王玉姣,陳姍姍,孫柏華,艾聰聰,王中洋,張修國(guó)

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辣椒疫霉菌誘導(dǎo)辣椒酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定

王玉姣,陳姍姍,孫柏華,艾聰聰,王中洋,張修國(guó)*

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院；山東省蔬菜病蟲(chóng)生物學(xué)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 泰安 271018

辣椒疫霉菌（）引起的辣椒疫病是在世界范圍內(nèi)廣泛分布的毀滅性病害之一，對(duì)我國(guó)辣椒生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為深入研究辣椒疫霉的致病機(jī)制，尋找辣椒疫霉在辣椒體內(nèi)的互作蛋白，利用SMART同源重組交換技術(shù)，在酵母菌株Y187中構(gòu)建了被辣椒疫霉侵染不同時(shí)期辣椒的cDNA文庫(kù)。文庫(kù)質(zhì)量評(píng)定結(jié)果顯示cDNA文庫(kù)的滴度為1.13×106CFU/mL，文庫(kù)的庫(kù)容量為1.7×107CFU，文庫(kù)的重組率為96%，插入片段平均長(zhǎng)度在1Kbp左右。該文庫(kù)的構(gòu)建為研究辣椒疫霉的致病機(jī)制、辣椒的抗病機(jī)制及尋找藥物靶標(biāo)位點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

辣椒疫霉菌; 辣椒; 酵母雙雜交; cDNA文庫(kù)

辣椒疫霉菌（）引起的辣椒疫病是毀滅性土傳病害，短期內(nèi)暴發(fā)成災(zāi)[1]，游動(dòng)孢子主要侵染葉、果實(shí)和莖，引起軟腐、倒伏，可減產(chǎn)50%以上，對(duì)蔬菜產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。疫霉菌是一類營(yíng)半活體營(yíng)養(yǎng)的病原卵菌（Oomycetes）[2]，能夠在侵染過(guò)程中外泌效應(yīng)因子到植物細(xì)胞中破壞植物的防衛(wèi)反應(yīng)促進(jìn)自身侵染定殖[3]。效應(yīng)因子是一類具有操控寄主先天免疫反應(yīng)，加強(qiáng)病原菌在寄主內(nèi)感染的蛋白質(zhì)分子[4]。隨著植物病原菌的深入研究，探索效應(yīng)因子與寄主互作分子機(jī)制已經(jīng)成為植物病理學(xué)家們研究的重要內(nèi)容[4-6]。目前，越來(lái)越多的植物病原菌效應(yīng)因子互作機(jī)制得到闡釋，寄主中的互作靶標(biāo)可以是核酸[7]，也可以是單一的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物[8]。然而，至今還未見(jiàn)到對(duì)辣椒疫霉效應(yīng)因子致病機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。

酵母雙雜系統(tǒng)是篩選互作蛋白最常用的方法[9]，是利用酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的特性來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析的系統(tǒng)[10,11]。GAL4 DNA-BD（DNA結(jié)合域）與bait（誘餌）融合表達(dá)，GAL4 AD（轉(zhuǎn)錄激活域）與prey（獵物文庫(kù)）融合表達(dá)。Bait與prey之間的相互作用可以使GAL4重新具有轉(zhuǎn)錄活性，從而可以激活下游報(bào)告基因的表達(dá)。利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選即可獲得具有報(bào)告基因活性的克隆，從而分析蛋白質(zhì)之間的相互作用[12]。

篩選辣椒疫霉效應(yīng)因子的宿主靶標(biāo)蛋白，研究該蛋白在病菌侵染過(guò)程中如何調(diào)控植物的防衛(wèi)反應(yīng)，可采用構(gòu)建辣椒cDNA文庫(kù)篩選互作蛋白而實(shí)現(xiàn)。本研究采用SMART（Switching Mechanism at 5’End of the RNA Transcript）cDNA合成技術(shù)，通過(guò)同源重組方法構(gòu)建了被辣椒疫霉侵染0 h、12 h、24 h、48 h、60 h及72 h的辣椒cDNA文庫(kù)，為篩選辣椒疫霉效應(yīng)因子互作蛋白，深入研究效應(yīng)因子與宿主互作分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

辣椒疫霉菌株SD33由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，辣椒為本實(shí)驗(yàn)室種植的自交系06221，Make Your Own“Mate & PlateTM”Library System User Manual、cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒及SD/-Leu營(yíng)養(yǎng)選擇性培養(yǎng)基均購(gòu)自Clontech公司，DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 文庫(kù)鑒定引物

根據(jù)pGADT7-Rec序列設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增文庫(kù)插入片段的鑒定引物。引物序列為：F：5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGAGCGCCGCCATG-3′，R：5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCA GTATCTACGATT-3′，引物由濟(jì)南鉑尚生物公司合成。

1.3 總RNA的提取

用液氮研磨被辣椒疫霉侵染0 h、12 h、24 h、48 h、60 h及72 h的辣椒葉片，采用Trizol法提取總RNA。用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的RNA質(zhì)量。

1.4 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

1.4.1 雙鏈cDNA的合成以5 μg總RNA為模版，以CDS Ⅲ（Oligo-dT）為引物，SMART MMLV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA；以第一鏈cDNA為模版，使用LD PCR（Long distance PCR）擴(kuò)增合成dscDNA。利用CHROMA SPIN+TE-400 Columns分級(jí)分離純化雙鏈cDNA，在1.2%的瓊脂糖凝膠上對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1.4.2 Y187菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取活化的Y187單克隆菌落，在YPDA液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.15~0.3；3800 rpm離心5 min，棄上清，加入100 mLYPDA重懸菌液并繼續(xù)培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4~0.5，3800 rpm離心5 min，棄上清，無(wú)菌水重懸菌體后再次離心棄上清；加入1.5 mL1.1×TE/LiAc溶液重懸菌體高速離心15 s，棄上清，使用600 μL1.1×TE/LiAc重懸菌體，即為感受態(tài)細(xì)胞。

1.4.3 文庫(kù)的構(gòu)建和收集向500 μL Y187感受態(tài)中加入：6 μL pGADT7-Rec Cloning Vector，5 μg cDNA，3 μL SV40 Large-T PCR fragment (25 ng/μL)，20 μL Herring Tests Carrier DNA，2.5 mL PEG/LiAc輕輕混勻；30 ℃孵育45 min，每15 min輕輕混勻1次；然后加入160 μL DMSO，42 ℃孵育20 min，每10 min混勻1次；3800 rpm離心5 min棄上清，加入3 mL YPD Plus重懸菌體，30 ℃振蕩培養(yǎng)90 min；相同條件再次離心收集菌體，用15 mL 0.9% NaCl重懸菌體。將菌液涂布在15 cm SD/-Leu選擇培養(yǎng)基上。每個(gè)板涂布150 μL菌液，30 ℃倒置培養(yǎng)3~4 d。文庫(kù)收集：每個(gè)平板使用3 mL凍存液刮洗，將所有菌液混勻于無(wú)菌錐形瓶。將文庫(kù)分裝10管于1.5 mL離心管每管1 mL，剩余菌液分裝于50 mL離心管，-80 ℃貯存。

1.4.4 文庫(kù)的質(zhì)量鑒定取500 μL共轉(zhuǎn)化菌液按101到104稀釋，分別涂布在SD/-Leu 15 cm固體培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度涂布3個(gè)平板，30 ℃，倒置培養(yǎng)3~4 d。對(duì)生長(zhǎng)的單菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率和文庫(kù)容量，文庫(kù)滴度＝平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/涂板體積。于SD/-Leu平板上隨機(jī)挑取50個(gè)克隆進(jìn)行PCR鑒定，確定文庫(kù)的陽(yáng)性率及插入片段大小的分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 總 RNA的提取

提取被辣椒疫霉侵染不同時(shí)期的辣椒葉片總RNA，使用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)總RNA質(zhì)量，如圖1所示，28S和18S rRNA條帶清晰，表明RNA完整性較好；經(jīng)測(cè)定分析，A260/A280為1.98，濃度約為1.5 μg/μL，這表明RNA提取質(zhì)量較好可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1:辣椒總RNA; M:DNA Marker DL12000

Fig.1 Detection of pepper total RNA by electrophoresis

1: dscDNA; M:DNA Marker DL12000

2.2 雙鏈cDNA文庫(kù)的瓊脂糖凝膠電泳

以總RNA為模板，CDS Ⅲ為引物反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA；以第一鏈cDNA為模板，使用LD PCR擴(kuò)增合成 dscDNA，合成的dscDNA經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖2所示，大小集中分布在600~2000 bp范圍內(nèi)，且該區(qū)域有彌散狀條帶出現(xiàn)，表明雙鏈cDNA在該區(qū)域的分布較為完整，豐度較好。

2.3 酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和評(píng)價(jià)

Mate & Plate文庫(kù)構(gòu)建是在酵母中進(jìn)行的，借助生物體自身的同源重組功能將cDNA克隆到pGADT7-Rec中。首先，使用SMART cDNA合成技術(shù)合成含有與pGADT7-Rec載體末端同源的cDNA，然后，將cDNA和pGADT7-Rec轉(zhuǎn)入Y187中，然后在SD/–Leu固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3~5 d。最后將所有克隆收集并分裝成1 mL的文庫(kù)用于雙雜交篩選。

統(tǒng)計(jì)稀釋10、102倍、103倍和104倍后長(zhǎng)出的單克隆數(shù)目，求平均值后計(jì)算文庫(kù)滴度，文庫(kù)滴度=每板平均克隆數(shù)/涂布體積×稀釋倍數(shù)（表1）；總庫(kù)容量Total CFU (cfu) =平均滴度（cfu/mL）×cDNA library總體積（mL）。該文庫(kù)平均滴度為1.13×106CFU/mL，共計(jì)15 mL的轉(zhuǎn)化后原始菌液，則總庫(kù)容量為：1.13×15×106CFU=1.7×107CFU。從SD/-Leu平板上隨機(jī)挑25個(gè)克隆進(jìn)行搖菌提質(zhì)粒后進(jìn)行PCR檢測(cè)，部分結(jié)果如圖3所示，顯示插入片段的大小集中在600~2000 bp之間，陽(yáng)性菌落數(shù)為24個(gè)，重組率為96%。

表 1 文庫(kù)滴度

M: DNA Marker DL2000; 1-24: 插入片段PCR產(chǎn)物

3 討論

大量的研究表明，辣椒疫霉能夠在侵染過(guò)程中外泌效應(yīng)因子進(jìn)入植物細(xì)胞中破壞植物的防衛(wèi)反應(yīng)促進(jìn)自身侵染定殖[13,14]，效應(yīng)因子通過(guò)與宿主靶標(biāo)蛋白互作，調(diào)控植物的信號(hào)通路及代謝活動(dòng)從而實(shí)現(xiàn)自己的功能。因此，為了更好的控制由辣椒疫霉引起的辣椒疫病，我們需要對(duì)效應(yīng)分子的靶標(biāo)蛋白以及效應(yīng)分子的致病機(jī)制進(jìn)行更加深入的了解。

對(duì)基因功能的研究離不開(kāi)對(duì)基因所編碼蛋白的研究，蛋白質(zhì)是基因功能的執(zhí)行者和體現(xiàn)者，生命活動(dòng)中大多數(shù)蛋白質(zhì)需與其他蛋白結(jié)合才能發(fā)揮作用。目前，酵母雙雜交是研究蛋白質(zhì)互作最廣泛的技術(shù)[10]，具有篩選效率較高、可以檢測(cè)到一些微弱的蛋白質(zhì)互作以及在酵母細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證互作而無(wú)需純化蛋白質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)前互作蛋白篩選的主要方法[8]。

本研究利用SMART技術(shù)合成dscDNA建立酵母雙雜交文庫(kù)，無(wú)需對(duì)樣本總RNA中mRNA分離純化，有效避免了純化過(guò)程中mRNA的降解；重組cDNA片段集中在600-2000 bp之間，具有較好的多態(tài)性，滿足后續(xù)要求；利用同源重組方法，將外源dscDNA定向與pGADT7-Rec載體重組，避免了繁瑣的酶切連接等步驟和解決了低效率連接和克隆問(wèn)題，從而保證了cDNA文庫(kù)的完整性。本研究以多達(dá)7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的經(jīng)辣椒疫霉誘導(dǎo)的辣椒葉片作為建庫(kù)材料，保證了文庫(kù)包含的抗病相關(guān)基因數(shù)量的最大化。本研究所在課題組前期已構(gòu)建部分效應(yīng)因子的誘餌載體，可使用本文庫(kù)進(jìn)行效應(yīng)因子互作蛋白篩選工作。雖然cDNA文庫(kù)中辣椒基因在各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝通路已有注釋，但其在辣椒體內(nèi)的實(shí)際功能還有待發(fā)掘。因此，本研究構(gòu)建的經(jīng)辣椒疫霉SD33誘導(dǎo)的辣椒酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，不僅有助于辣椒基因功能注釋，還將推動(dòng)抗病基因的發(fā)掘和抗病機(jī)制的解析。

4 結(jié)論

本研究利用SMART技術(shù)構(gòu)建了經(jīng)辣椒疫霉SD33誘導(dǎo)的辣椒酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。提取的總RNA條帶清晰，未發(fā)生降解，并且沒(méi)有蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)的污染；文庫(kù)容量為1.7×107，滴度為1.13×106cfu/mL，重組cDNA片段大小集中在600~2000 bp之間，重組率96%。該文庫(kù)質(zhì)量較高，滿足下步互作蛋白篩選及致病機(jī)制分析。

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Construction and Characterization of Yeast Two-Hybrid cDNA Library Derived fromInoculated with

WANG Yu-jiao,CHEN Shan-shan, SUN Bai-hua, AI Cong-cong, WANG Zhong-yang, ZHANG Xiu-guo*

271018,

is the casual agent ofPepper blight, which is one of the most destructive diseases that harms pepper industry around the world.Therefore, to study the pathogenic mechanism and screen proteins for, yeast two-hybrid cDNA libraries of pepper infected bywere constructed in yeast strain Y187 using homologous recombination-mediated SMART technology. The qualities of the cDNA libraries were evaluated as the followings: the titers were 1.13×106CFU/mL, the capacity of cDNA library was 1.7×107CFU/mL, the recombinant rate was 96%, and the protein average length encoded by the inserted cDNA is about 1Kbp. The construction of this library lays the foundation for studying the pathogenic mechanism of, the disease resistance mechanism of pepper and the search for drug target sites.

;; yeast two-hybrid; cDNA libraries

S436.418.1+2

A

1000-2324(2018)03-0379-04

2017-09-23

2017-10-23

國(guó)家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-25-03B)

王玉姣(1990-),女,在讀碩士研究生,研究方向:植物病原卵菌分子遺傳學(xué). E-mail:18354285903@163.com

Author for correspondence. E-mail:zhxg@sdau.edu.cn