徐佩琳，羅水忠，潘麗華，鄭 志

抗性糊精屬于膳食纖維范疇，具有降低血糖、調(diào)節(jié)血脂和促進(jìn)腸道益生菌生長(zhǎng)繁殖等生理功能，以及良好的溶解性、熱穩(wěn)定性等食品加工性能[1]，受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。目前，制備抗性糊精多采用酸熱法[2-3]，該方法是一種隨機(jī)轉(zhuǎn)化機(jī)制，沒(méi)有辦法精確控制產(chǎn)品組分的分布，而且經(jīng)過(guò)高溫加熱，經(jīng)常會(huì)伴隨著一些不利于工業(yè)生產(chǎn)的副反應(yīng)。與酸熱法相比，酶法工藝具有條件溫和、副反應(yīng)少、不需要酸堿中和等優(yōu)點(diǎn)。酶法更易于產(chǎn)生相對(duì)分子質(zhì)量較低的抗性糊精產(chǎn)品。在酶法制備的基礎(chǔ)上，通過(guò)微波預(yù)處理淀粉能夠更好地制備抗性糊精，是由于微波能夠很大程度地影響酶切位點(diǎn)，提高淀粉對(duì)酶的敏感性，使淀粉自身的性質(zhì)產(chǎn)生了巨大的改變[4]，微波處理后淀粉將會(huì)出現(xiàn)爆裂孔，這些爆裂孔為酶從外部進(jìn)入淀粉內(nèi)部提供了有效的通道，提高了酶解速率，得到更均勻、抗性含量更高、抗消化性能更好的抗性糊精[5-6]。

淀粉是制備抗性糊精的良好原料，以玉米淀粉[2]、馬鈴薯淀粉[7]、木薯淀粉[8]、大米淀粉[9]和糯米淀粉為原料制備抗性糊精已有報(bào)道，然而，尚未有以山藥淀粉為原料制備抗性糊精的研究成果。

山藥為薯蕷科（Discoreaceae） 植物薯蕷的干燥根莖，被認(rèn)為是一種能改善胃脾功能的高級(jí)中草藥，山藥的主要活性成分是黏蛋白、薯蕷皂苷、膽堿、植物甾醇、必需氨基酸、低聚糖和尿囊素等[10]，近年來(lái)，從山藥中分離活性成分的研究十分活躍，而提取后所剩余的殘?jiān)ㄖ饕煞譃榈矸郏?的利用卻并未得到足夠的重視[2]，并且由于山藥易腐爛、易褐變、不耐儲(chǔ)存、不便運(yùn)輸?shù)忍匦?，如何更好地發(fā)揮山藥的綜合價(jià)值一直以來(lái)是學(xué)者研究的難點(diǎn)[11]。事實(shí)上，充分利用山藥淀粉制備抗性糊精等活性功能產(chǎn)品，不僅能豐富淀粉種類，而且能拓寬山藥的利用范圍，提高其附加值；不但豐富山藥的產(chǎn)品種類，而且擴(kuò)大了其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)提升山藥產(chǎn)品質(zhì)量、提高山藥加工新途徑、擴(kuò)大原材料的資源利用率、延長(zhǎng)山藥的貯藏期、提高產(chǎn)品的附加值等都有很好的幫助[12]。

通過(guò)微波輔助酶解的方法來(lái)制備山藥抗性糊精，并且通過(guò)高效液相色譜（HPLC）、差示掃描量熱儀（DSC）和體外消化率來(lái)對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)研究，為山藥的綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山藥，安徽省眾德食品有限公司提供；堿性蛋白酶（CAS：9014-01-1 200 000 U/g），北京索萊寶科技有限公司提供；耐高溫α-淀粉酶（CAS：9000-85-5 40 000 U/g），江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司提供；耐高溫β-淀粉酶（CAS：9000-91-3 700 000 U/g），江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司提供；轉(zhuǎn)苷酶（CAS：9001-42-7 300 000 U/g），Sigma公司提供。

FK-A型組織搗碎機(jī)，江蘇金壇市金城國(guó)盛實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品；FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；Q200型差示掃描量熱儀，美國(guó)TA公司產(chǎn)品；NJL07-3型微波實(shí)驗(yàn)爐，南京杰全微波設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 山藥淀粉的提取

參照Falade K O等人[13]的方法，并略作改動(dòng)。新鮮山藥清洗、去皮、切片（2 cm×2 cm×2 cm），于90℃條件下水浴熱燙3 min，取200 g打漿后置于5 L燒杯中，漿液過(guò)膠體磨3次后，用濃度1.5 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.5～10.0，置于41℃恒溫水浴鍋中，并用數(shù)顯攪拌器不斷攪拌，加入一定量的堿性蛋白酶提取一定時(shí)間后，使用160目濾布過(guò)濾3次，收集濾液。以3 500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，棄去上清液，洗滌過(guò)程重復(fù)3次。將沉淀物真空冷凍干燥24 h，碾磨過(guò)篩即得白色山藥淀粉。山藥淀粉得率為29.5±3.9 g/100 g。

1.3 山藥抗性糊精的制備

配置20%（W/V）的山藥淀粉溶液，加入原料質(zhì)量0.5%的CaCl2，磁力攪拌20 min，以不同微波功率（0～80 W） 進(jìn)行微波處理0～10 min，取出后以濃度0.1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至5.5，分別加入耐高溫α-淀粉酶40 U/g，耐高溫β-淀粉酶用量0～40 U/g，葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶用量20～40 U/g攪拌均勻，密封后放入恒溫水浴鍋中反應(yīng)10～30 min，反應(yīng)結(jié)束后加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.0，放入水浴鍋滅酶3 min后取出，迅速將其用冰水浴冷卻至室溫，冷凍干燥，即得抗性糊精粗品。

（1）山藥抗性糊精含量的測(cè)定。參考Kapusniak J等人[2]的方法，稍作修改。將樣品1.000 0 g分散于20 mL的Mes-Tris緩沖溶液中，然后加入熱穩(wěn)定性的α-淀粉酶溶液（500 U），蛋白酶（30 U） 和糖苷酶；消化后，加入4倍體積的乙醇（體積分?jǐn)?shù)95%，預(yù)熱至60℃）；在具有干燥硅藻土床作為助濾劑的焦油燒結(jié)玻璃坩堝中過(guò)濾沉淀；用乙醇和丙酮洗滌固體殘余物，將殘留的坩堝在110℃的烘箱中干燥過(guò)夜，在干燥器中冷卻至室溫，稱質(zhì)量。干燥殘余物與干燥樣品的初始質(zhì)量的比例為抗性糊精含量。

（2） 葡萄糖當(dāng)量（DE值） 的測(cè)定。準(zhǔn)確稱取樣品1.000 0 g置于燒杯中，用去離子水稀釋至50 mL，然后放入水浴鍋中進(jìn)行糊化處理，冷卻稀釋至1000mL，進(jìn)行葡萄糖含量的測(cè)定。

1.4 物化性質(zhì)的測(cè)定

（1） 溶解度的測(cè)定。參考Kapusniak J等人[2]的方法，略有改動(dòng)。在室溫下稱取1 g（精確到0.000 1）樣品于100 mL的錐形瓶中，用蒸餾水稀釋至50 mL，磁力攪拌使其充分溶解，將懸浮液以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心30 min，在60℃烘箱中干燥過(guò)夜，然后在105℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，稱量上清液中干物質(zhì)的質(zhì)量。

（2）熱力學(xué)性質(zhì)測(cè)定。山藥淀粉和山藥抗性糊精的熱力學(xué)性質(zhì)用DSC測(cè)定，參照Ashri A等人[15]的方法，略有改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取一定量的抗性糊精樣品（按干基計(jì)）于液體坩堝中，按1∶2的比例加入去離子水，加蓋壓緊、密封，在4℃條件下平衡24 h。平衡后的樣品在DSC中糊化，儀器通N2，速率50 mL/min，以10℃/min的速率升溫，溫度從20℃升到150℃，通過(guò)圖譜計(jì)算樣品起始溫度（To），峰值溫度（Tp），結(jié)束溫度（Tc） 和糊化焓（ΔH）。

（3） 相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定。高效液相色譜法（HPLC） 是測(cè)量多糖相對(duì)分子量常用的方法之一。試驗(yàn)根據(jù)Pan L H等人[16]描述的測(cè)定分子量的方法，進(jìn)行簡(jiǎn)單修改。所用色譜裝置為：色譜柱為TSK G5000PWxl（7.8 mm×300 mm） 和 TSK G54000PWxl（7.8 mm×300 mm）串聯(lián)，以超純水為流動(dòng)相進(jìn)行色譜分析；檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器，柱溫30℃，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量20 μL；采用一系列葡聚糖T標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)分子量測(cè)定的校準(zhǔn)曲線，包括T-1000，T-500，T-100，T-50和T-20；平均分子量由Breeze軟件版本3.3（Waters Co.Ltd.）計(jì)算。

1.5 體外模擬人工胃液與人工腸液

根據(jù)2015年“中國(guó)藥典”制備人造胃液（AGJ）和人造腸液（AIF）。按照Shi M M等人[17]所述人工模擬胃腸消化，并稍作修改。消化過(guò)程中，取0.5 g抗性糊精于5 mL人造胃液/腸液。配置好消化液，分別對(duì)應(yīng)于人造胃液條件下消化30，60，120，240 min；人造腸液消化0，30，90，180，360 min時(shí)取出等分試樣（0.5 mL），并最終用苯酚-硫酸法進(jìn)行總碳水化合物測(cè)定。制作葡萄糖含量與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

平均消化率根據(jù)下式計(jì)算：

總碳水化合物消化產(chǎn)物（CHO）=C×D×（425-S） ×0.001

式中：CHO——總碳水化合物消化產(chǎn)物，mg；

C——碳水化合物在0.5 mL稀釋透析液中參照標(biāo)準(zhǔn)曲線；

D——稀釋倍數(shù)；

425——整個(gè)系統(tǒng)的體積，mL；

S——從400 mL稀釋透析液0.5 mL，mL；

0.001——毫克級(jí)的轉(zhuǎn)換；

W——樣品質(zhì)量，mg。

1.6 數(shù)據(jù)分析

上述所有試驗(yàn)至少進(jìn)行3次。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差 （SD）。使用 SPSS 19軟件 （IBM Corporation，Armonk，NY，USA），方差分析 （ANOVA）和Duncan's檢驗(yàn)以95%顯著性水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用Origin 8.6繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波預(yù)處理-酶解制備山藥抗性糊精的工藝研究

微波預(yù)處理制備條件對(duì)山藥抗性糊精含量和DE值的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，山藥抗性糊精含量隨著微波功率和微波時(shí)間的增加呈現(xiàn)先逐漸增大后減小的趨勢(shì)，微波功率60 W，微波時(shí)間6 min時(shí)達(dá)到抗性糊精含量的最大值，為40.33%。當(dāng)繼續(xù)增加微波功率和時(shí)間，淀粉易形成凝膠，從而不利于形成山藥抗性糊精。微波預(yù)處理的過(guò)程使得直鏈淀粉更易發(fā)生降解，聚合度降低，產(chǎn)品分支度增高，且淀粉經(jīng)過(guò)微波作用，影響其酶切位點(diǎn)，有利于小分子的重新聚合，生成更多不被酶消化的抗性糊精。DE值表示淀粉水解程度，隨著微波功率和微波時(shí)間的增加，酶解程度不斷增加，DE值也不斷增加[7]。

圖1 微波預(yù)處理制備條件對(duì)抗性糊精含量和DE值的影響

酶解制備條件對(duì)抗性糊精含量和DE值的影響見(jiàn)圖2。

由圖2（a） 可知，抗性糊精含量隨著酶解溫度的升高和加熱時(shí)間的增加而呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，酶解溫度75℃，加熱時(shí)間20 min時(shí)達(dá)到最大值，抗性糊精含量為30.59%。當(dāng)酶解溫度繼續(xù)升高、酶解時(shí)間延長(zhǎng)，抗性糊精含量開(kāi)始急劇降低，這可能是加快了α-淀粉酶內(nèi)切淀粉α-1,4糖苷鍵的速率，形成快速降解，不利于形成抗性糊精。

由圖2（c） 可知，抗性糊精含量隨著β-淀粉酶用量增加而呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，在酶用量達(dá)到20 U/g時(shí)，達(dá)到最大值，而后因?yàn)棣?淀粉酶用量過(guò)大，導(dǎo)致其切開(kāi)α-1,4糖苷鍵的速度過(guò)快，不易形成抗性糊精。β-淀粉酶是一種外切酶，遇1,6鍵或取代集團(tuán)就酶解停止，保留了淀粉原來(lái)的枝杈結(jié)構(gòu)，增加形成抗性糊精的分支度，從而得到抗性糊精，Tester R F等人[18]對(duì)此進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究與報(bào)道。

由圖2（d）可知，隨著轉(zhuǎn)苷酶用量的不斷增加，其抗性不斷增強(qiáng)。當(dāng)酶用量達(dá)到35 U/g時(shí)，增加趨于緩慢。轉(zhuǎn)苷酶能夠增強(qiáng)抗性的原因可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)苷酶能夠?qū)⒂坞x于溶液中的葡萄糖、麥芽糖等小分子通過(guò)其他鍵的結(jié)合形式結(jié)合于糊精分子上形成潘塘、異麥芽糖和其他分歧低聚糖等，而這部分也是抗性成分，從而形成抗性糊精[14]。Wang Y J等人[19]也進(jìn)行了相關(guān)研究，轉(zhuǎn)苷酶從高直鏈玉米淀粉中獲得酶抗性糊精。

隨著酶解溫度、酶解時(shí)間和β-淀粉酶酶用量增加，山藥淀粉的酶解程度和酶的活性不斷增強(qiáng)，酶解程度相應(yīng)隨之增加，即DE值不斷增大。

圖2 酶解制備條件對(duì)抗性含量和DE值的影響

綜上所述，出于經(jīng)濟(jì)成本的考慮，在下面的研究中，以微波預(yù)處理功率60 W和微波時(shí)間6 min，通過(guò)酶解溫度75℃，酶解時(shí)間20 min，添加β-淀粉酶20 U/g和轉(zhuǎn)苷酶35 U/g作為山藥抗性糊精制備條件，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)研究。

2.2 物化性質(zhì)的分析

抗性糊精與山藥淀粉的分子量和熱特性分析見(jiàn)表1。

表1 抗性糊精與山藥淀粉的分子量和熱特性分析

由表1可知，山藥淀粉的相轉(zhuǎn)變溫度為67.12℃，而以此制備的山藥抗性糊精的相轉(zhuǎn)變溫度為93.24℃，說(shuō)明淀粉的基本結(jié)構(gòu)已不存在，形成了新的結(jié)構(gòu)，該物質(zhì)的熱穩(wěn)定性很高，這種吸熱轉(zhuǎn)變歸因于山藥淀粉制備山藥抗性糊精過(guò)程中分子的重新聚合和轉(zhuǎn)糖基作用[17，20]。通過(guò)高效液相色譜測(cè)定抗性糊精與山藥淀粉的相對(duì)分子量，根據(jù)分子量與保留時(shí)間之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算微波輔助酶解制備得到的抗性糊精和山藥淀粉的相對(duì)分子量分子量（Mw）約為4.0×103Da和3.2×104Da（見(jiàn)表1）。由于抗性糊精在形成過(guò)程中發(fā)生解聚，造成嚴(yán)重的主鏈結(jié)構(gòu)（α-1,4糖苷鍵）解聚，以及在酶和微波預(yù)處理的共同作用形成新的分支，所以抗性糊精的分子量比山藥淀粉顯著降低[21]。

山藥抗性糊精含量對(duì)山藥淀粉溶解度的影響見(jiàn)圖3。

圖3 山藥抗性糊精含量對(duì)山藥淀粉溶解度的影響

由圖3可知，抗性糊精抗性含量越高，溶解度越好，與原山藥淀粉相比，溶解度提高了47.01%，此時(shí)抗性糊精含量為40.33%，抗性糊精溶解度好的原因或許是在形成糊精的過(guò)程中，山藥淀粉顆粒的無(wú)定形區(qū)和結(jié)晶區(qū)都被破壞，山藥淀粉的空間結(jié)構(gòu)也被破壞，使山藥淀粉分子降解得到了很多的可溶性小分子物質(zhì)[7]。良好的水溶性使得山藥抗性糊精能夠更好地應(yīng)用在食品行業(yè)中。

2.3 山藥抗性糊精體外消化性分析

人工胃液（AGJ） 和人工腸液中（AIF） 中抗性糊精和山藥淀粉的體外消化率見(jiàn)表2。

表2顯示了山藥淀粉及其制備得到的抗性糊精樣品在人造模擬胃液中處理240 min和在人造腸液中處理360 min的體外消化情況。結(jié)果表明，在人工胃液消化階段，所有樣品消化緩慢，隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，消化率均小于1%。在人造腸液消化階段，山藥淀粉在人造腸液中消化率顯著增加，山藥抗性糊精在人造腸液中的消化率遠(yuǎn)低于山藥淀粉。人工胃液對(duì)山藥淀粉和抗性糊精微量的消化作用，可能是因?yàn)槲敢壕哂休^強(qiáng)的酸性，對(duì)其具有輕微水解作用和侵蝕作用[22]。據(jù)報(bào)道，淀粉分子在形成抗性糊精時(shí)，分子重新聚合形成不易消化的1,2-、1,3-或具有高分支度的糊精分子，對(duì)酶消化具有抗性[23]，故而山藥抗性糊精在人工腸液中消化緩慢。

表2 人工胃液（AGJ）和人工腸液中（AIF）中抗性糊精和山藥淀粉的體外消化率/%

3 結(jié)論

在微波功率60 W，微波時(shí)間6 min預(yù)處理淀粉的基礎(chǔ)上，酶解溫度75℃，酶解時(shí)間20 min，β-淀粉酶酶用量20 U/g，葡糖糖轉(zhuǎn)苷酶酶用量35 μ/g的制備條件下所制備的山藥抗性糊精含量和溶解度分別達(dá)到了40.33%和47.01%，具有較低分子量約為4 000 Da，還具有較好的熱穩(wěn)定性和對(duì)人造胃液或小腸液的高耐受性，這些特點(diǎn)使得由山藥淀粉制備得到的抗性糊精更適合應(yīng)用于食品行業(yè)中。今后，還需要對(duì)抗性糊精展開(kāi)進(jìn)一步研究，以更好地認(rèn)識(shí)其結(jié)構(gòu)和形成機(jī)理，并驗(yàn)證其是否具有作為膳食纖維和益生元的可能性。

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