劉凱　卓鴻武　劉建忠

[摘要] 目的 分析TNF-α對(duì)成骨細(xì)胞程序性壞死的影響并分析其機(jī)制。 方法 分離并常規(guī)培養(yǎng)小鼠乳鼠成骨細(xì)胞，采用TNF-α干預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死，Nec-1干預(yù)抑制細(xì)胞壞死。并采用正常培養(yǎng)的成骨細(xì)胞為正常對(duì)照組。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；Tunel和Caspase 3雙染法檢測(cè)細(xì)胞的程序性壞死情況；Western blot檢測(cè)細(xì)胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，TNF-α組增殖活性降低，程序性壞死數(shù)量增加（P < 0.05）；與TNF-α組比較，TNF-α+Nec-1組增殖活性顯著增加，程序性壞死數(shù)量降低（P < 0.05）；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，各組之間的差異更加顯著（P < 0.05）。與正常對(duì)照組比較，TNF-α組RIP3、MLKL蛋白表達(dá)降低（P < 0.05）；TNF-α+Nec-1組RIP3、MLKL蛋白表達(dá)高于TNF-α組（P < 0.05）。 結(jié)論 TNF-α能夠抑制成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，這可能是通過(guò)降低成骨細(xì)胞的RIP3、MLKL蛋白表達(dá)來(lái)完成的。

[關(guān)鍵詞] 腫瘤壞死因子α；成骨細(xì)胞；程序性壞死

[中圖分類(lèi)號(hào)] R684 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）03（c）-0018-05

[Abstract] Objective To explore the effect and its related mechanism of TNF-α on programmed necrosis of osteoblasts. Methods Mice osteoblasts were isolated and cultured from suckling mice， and TNF-α was used to induce programmednecrosis of osteoblasts， Nec-1 was used to inhibit cell necrosis. Normal cultured osteoblasts were used as normal control group， and MTT assay was used to detect the cell proliferation. Tunel and Caspase 3 double staining was used to detect the programmed necrosis of osteoblasts. The expression of RIP1， RIP3 and MLKL were detected by Western blot. Results Compared with the normal control group， the proliferation activity of TNF-α group was decreased and the number of programmed necrosis was increased （P < 0.05）. After the Nec-1 treatment， the proliferative activity was significantly increased compared with TNF-α group， and the number of programmed necrosis was decreased （P < 0.05）. As time went on， the differences between the groups became more pronounced （P < 0.05）. Compared with the normal control group， expression of RIP3 and MLKL protein in TNF-α group was significantly lower than that in normal control （P < 0.05）. After the Nec-1 treatment， the expression of RIP3 and MLKL protein had significantly differences compared with TNF-α group （P < 0.05）. Conclusion TNF-α can inhibit osteoblast proliferation and promote programmed necrosis of osteoblasts， which may be accomplished by reducing the expression of RIP3 and MLKL proteins in osteoblasts.

[Key words] TNF-α； Osteoblasts； Programmed necrosis

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性骨代謝性疾病，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是以雌激素缺乏誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成為特征的疾病，是一種炎癥過(guò)程[1-2]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松產(chǎn)生的原因與雌激素水平下降，炎性因子表達(dá)升高有關(guān)，他們的變化可促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖分化及細(xì)胞融合，也可抑制破骨細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致骨吸收增加，最終導(dǎo)致成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞偶聯(lián)失衡，誘發(fā)骨質(zhì)疏松[3]。腫瘤壞死因子α（TNF-α）能與細(xì)胞膜上腫瘤壞死因子受體（TNFR1）結(jié)合，激活多條信號(hào)通路，從而引起細(xì)胞炎性反應(yīng)或者細(xì)胞死亡[4]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）作為T(mén)NF-α直接激活的下游轉(zhuǎn)錄因子，在TNF信號(hào)通路中起著不可或缺的作用。細(xì)胞程序性壞死是一類(lèi)因病理而產(chǎn)生的被動(dòng)死亡，發(fā)生程序性壞死的細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞膜通透性增高，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞器變形或腫大，最后細(xì)胞破裂，因此被認(rèn)為是無(wú)序的過(guò)程，無(wú)從進(jìn)行調(diào)控[5]。研究指出，程序性細(xì)胞壞死的發(fā)生發(fā)展與TNFR家族有關(guān)[6-7]。本研究選取成骨細(xì)胞，采用TNF-α進(jìn)行干預(yù)，分析TNF-α對(duì)成骨細(xì)胞程序性壞死的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

MTT（美國(guó)Sigma公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；Tunel試劑盒（江蘇碧云天生物有限公司），兔抗鼠受體相互作用蛋白1（RIP1）、RIP3、混合譜系激酶結(jié)構(gòu)區(qū)域樣蛋白（MLKL）多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），Caspase 3多克隆抗體（proteintech有限公司），兔抗鼠β-actin單克隆抗體（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 主要設(shè)備

培養(yǎng)箱（Thermo公司），二氧化碳孵箱（SANYO公司），倒置顯微鏡（Nikon公司），臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（Beckman公司），-80℃冰箱（SANYO公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生2～3 d的清潔級(jí)SD小鼠乳鼠30只，購(gòu)自上海斯萊克公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)（1131800667）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定 成骨細(xì)胞采用胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶消化方法的從乳鼠顱骨中提取。將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，然后調(diào)整濃度到2×105個(gè)/mL濃度。吹打均勻后，接種到培養(yǎng)瓶中，置于37℃，含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。48 h換液，棄去懸浮的死細(xì)胞，每隔2 d換液。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)，骨鈣化結(jié)節(jié)染色和堿性磷酸酶細(xì)胞化學(xué)染色三方面對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含有10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將培養(yǎng)的細(xì)胞用0.25%的胰酶消化，以105個(gè)/L接種于24孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合狀態(tài)時(shí)，用不含血清的培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h。待原代細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入0.25%胰酶溶液3～5 min至細(xì)胞收縮變圓，加入適量培養(yǎng)液并用彎吸管吹打細(xì)胞，使之脫落并分散成單細(xì)胞懸液。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)處理及分組 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3代成骨細(xì)胞以1×104個(gè)/mL均勻接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。TNF-α溶于滅菌的PBS溶液中，配制成TNF-α存儲(chǔ)液，混勻分裝，-80℃保存。正常對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，TNF-α組細(xì)胞給予10 μmol/L的TNF-α干預(yù)，培養(yǎng)4～6 h后換液，48 h后處理細(xì)胞。TNF-α+Nec-1組細(xì)胞除采用TNF-α進(jìn)行干預(yù)外，給予程序性壞死和凋亡抑制劑Nec-1干預(yù)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4.3 MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞的增殖活性變化 收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的成骨細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度，以8×104個(gè)/孔種植于細(xì)胞培養(yǎng)板上，設(shè)定溫度37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12、24、48 h后檢測(cè)細(xì)胞活性。加入MTT溶液20 μL（5 mg/mL），孵育4 h，終止培養(yǎng)，每孔加150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm處測(cè)量各孔的吸光度（A值）。以A為縱坐標(biāo)，以時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4.4 Caspase3和Tunel雙染法檢測(cè)組成骨細(xì)胞的程序性壞死情況 成骨細(xì)胞鋪板，給予相應(yīng)的藥物治療后，PBS洗3遍，然后采用福爾馬林固定10 min，之后采用山羊血清封閉20 min后，孵育Caspase 3一抗（1∶100）4℃過(guò)夜，第2天恢復(fù)到室溫后，再放置30 min，PBS沖洗后，孵育FITC標(biāo)記的綠色熒光二抗，洗滌后進(jìn)行常規(guī)Tunel染色，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用3%過(guò)氧化氫甲醇中浸洗10 min，用0.2% Triton孵育5 min后，用PBS洗2次，切片組織上每塊組織滴加50 μL的Tunel反應(yīng)液，37℃避光孵育1 h，PBS洗3次后，在熒光顯微鏡下拍照。Caspase 3陰性Tunel陽(yáng)性的細(xì)胞為壞死細(xì)胞。隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算壞死細(xì)胞百分比。

1.4.5 Western blot檢測(cè)成骨細(xì)胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白表達(dá)的變化 加0.1 mg/mL PMSF、抑肽酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶抑制劑裂解細(xì)胞，加0℃ RIPA裂解液50 μL，用細(xì)胞刮仔細(xì)刮取蛋白，4℃環(huán)境下以12 000 r/m離心30 min，吸取上清，分裝后置于-80℃超低溫冰箱凍存。取提取的細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品加入等體積的2倍上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，在5%積層膠和10% SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳分離待測(cè)蛋白。10 V半干式電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，根據(jù)分子量Marker觀察蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移情況。TBST搖床上洗5 min，37℃用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入抗兔一抗（β-actin、RIP1、RIP3、MLKL，稀釋為1∶1000）4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫下?lián)u床孵育1 h，TBST洗滌后，采用ECL法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，然后用Alphalmager TM 2200進(jìn)行圖像分析，結(jié)果以各目的蛋白與β-actin的灰度比值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞的增殖活性變化

處理24 h后，TNF-α組細(xì)胞增殖能力均低于正常對(duì)照組（P < 0.05），TNF-α+Nec-1組細(xì)胞增殖能力高于TNF-α組（P < 0.05）。處理48 h后，各組細(xì)胞增殖趨勢(shì)沒(méi)有變化，但各組間差異進(jìn)一步放大（P < 0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 Tunel和Caspase 3雙染法檢測(cè)成骨細(xì)胞的程序性壞死情況

TNF-α組細(xì)胞程序性壞死數(shù)量高于正常對(duì)照組（P < 0.05）；TNF-α+Nec-1組成骨細(xì)胞程序性壞死數(shù)量低于TNF-α組（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 成骨細(xì)胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白的表達(dá)

在處理12 h和24 h時(shí)，與正常對(duì)照組比較，TNF-α組成骨細(xì)胞RIP1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），而RIP3、MLKL蛋白表達(dá)降低（P < 0.05）；與TNF-α組比較，TNF-α+Nec-1組成骨細(xì)胞RIP1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），RIP3、MLKL蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P < 0.05）。到48 h時(shí)，TNF-α組RIP1表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組，TNF-α+Nec-1組成骨細(xì)胞RIP1表達(dá)高于TNF-α組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖2。

3 討論

隨著人口的老齡化，骨質(zhì)疏松癥已成為中老年人骨痛、骨折的主要原因。目前，治療骨質(zhì)疏松的主要藥物是雌激素和二膦酸鹽為代表的抗骨吸收的藥物，但治療效果不盡如人意。探索骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生機(jī)制，尋求更為有效的治療方式是近幾年來(lái)研究者們的關(guān)注重點(diǎn)。

細(xì)胞的死亡機(jī)制一直是生物醫(yī)學(xué)研究的核心熱點(diǎn)之一，目前公認(rèn)的主要細(xì)胞死亡類(lèi)型有“壞死”“凋亡”和“自噬”三種[8]。特別的是凋亡和自噬均需要能量和合成新的蛋白質(zhì)，是一個(gè)細(xì)胞自我調(diào)控的主動(dòng)過(guò)程，因此也被稱為“程序性死亡”[9]，而細(xì)胞程序性壞死，則是一個(gè)被動(dòng)的過(guò)程。其中由TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞壞死的分子機(jī)制及其在炎癥等病理過(guò)程中的作用研究較多。本研究重點(diǎn)分析TNF-α對(duì)成骨細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的影響及機(jī)制。

本研究選取小鼠乳鼠，分離培養(yǎng)成骨細(xì)胞，采用TNF-α干預(yù)的動(dòng)物作為模型動(dòng)物處理，加入程序性壞死和凋亡抑制劑Nec-1干預(yù)的動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理，正常對(duì)照組為常規(guī)培養(yǎng)成骨細(xì)胞。首先檢測(cè)成骨細(xì)胞的增殖活性變化，TNF-α組細(xì)胞的增殖活性較正常對(duì)照組降低，TNF-α+Nec-1組在相同時(shí)間段的細(xì)胞增殖活性高于TNF-α組，但低于正常對(duì)照組，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，TNF-α+Nec-1組細(xì)胞增殖活性略有升高。有研究指出，程序性壞死過(guò)程可被RIP1激酶抑制劑Nec-1阻斷，Nec-1是最早鑒定的壞死抑制劑，可特異性抑制RIP1的激酶活性[10-11]。提示TNF-α能夠抑制成骨細(xì)胞的增殖活性，細(xì)胞程序性和凋亡抑制劑Nec-1能夠?qū)NF-α的抑增殖效應(yīng)產(chǎn)生一定的抑制作用。本研究進(jìn)一步檢測(cè)成骨細(xì)胞的程序性壞死情況，TNF-α組的細(xì)胞程序性壞死數(shù)量高于正常對(duì)照組，細(xì)胞出現(xiàn)損傷；TNF-α+Nec-1組成骨細(xì)胞程序性壞死數(shù)量低于TNF-α組，但高于正常對(duì)照組；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，TNF-α+Nec-1組細(xì)胞程序性壞死數(shù)量略有升高。研究表明，細(xì)胞壞死是一種受到精密調(diào)控的“新型”程序性細(xì)胞死亡方式[12]。當(dāng)細(xì)胞凋亡不能正常發(fā)生而細(xì)胞必須死亡時(shí)，壞死可以作為凋亡的“替補(bǔ)”方式被激活。相關(guān)研究提示，程序性細(xì)胞壞死在中風(fēng)、心肌梗死、缺血/再灌注損傷、動(dòng)脈硬化等多種人類(lèi)疾病病理學(xué)中發(fā)揮著重要的作用[13-15]。在非酒精性脂肪性肝病患者中程序性壞死升高，脂肪型肝炎的動(dòng)物模型中TNF-α導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷有RIP3依賴的肝細(xì)胞程序性壞死發(fā)生[16]。本研究結(jié)果提示，TNF-α能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的發(fā)生程序性細(xì)胞壞死，Nec-1能夠抑制成骨細(xì)胞的程序性壞死發(fā)生。為了研究TNF-α對(duì)成骨細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的影響機(jī)制，本研究最后檢測(cè)成骨細(xì)胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白的表達(dá)，相同時(shí)間段比較，在12 h和24 h各組成骨細(xì)胞RIP1表達(dá)無(wú)明顯改變；TNF-α組RIP3、MLKL蛋白表達(dá)正常對(duì)照組，TNF-α+Nec-1組RIP3、MLKL蛋白表達(dá)高于TNF-α組。既往研究指出，程序性細(xì)胞壞死主要由TNFR家族以及Toll樣受體家族啟動(dòng)，并通過(guò)和受體蛋白相互作用的兩個(gè)蛋白激酶RIP1和RIP3傳遞死亡信號(hào)，募集并磷酸化MLKL，而MLKL作為細(xì)胞死亡的執(zhí)行者，最終會(huì)導(dǎo)致壞死的發(fā)生，壞死的細(xì)胞會(huì)向周?chē)尫牌鋬?nèi)容物，這些內(nèi)容物作為DAMPs可刺激周?chē)?xì)胞發(fā)生炎性反應(yīng)，激活機(jī)體免疫應(yīng)答[17-18]。研究表明，TNF-α既可以通過(guò)激活NF-κB誘導(dǎo)細(xì)胞生存途徑，也可以通過(guò)RIP1誘導(dǎo)Caspases依賴性的細(xì)胞凋亡，RIP1在該信號(hào)通路中的功能相當(dāng)是下游信號(hào)通路的一個(gè)支架蛋白是不依賴于其激酶活性的[19]。當(dāng)RIP3和MLKL的表達(dá)水平足夠高時(shí)，RIP3和RIP1會(huì)通過(guò)它們各自的RHIM結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合，活化的RIP3募集MLKL，激活壞死途徑[20]。本研究結(jié)果表明，TNF-α可能是通過(guò)降低成骨細(xì)胞的RIP3、MLKL蛋白表達(dá)來(lái)達(dá)到抑制成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)成骨細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的目的，而Nec-1能夠?qū)NF-α的效應(yīng)產(chǎn)生一定的抑制作用。

可見(jiàn)，TNF-α能夠抑制成骨細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞的發(fā)生程序性細(xì)胞壞死，細(xì)胞程序性和凋亡抑制劑Nec-1能夠?qū)NF-α的抑增殖和促凋亡效應(yīng)產(chǎn)生一定的抑制作用，這可能是通過(guò)降低成骨細(xì)胞的RIP3、MLKL蛋白表達(dá)來(lái)完成的。骨質(zhì)疏松癥在臨床上較為常見(jiàn)，發(fā)病率高，如何通過(guò)進(jìn)一步的研究及分析尋找更為有效的治療手段對(duì)臨床治療來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。未來(lái)可進(jìn)一步從分子、基因角度進(jìn)行分析，探索更多的細(xì)胞因子、蛋白基因與骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及相關(guān)的信號(hào)通路調(diào)控，以求探索到更佳的診療方向，促進(jìn)患者恢復(fù)健康。

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（收稿日期：2018-02-15 本文編輯：李岳澤）