的原因很多，內(nèi)耳感覺(jué)細(xì)胞或者神經(jīng)元的損傷最重要的原因，其中包括：環(huán)境因素（感染，耳毒性藥物，以及噪音暴露等）、年齡因素及遺傳因素等。由于成年哺乳動(dòng)物的內(nèi)耳缺乏自我修復(fù)的能力，所以毛細(xì)胞的損傷是永久、不可逆轉(zhuǎn)的[11]。目前，除了獲得性聽(tīng)力損失，已經(jīng)有超過(guò)300個(gè)基因位點(diǎn)可能與聽(tīng)力損失相關(guān)，其中70多個(gè)致病基因已經(jīng)被證明可導(dǎo)致遺傳性聾[1]。此外，約80%的遺傳性耳聾是隱性遺傳，其余為顯性遺傳[1]。遺傳性聾的致病基因研究及基因治療均是目前耳神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[12]。

c-Maf基因在全身各器官?gòu)V泛表達(dá)，并在多種器官的形態(tài)發(fā)育與功能維持中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，為重要的轉(zhuǎn)錄因子。Hagen Wende等在外周神經(jīng)系統(tǒng)研究中發(fā)現(xiàn)，攜帶顯性c-Maf基因突變的人類對(duì)對(duì)高頻震動(dòng)的感受功能存在一定程度的減退，相應(yīng)地，c-Maf基因敲除小鼠的多種皮膚快適應(yīng)感受器的發(fā)育和功能均受損——觸覺(jué)產(chǎn)生過(guò)程中對(duì)壓力刺激的反應(yīng)能力下降、時(shí)限變長(zhǎng)。因此，c-Maf是一個(gè)能夠調(diào)控皮膚觸覺(jué)感受器的發(fā)育和功能的關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。聽(tīng)神經(jīng)系統(tǒng)同樣作為外周神經(jīng)系統(tǒng)的的一部分，聽(tīng)神經(jīng)電信號(hào)的產(chǎn)生依賴于內(nèi)毛細(xì)胞纖毛感受機(jī)械振動(dòng)，并通過(guò)突觸與神經(jīng)向中樞傳遞，從而產(chǎn)生聽(tīng)覺(jué)。毛細(xì)胞的機(jī)械感受功能與皮膚機(jī)械感受功能存在一定的相似性，且c-Maf在耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞中均存在較高的轉(zhuǎn)錄水平，因此，c-Maf基因在耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞中的表達(dá)與功能成為了我們的研究對(duì)象。

圖3 c-Maf在三排外毛細(xì)胞的表達(dá)情況，由圖可知：c-Maf表達(dá)于耳蝸三排外毛細(xì)胞胞質(zhì)，其熒光強(qiáng)度與內(nèi)毛細(xì)胞相近（外毛細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為2.626±0.435，內(nèi)毛細(xì)胞熒光強(qiáng)度為2.162±0.647），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05.Fig.3 The expression of c-Maf in the outer of the hair cells is illustrated:c-Maf is expressed in the cytoplasm of outer hair cells of the cochlea,and its fluorescence intensity（2.626±0.435）is similar to the inner hair cells（2.162±0.647）,with no statistical significance.P＞0.05.

圖4 耳蝸基底膜內(nèi)外毛細(xì)胞側(cè)面掃描圖，c-Maf表達(dá)于內(nèi)毛細(xì)胞與外毛細(xì)胞的胞質(zhì)Fig.4 The lateral map of the inner and outer hair cells of the cochlear basement membrane.c-Maf is expressed in the cytoplasm of the inner hair cells and the outer hair cells.

圖5 c-Maf蛋白在小鼠耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞各個(gè)時(shí)間點(diǎn)（P0，P7，P12）的表達(dá)情況，局部放大的圖片顯示：在P0，P7，P12這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，c-Maf均穩(wěn)定表達(dá)于內(nèi)毛細(xì)胞與外毛細(xì)胞的胞質(zhì)。Fig.5 The expression of c-Maf of different stages(P0，P7，P12)in inner and outer hair cells.c-Maf protein was stably expressed in the inner and outer hair cells of the cochlea 0,7 and 12 days after the birth of the mice.

本研究結(jié)果顯示，c-Maf基因在成年C57BL/6J小鼠耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞中均有較高的轉(zhuǎn)錄，且二者轉(zhuǎn)錄水平相近。c-Maf蛋白在耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)均有較強(qiáng)的表達(dá)，通過(guò)對(duì)內(nèi)毛細(xì)胞與外毛細(xì)胞各區(qū)域免疫熒光強(qiáng)度分析比較，可發(fā)現(xiàn)二者強(qiáng)度相近，此結(jié)果與Microarray基因芯片測(cè)量數(shù)據(jù)一致。另外，通過(guò)單獨(dú)對(duì)內(nèi)毛細(xì)胞不同區(qū)域的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)：將內(nèi)毛細(xì)胞按照細(xì)胞核上區(qū)域與細(xì)胞核下區(qū)域進(jìn)行劃分后，分別統(tǒng)計(jì)兩區(qū)域蛋白信號(hào)的熒光強(qiáng)度，我們發(fā)現(xiàn)核下區(qū)的熒光明顯強(qiáng)于核下區(qū)，表明此蛋白在內(nèi)毛細(xì)胞核下區(qū)較核上區(qū)富集。c-Maf蛋白在內(nèi)毛細(xì)胞的這種分布情況可能與蛋白的功能密切相關(guān)，例如c-Maf的表達(dá)可能與內(nèi)毛細(xì)胞的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)[13]、突觸功能[14-16]、內(nèi)毛細(xì)胞底部離子通道或核下區(qū)的細(xì)胞器等功能的維持與調(diào)節(jié)相關(guān)。但是，在我們研究中，目前僅對(duì)c-Maf在耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞中的表達(dá)較明確，其在螺旋神經(jīng)節(jié)、耳蝸核及聽(tīng)皮層的表達(dá)尚不清楚，需要進(jìn)一步深入的研究，以明確其在整個(gè)聽(tīng)神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)與分布。另外，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)耳蝸各發(fā)育時(shí)間點(diǎn)（P0，P7，P12）的染色鋪片發(fā)現(xiàn)：c-Maf蛋白在C57小鼠在出生時(shí)的內(nèi)、外毛細(xì)胞上即有較明顯的表達(dá)，分布于毛細(xì)胞的胞質(zhì)，隨著小鼠的年齡增大，在耳蝸的發(fā)育中該信號(hào)在內(nèi)、外毛細(xì)胞胞質(zhì)中持續(xù)存在，c-Maf可能對(duì)耳蝸毛細(xì)胞的發(fā)育起調(diào)控作用。Brian等在研究c-Maf蛋白對(duì)小鼠視覺(jué)系統(tǒng)發(fā)育的影響中發(fā)現(xiàn)：c-Maf基因敲除的小鼠胚胎期晶狀體發(fā)育畸形，初級(jí)和次級(jí)視神經(jīng)元細(xì)胞軸突不延長(zhǎng)，此蛋白在視覺(jué)系統(tǒng)的發(fā)育中非常關(guān)鍵[17]。那在聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的發(fā)育中c-Maf是否也發(fā)揮著重要作用呢？由于目前已知的c-Maf全基因片段敲除小鼠的純合子為胚胎致死性，因此，實(shí)驗(yàn)中需要制作條件性c-Maf基因敲除小鼠，或者可以采用將攜帶能夠干擾c-Maf表達(dá)的質(zhì)粒的病毒導(dǎo)入內(nèi)耳[18]，在小鼠的不同發(fā)育階段進(jìn)行基因敲除或病毒干擾，比較小鼠的耳蝸形態(tài)及聽(tīng)覺(jué)功能的變化。

綜上所述，我們首次對(duì)c-Maf基因在小鼠耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞中的表達(dá)、分布特點(diǎn)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)c-Maf蛋白在耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞中均有較高表達(dá)，且在這兩種細(xì)胞中表達(dá)量相近，其在內(nèi)毛細(xì)胞核下區(qū)的分布明顯強(qiáng)于核上區(qū)，此分布情況可能與蛋白的功能相關(guān)。在小鼠耳蝸的發(fā)育過(guò)程中，c-Maf蛋白穩(wěn)定地表達(dá)于內(nèi)、外毛細(xì)胞中，可能在毛細(xì)胞的發(fā)育中起調(diào)控作用。有關(guān)該基因在聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)中所發(fā)揮的的作用有待于進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。

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