李靜靜 ，盧靜芳 ，楊 帆 ，苑宏英 ，張少峰 ，王天賜

（1.天津城建大學(xué)a.環(huán)境與市政工程學(xué)院；b.天津市水質(zhì)科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，天津 300384；2.天津農(nóng)學(xué)院 工程技術(shù)學(xué)院，天津 300384）

再生水是指廢水或雨水經(jīng)適當(dāng)處理后，達(dá)到一定的水質(zhì)指標(biāo)，滿足某種使用要求，可以進行有益使用的水.目前世界上水資源短缺，再生水的合理利用既可以解決水資源短缺問題，又可以減少環(huán)境污染，是國際公認(rèn)的“第二水源”，是解決目前城市缺水問題的有效途徑之一[1].

再生水在輸配過程中，管道的微生物腐蝕問題普遍存在，嚴(yán)重影響再生水水質(zhì)的安全輸送，已成為一個必須正視的現(xiàn)實問題.據(jù)報導(dǎo)，70年代德國漢堡市的廢水系統(tǒng)混凝土管道由于硫氧化細(xì)菌引起的腐蝕而造成的維修費用至少達(dá)到5 000萬馬克，在美國也同樣造成年損失約為1億美元[2].有學(xué)者通過分析混凝土污水管道腐蝕破壞的過程和特征，提出微生物腐蝕作用機理：硫氧化菌能夠利用單質(zhì)硫和還原態(tài)的硫化物，產(chǎn)生生物硫酸，與堿性的水泥材料反應(yīng)，導(dǎo)致水泥水化產(chǎn)物水化硅酸鈣（CSH）分解；并與氫氧化鈣反應(yīng)生成石膏，進而導(dǎo)致鈣礬石的形成，使水泥材料發(fā)生崩解，水泥材料被腐蝕，成分流失影響水質(zhì)的安全輸送[3-4].但是，目前關(guān)于硫氧化菌在再生水中對水泥材料腐蝕問題的研究還不是很完善.本實驗選用典型腐蝕菌那不勒斯硫桿菌為研究對象，研究其生理生化特征及在再生水中的生長情況，同時，探討其對水泥材質(zhì)的腐蝕情況，以期對再生水輸送過程中的水質(zhì)安全及管道防腐工作提供理論依據(jù)與技術(shù)支持.

1 實驗材料與方法

1.1 再生水和水泥材料

實驗采用的再生水取自天津市某再生水廠，水泥材料是參考鑄鐵管壁水泥砂漿內(nèi)襯性能要求的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)《給水管線用球墨鑄鐵管、管件、附件及接頭的要求與試驗方法》和《球墨鑄鐵管和管件水泥砂漿內(nèi)襯》等制作而成的水泥砂漿試片（尺寸：40mm×40 mm×10 mm）.水泥試塊制作用水為實驗室自來水，水泥為42.5號水泥，礦渣粉采用S95級別，河沙粒徑在2 mm以下.水泥試塊經(jīng)抗壓抗折強度測試均符合ISO 16132—2004《球墨鑄鐵管及管件水泥砂漿內(nèi)襯密封層》標(biāo)準(zhǔn)后，將其制作成水泥試片完全浸沒于接種有8%硫氧化菌的再生水中，定時取樣檢測水泥材料的腐蝕情況[5].

1.2 硫氧化菌及其培養(yǎng)基

本實驗選用Halothiobacillus neapolitanus為實驗用菌種，該純菌種符合ATCC標(biāo)準(zhǔn).菌種臨使用時，在無菌條件下用已滅菌的ATCC290液體培養(yǎng)基對粉末狀菌種進行溶解，并進行擴大培養(yǎng).采用培養(yǎng)3代的菌液投加到再生水中進行水泥材料的腐蝕研究.本實驗ATCC290培養(yǎng)基配方見表1.

1.3 硫氧化菌的生理生化特征

1.3.1 硫氧化菌的菌落與形態(tài)觀察

將菌種分離培養(yǎng)后，用接種環(huán)挑取一環(huán)單菌落于載玻片上，將其固定，進行革蘭氏染色.具體步驟為：初染，用結(jié)晶紫染色液滴于涂片上染色1 min，水洗；媒染，用碘液媒染1 min，水洗；脫色，用95%酒精沖洗20～30 s，脫去染液后，水洗；復(fù)染，滴加沙黃于涂片上30s，水洗，用吸水紙吸干或者自然晾干，并用LEICA DFC290 HD型號顯微鏡油鏡（×100）觀察其形態(tài)特征[6].

表1 那不勒斯硫桿菌ATCC290培養(yǎng)基配方

1.3.2 硫氧化菌在培養(yǎng)基中的生長曲線的測定

取相同接種量的菌液接種到新鮮的培養(yǎng)基中，于30℃，170 r/min條件下，在天津市歐諾儀器儀表有限公司制造的HNY-型號的恒溫培養(yǎng)振蕩器中進行培養(yǎng)，并定期在無菌條件下取出菌液.采用PE UV/Vis Lambda35紫外分光光度計在600 nm下測定吸光度值OD600，繪制培養(yǎng)基中硫氧化菌的生長曲線.

1.4 硫氧化菌在再生水中的生長情況

分別接種5%、8%、12%、15%的硫氧化菌菌液到再生水中，在30℃，170 r/min的條件下，于恒溫培養(yǎng)振蕩器中進行培養(yǎng)，步驟同1.3.2.定期用紫外分光光度計測定OD600，用哈希便攜式pH計測定pH值.觀測不同接種量的菌液在再生水中生長的情況.

1.5 再生水中硫氧化菌代謝產(chǎn)物的測定

在再生水系統(tǒng)中，微生物不斷繁殖和生長，會分泌于細(xì)胞外的一些高分子黏性聚合物，為胞外聚合物（EPS）.不同基質(zhì)條件會對其產(chǎn)生不同的影響.它能夠緊密附著在管道內(nèi)壁，EPS的黏性使得它能夠黏附有機物和微生物形成生物膜，生物膜聚集到一定程度會在水力沖刷等因素下脫落，會導(dǎo)致再生水中的多數(shù)懸浮細(xì)菌，進而對管網(wǎng)水質(zhì)產(chǎn)生不利影響，使得管道腐蝕加劇，輸水能力降低等.胞外聚合物中蛋白質(zhì)和多糖含量較高，約占EPS含量的70%～90%，也含有少量的腐殖質(zhì)、核酸、糖醛酸、脂類和氨基酸等物質(zhì)[6].本實驗采用陽離子交換樹脂（CER）對硫氧化菌胞外代謝產(chǎn)物進行提取，具體操作步驟：以12.5 g CER/g生物膜投加量將CER加入到生物膜樣品中；在4℃搖床中，200 r/min攪拌2 h，取出混合物放置在Centrifuge 5430R型號的高速冷凍離心機里；首先在20 000轉(zhuǎn)，4℃條件下離心20 min，然后在10 000轉(zhuǎn)，4℃條件下離心15 min；上清液用0.22 μm濾膜過濾，過濾后液體于4℃保存待測.用Folin-酚法和蒽酮法在PE UV/Vis Lambda35紫外分光光度計上對蛋白質(zhì)和多糖的含量進行測定[7].

1.6 水泥砂漿試片的腐蝕程度測定

硫氧化菌及其代謝產(chǎn)物，如硫酸與水泥中某些成分發(fā)生反應(yīng)會生成膨脹性物質(zhì)鈣礬石和石膏，破壞了水泥材料的結(jié)構(gòu)，并產(chǎn)生裂縫進一步加劇腐蝕作用.水泥中的成分會隨著水流作用流失到再生水中，導(dǎo)致水泥片失重[8-9].本實驗將水泥砂漿試片浸沒在硫氧化菌接種量為8%的再生水中，運行一段時間后，從系統(tǒng)中取出水泥砂漿試片，先用去離子水將其表面沖洗干凈，再用無水乙醇浸泡1 d，去除試片表面可能具有的微生物.然后用干燥清潔的濾紙包裹水泥試片于干燥箱中（25℃）干燥至恒重，最后用天平稱重，并與原始水泥試片（測定步驟同上）數(shù)據(jù)進行對比，通過測定水泥片的失重量和失重率，以表征水泥材料受腐蝕情況.

2 結(jié)果與討論

2.1 硫氧化菌的形態(tài)觀察

硫氧化菌菌落形態(tài)為不透明的乳白色圓形菌落，邊緣整齊，中間稍有隆起，表面光滑有光澤，約0.5～1 mm大小.革蘭氏染色結(jié)果為革蘭氏陰性菌，油鏡觀察該硫氧化菌為短桿狀，大小約為0.5～1 μm.菌落及顯微鏡觀察形態(tài)如圖1所示.

圖1 硫氧化菌菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果

2.2 硫氧化菌在培養(yǎng)基中的生長曲線

硫氧化菌接種至培養(yǎng)基中之后，首先有一段時間的適應(yīng)期，實驗結(jié)果顯示：適應(yīng)期約為0～12 h；12～14 h開始進入對數(shù)期，約為14～40 h，此階段細(xì)菌大量生長；40 h之后進入了穩(wěn)定期，穩(wěn)定期細(xì)菌保持一定的濃度，變化緩慢；72 h后緩慢進入衰亡期，細(xì)菌數(shù)量開始下降，如圖2所示.

圖2 硫氧化菌在ATCC290培養(yǎng)基中的生長曲線

2.3 不同接種量的硫氧化菌在再生水中的生長情況

那不勒斯硫桿菌以不同的接種量接種到再生水中的生長情況如圖3所示.圖中可知該硫氧化菌生長為四個時期，適應(yīng)期，對數(shù)期，穩(wěn)定期和衰亡期.硫氧化菌接種量為5%和8%時總體比12%和15%的細(xì)菌濃度大，適應(yīng)期為0～14 h，比12%和15%的0～24 h要短.分析原因可能為再生水中的可供該硫氧化菌生長的營養(yǎng)物質(zhì)有限，接種量大時，菌種之間存在競爭關(guān)系，表現(xiàn)為硫氧化菌濃度反而比小接種量的濃度要小.接種量為8%時，硫氧化菌總體生長情況最佳，細(xì)菌濃度達(dá)到最大，OD600為0.04.考慮到硫氧化菌的生長情況，最適宜的接種量為8%.

圖3 不同接種量的硫氧化菌的生長曲線

硫氧化菌在再生水中的生長過程中，再生水pH值的檢測結(jié)果為隨著時間的延長呈下降趨勢，并逐漸趨于平緩，如圖4所示.硫氧化菌接種量為8%時再生水的pH值較接種量為5%的低，且pH降低的速率更大，在158 h達(dá)到最低值6.95.這說明其產(chǎn)酸能力更強，硫氧化菌把再生水中硫單質(zhì)及硫還原態(tài)物等物質(zhì)氧化，而產(chǎn)生生物硫酸，使得pH值降低.硫氧化菌接種量為5%時，生長到158 h再生水pH值降低到最低值7.67，總體降低趨勢較為平緩，推測原因為后期硫氧化菌處于衰亡期，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸缺乏，且大量細(xì)胞死亡破裂導(dǎo)致[10].

圖4 不同硫氧化菌接種量的再生水pH變化

2.4 硫氧化菌在再生水中的胞外代謝產(chǎn)物

本實驗采用陽離子交換樹脂對EPS進行提取，其中蛋白質(zhì)和多糖含量較高.結(jié)果顯示：硫氧化菌為接種量8%時的蛋白質(zhì)和多糖的含量均高于5%，其蛋白質(zhì)含量為653 mg/L，多糖的含量為6.89 mg/L；硫氧化菌接種8%到再生水中生長產(chǎn)生的胞外代謝產(chǎn)物量更大，推斷其對再生水水質(zhì)及水泥材料的影響更大，如圖5所示.從圖中可知DNA相對于蛋白質(zhì)和多糖含量均比較小，不同接種量的DNA值分別為0.07 mg/L和0.06 mg/L，說明采用陽離子交換樹脂提取胞外聚合物時細(xì)菌細(xì)胞的破裂程度較低.

圖5 提取的代謝產(chǎn)物中蛋白質(zhì)、多糖和DNA含量

2.5 硫氧化菌對水泥砂漿試片的腐蝕

水泥砂漿試片的失重量和失重率均隨著時間先增大后減小（見圖6），失重量最大值達(dá)到0.23，失重率為0.01.實驗進行前兩個月，水泥材料失重量和失重率增大.分析原因為水泥材料遭到腐蝕，再生水中的化學(xué)物質(zhì)、那不勒斯硫桿菌的生理生化活動及產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物等使水泥材料發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生鈣礬石等物質(zhì)，破壞了水泥結(jié)構(gòu)，進而產(chǎn)生一些裂縫，使得水泥里面的成分流失等導(dǎo)致.實驗后期，水泥材料失重量和失重率減?。ㄒ妶D6），水泥砂漿試片表面堆積有大量的生物膜（見圖7）.分析原因為水泥材料發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成一層化學(xué)物質(zhì)，以及表面附著一層生物膜，阻止再生水中其他成分進入水泥試片內(nèi)部，使得水泥砂漿試片的腐蝕速率有所減緩.

圖6 水泥材料的失重率和失重量

圖7 3月后的水泥砂漿試片形貌

3 結(jié)論

（1）硫氧化菌在再生水中接種量為8%時，生長狀況最佳，將再生水pH值降低至酸性，對堿性的水泥材料影響很大.

（2）比較不同硫氧化菌接種量，8%時產(chǎn)生的胞外代謝產(chǎn)物含量最高，其中蛋白質(zhì)含量達(dá)到653 mg/L，多糖的含量為6.89 mg/L.

（3）水泥材料在接種有8%硫氧化菌的再生水中受到了腐蝕，水泥砂漿試片失重，水泥材料受腐蝕程度先增大后減小.

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