胡付品， 朱德妹

當(dāng)前，碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）在醫(yī)療機(jī)構(gòu)的快速流行和播散，已成為全球公共衛(wèi)生的重大問題。加強(qiáng)CRE菌株的檢測和有效的醫(yī)院感染控制措施干預(yù)，是遏制CRE菌株進(jìn)一步流行播散的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本文對國際上關(guān)于CRE菌株的檢測方法和防控指南（主要包括世界衛(wèi)生組織、美國疾病預(yù)防控制中心和英國公共衛(wèi)生中心發(fā)布的指南文件）進(jìn)行簡單描述，以供參考。

近年來，CRE的檢出率在全球范圍內(nèi)呈逐年增高趨勢，給社會(huì)公共健康領(lǐng)域帶來嚴(yán)重的威脅。CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)歷年監(jiān)測結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類的耐藥率亦呈快速上升趨勢，從2005年其對亞胺培南的耐藥率3.0%上升至2016年的16.1%[1-2]。CRE菌株所致感染往往伴隨高死亡率，研究顯示，CRE所致侵襲性感染（如血流感染）的死亡率可達(dá)40%～50%甚或更高。此外，CRE菌株常同時(shí)攜帶對其他抗菌藥物耐藥的基因，導(dǎo)致其對目前臨床常用的所有抗菌藥物耐藥，即全耐藥。當(dāng)前，CRE菌株在我國主要分離自住院患者，但需引起高度重視的是，該類耐藥菌株存在隨時(shí)向社區(qū)播散的可能。

1 CRE最新定義 [3]

腸桿菌科細(xì)菌滿足以下任一條件，該菌即為CRE：①對任一碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，亞胺培南、美羅培南或多立培南的最低抑菌濃度（MIC）≥4 mg/ L，或厄他培南MIC≥2 mg/L；②產(chǎn)生碳青霉烯酶；③對于天然對亞胺培南非敏感的細(xì)菌（如摩根摩根菌、變形桿菌屬、普羅威登菌屬），需參考除亞胺培南外的其他碳青霉烯類抗菌藥物的MIC。

2 腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類藥物的耐藥機(jī)制

2.1 產(chǎn)生碳青霉烯酶

產(chǎn)生碳青霉烯酶是腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類耐藥最主要機(jī)制，該酶可直接破壞碳青霉烯類抗菌藥物。由于碳青霉烯酶基因大多位于可移動(dòng)基因元件上，導(dǎo)致其很容易在不同腸桿菌科細(xì)菌以及其他革蘭陰性桿菌間轉(zhuǎn)移，在短時(shí)間內(nèi)可導(dǎo)致大范圍的流行播散[4]。目前我國臨床分離的CRE菌株主要產(chǎn)生KPC型碳青霉烯酶和NDM-1型金屬β內(nèi)酰胺酶，其他的碳青霉烯酶尚有SME、IMI、NMC和GES等A類碳青霉烯酶，VIM、IMP、SPM和GIM型金屬β內(nèi)酰胺酶等B類碳青霉烯酶，以及OXA型碳青霉烯酶（如OXA-48、OXA-181和OXA-232型）等[5]。

2.2 其他機(jī)制

某些腸桿菌科細(xì)菌可通過非產(chǎn)碳青霉烯酶機(jī)制，如AmpC和/或超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）合并膜孔蛋白突變，以及青霉素結(jié)合蛋白靶位結(jié)構(gòu)改變等導(dǎo)致其對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥。

3 碳青霉烯酶的檢測

實(shí)驗(yàn)室檢測碳青霉烯酶的方法眾多。主要包括改良Hodge試驗(yàn)、Carba NP試驗(yàn)、改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)（modified carbapenem inactivation method，mCIM）、酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)、免疫金標(biāo)試驗(yàn)以及分子生物學(xué)方法等。

3.1 改良Hodge試驗(yàn)[6]

其操作步驟按CLSI推薦的方法進(jìn)行。將0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊拇竽c埃希菌ATCC 25922稀釋10倍后涂布于MH 平皿，中間貼厄他培南（10 μg）紙片，接種環(huán)自紙片外緣向平皿邊緣劃線接種待檢菌，注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基表面。35 ℃過夜培養(yǎng)，次日，厄他培南抑菌圈處出現(xiàn)矢狀生長者為待檢菌產(chǎn)碳青霉烯酶。見圖1。

由于該試驗(yàn)可出現(xiàn)檢測結(jié)果假陽性或假陰性，2018年CLSI文件已刪除改良Hodge試驗(yàn)。

圖1 改良Hodge 試驗(yàn)檢測碳青霉烯酶

3.2 酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)[7]

以3-氨基苯硼酸（600 μg/片）和EDTA（292 μg/片）分別作為KPC型碳青霉烯酶和金屬β內(nèi)酰胺酶抑制劑。操作按CLSI推薦的紙片法進(jìn)行，含酶抑制劑合劑的抑菌圈直徑與單藥相差≥5 mm以上，即可判斷該受試菌株產(chǎn)生A類或B類碳青霉烯酶。見圖2。

圖2 3-氨基苯硼酸和EDTA聯(lián)合碳青霉烯類抗菌藥檢測碳青霉烯酶

3.3 Carba_NP試驗(yàn)[6]

CLSI于2015年引入Carba_NP試驗(yàn)，用于檢測腸桿菌科、銅綠假單胞菌和不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌中碳青霉烯酶的表型確證試驗(yàn)。該試驗(yàn)采用比色法，目前主要用于流行病學(xué)研究或感染控制。研究表明，Carba_NP試驗(yàn)在檢測KPC、NDM、VIM、IMP、SPM和SME型碳青霉烯酶方面具有較好的敏感度（＞90%）和特異度（＞90%）。Carba_NP試驗(yàn)結(jié)果解釋見表1。

表1 Carba_NP試驗(yàn)結(jié)果判讀

3.4 mCIM試驗(yàn)[6]

其原理是碳青霉烯類抗菌藥物（通常為美羅培南）與受試菌懸液混合，若受試菌產(chǎn)生碳青霉烯酶，可破壞美羅培南的抗菌活性；若受試菌不產(chǎn)碳青霉烯酶，無法破壞美羅培南的抗菌活性，美羅培南仍可保持其對大腸埃希菌ATCC 25922的抗菌活性。結(jié)果判斷：美羅培南抑菌圈直徑6～15 mm為陽性，16～18 mm但圈內(nèi)存在散在菌落亦為陽性，≥19 mm為陰性結(jié)果。見圖3、圖4。

圖3 mCIM試驗(yàn)檢測碳青霉烯酶操作步驟

圖4 mCIM試驗(yàn)檢測碳青霉烯酶結(jié)果判斷

3.5 碳青霉烯酶檢測紙片組合

當(dāng)前商品化可檢測碳青霉烯酶的紙片中，推薦英國MAST公司的碳青霉烯酶檢測紙片組合。該組合共包含5張紙片，以法羅培南和替莫西林為底物，輔以A類和B類碳青霉烯酶抑制劑，可同時(shí)檢測KPC型碳青霉烯酶、B類金屬酶和OXA-48型碳青霉烯酶，并可通過結(jié)果組合判斷非產(chǎn)碳青霉烯酶的AmpC酶合并膜孔蛋白缺失所致碳青霉烯類耐藥機(jī)制。見圖5。

圖5 碳青霉烯酶檢測紙片組合檢測碳青霉烯酶

3.6 免疫金標(biāo)試驗(yàn)

這是目前以菌落為基礎(chǔ)的最快速的檢測碳青霉烯酶的方法。挑取一接種環(huán)待測菌菌落與裂解液混合，然后將此混合液滴加在加樣孔中，15 min后即可觀察結(jié)果。若板上標(biāo)記線條由綠色變?yōu)榧t色，提示該菌產(chǎn)生碳青霉烯酶（圖6）。目前該金標(biāo)測試條可快速檢測KPC、NDM和OXA-48型碳青霉烯酶。

圖6 免疫金標(biāo)試驗(yàn)快速檢測碳青霉烯酶示意圖

3.7 快速分子診斷技術(shù)[8-9]

分子診斷技術(shù)可直接檢測標(biāo)本中碳青霉烯酶基因，實(shí)現(xiàn)快速篩查CRE菌株的目的。如Cepheid公司的Carba檢測試劑盒，該試劑盒可同時(shí)檢測KPC、NDM、IMP、VIM和OXA型碳青霉烯酶，檢測時(shí)間一般在1 h左右，其檢測靈敏度和特異度可達(dá)96%以上。

3.8 質(zhì)譜技術(shù)[10]

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDITOF MS） 是近年來發(fā)展的簡便、快速、準(zhǔn)確的病原微生物鑒定方法。質(zhì)譜技術(shù)通過比較不同細(xì)菌間質(zhì)譜峰強(qiáng)度差異，可快速對碳青霉烯類耐藥細(xì)菌進(jìn)行檢測。

4 感染預(yù)防控制措施

采取有效的醫(yī)院感染控制措施遏制CRE菌株在不同患者和不同區(qū)域間的流行播散是當(dāng)務(wù)之急。預(yù)防策略：一般流行情況下，采用標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防控制措施防CRE菌株的流行播散，如手衛(wèi)生和接觸隔離警示。對于嚴(yán)重的CRE流行區(qū)域（如感染暴發(fā)或CRE檢出率呈上升趨勢區(qū)域），需采用更多的預(yù)防控制措施。對于無法開展碳青霉烯酶檢測的機(jī)構(gòu)，任何表型確認(rèn)為攜帶CRE菌株的患者，均應(yīng)采取預(yù)防控制措施[12]。此外，研究顯示，腸道作為腸桿菌科細(xì)菌的儲(chǔ)存庫，CRE菌株的定植是其遷移至機(jī)體其他部位導(dǎo)致感染的重要危險(xiǎn)因素[13]。Gorrie等[14]對498例患者肛拭子篩查結(jié)果顯示，10.8%患者腸道定植有碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌。CRE腸道攜帶與非攜帶患者中繼續(xù)其他部位感染的發(fā)生率分別為16%和3%。近期，世界衛(wèi)生組織（WHO）在全球召集感染病、感染防控領(lǐng)域的頂級(jí)專家，制定耐藥菌防控指南，為國家和醫(yī)療機(jī)構(gòu)層面制定和實(shí)施碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌的科學(xué)有效防控工作，提供策略性指導(dǎo)。在WHO發(fā)布的關(guān)于碳青霉烯類耐藥革蘭陰性桿菌的防控指南中[15]，強(qiáng)調(diào)對于此類耐藥細(xì)菌，其所致感染或定植的防控應(yīng)多管齊下，至少包括手衛(wèi)生、監(jiān)測（特別是CRE）、接觸預(yù)防、患者隔離（單間隔離或集中隔離）和環(huán)境清潔等策略。有效的感染預(yù)防控制措施包括如下。

4.1 加強(qiáng)監(jiān)測

醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)時(shí)刻關(guān)注是否有攜帶CRE菌株的患者入院，同時(shí)應(yīng)了解本機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室是否有能力開展碳青霉烯酶的檢測。若不具備檢測實(shí)驗(yàn)條件，必要時(shí)可請有資質(zhì)機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室協(xié)助檢測。

開展細(xì)菌耐藥性監(jiān)測工作，了解本機(jī)構(gòu)臨床分離CRE菌株的流行播散趨勢。收集CRE定植或感染患者的基礎(chǔ)流行病學(xué)資料以了解不同人群特征，包括地理分布、入院時(shí)間、預(yù)后、基礎(chǔ)條件和常規(guī)暴露（如病房、外科操作、從其他機(jī)構(gòu)轉(zhuǎn)移等）。

4.2 手衛(wèi)生

加強(qiáng)手衛(wèi)生，跟蹤手衛(wèi)生依從性。好的手衛(wèi)生依從性被認(rèn)為是所有良好感染防控項(xiàng)目，和控制包括CRE在內(nèi)的多種重要耐藥病原體傳播的基礎(chǔ)。在有關(guān)CRE的研究中，11項(xiàng)研究中6項(xiàng)將手衛(wèi)生（例如教育、依從性和執(zhí)行情況的督查）納入他們評(píng)估干預(yù)的一部分。6項(xiàng)研究中的5項(xiàng)，報(bào)告在干預(yù)后CRE顯著減少。

4.3 接觸預(yù)防

CRE可通過直接或間接接觸患者以及患者環(huán)境發(fā)生傳播。接觸預(yù)防干預(yù)措施被證明在降低CRE傳播時(shí)的有效性和實(shí)用性。國際上公認(rèn)的指南將“接觸預(yù)防”定義為：①確保恰當(dāng)?shù)幕颊甙仓?；②使用包括手套和隔離衣在內(nèi)的個(gè)人防護(hù)用品；③限制運(yùn)送和移動(dòng)患者；④使用一次性或?qū)Ｓ玫幕颊哚t(yī)療設(shè)備，盡可能避免侵襲性操作；⑤優(yōu)先清潔和消毒患者房間，個(gè)人健康護(hù)理教育。

4.4 環(huán)境清潔

使用多模式策略來實(shí)施環(huán)境清潔至關(guān)重要。包括規(guī)范制度、結(jié)構(gòu)化教育和監(jiān)測清潔方案的依從性。與環(huán)境清潔相關(guān)的“患者區(qū)域”包含患者和其臨近的周圍環(huán)境，包括患者觸碰的和直接接觸患者身體的所有器具表面，如床欄、床頭柜、床單、輸液管、便盆、尿壺和其他醫(yī)療設(shè)備。也包括患者護(hù)理期間醫(yī)務(wù)人員頻繁接觸的物體表面，如監(jiān)護(hù)儀、把手和按鈕，以及其他“高頻”接觸物表面。廁所內(nèi)和相關(guān)物品上也可能有污染。環(huán)境清潔方案中最佳清潔劑的選擇還不明確，有些研究推薦使用次氯酸鹽（常用濃度為1∶1 000）以進(jìn)行環(huán)境清潔。在某些CRE暴發(fā)流行情況下，有必要暫時(shí)關(guān)閉相應(yīng)病房并加強(qiáng)清潔。盡管患者定植和/或感染CRE時(shí)，常常可以觀察到環(huán)境中有此類耐藥病原菌的污染，但環(huán)境污染對于臨床檢出的準(zhǔn)確歸因并不清楚，除了作為醫(yī)院徹底清潔的標(biāo)志。然而，環(huán)境監(jiān)測可能是一個(gè)潛在有用的措施來評(píng)估污染水平和CRE感染患者周圍的清潔效果。有研究顯示，環(huán)境清潔干預(yù)后CRE感染率有較明顯的下降，包括斜率（即，趨勢；-0.32）和水平估計(jì)值（即，即刻的改變；-3.93）的顯著改變。

4.5 患者隔離

患者隔離是接觸預(yù)防的重要組成部分，通過單間病房（首選）或集中分類（次選）收治的方式將患者實(shí)施物理分隔，以預(yù)防患者之間的感染傳播。值得注意的是，“隔離”和“集中分類收治”在一些醫(yī)療機(jī)構(gòu)中存在術(shù)語使用不一致性。一般情況下，使用下述標(biāo)準(zhǔn)定義：①隔離，有條件的話，應(yīng)將患者安排在單間（最好有獨(dú)立衛(wèi)生間）；②集中分類收治。單間不足情況下，可選擇集中分類收治，將定植/感染同種微生物的患者歸為一組，在一個(gè)劃定的區(qū)域提供護(hù)理，防止與其他患者接觸；③隔離的目的是將定植/感染患者與非定植/非感染患者分隔開。

4.6 CRE篩查

應(yīng)以當(dāng)?shù)亓餍胁W(xué)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估為指導(dǎo)，對無癥狀CRE定植進(jìn)行監(jiān)測培養(yǎng)。這一監(jiān)測的人群應(yīng)考慮包括既往有CRE定植的患者、與CRE定植/感染患者有接觸的患者或近期在CRE流行的醫(yī)療機(jī)構(gòu)有住院史的患者。目前在醫(yī)療機(jī)構(gòu)提供的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)照護(hù)中，還缺少關(guān)于患者CRE定植的信息。但是在暴發(fā)時(shí)，或者在獲得CRE風(fēng)險(xiǎn)很高的情況下（如，有可能與CRE定植或感染的患者接觸、CRE區(qū)域性流行時(shí)），應(yīng)該要知曉CRE的定植情況。確定CRE定植的監(jiān)測培養(yǎng)，對于被篩查的患者來說，獲益不會(huì)立竿見影，但的確有助于對CRE整體的感染防控。而這類篩查患者有可能發(fā)展為CRE感染，CRE定植狀態(tài)的信息對于其經(jīng)驗(yàn)性抗生素治療計(jì)劃，具有潛在重要的有益影響。

5 結(jié)語

耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌，尤其是CRE感染已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。此類超級(jí)耐藥細(xì)菌往往伴隨著高發(fā)病率和高死亡率，臨床抗感染治療經(jīng)常面臨無藥可用的困境，疾病的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)顯著增大。面對這樣的“超級(jí)細(xì)菌”，如何科學(xué)防控是感染防控領(lǐng)域的重要命題。由于CRE等“超級(jí)細(xì)菌”不同于以往所發(fā)現(xiàn)的耐藥細(xì)菌，必要情況下，建議將其防控級(jí)別上調(diào)，如參考我國香港地方政府將社區(qū)獲得性甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌作為法定須申報(bào)傳染病的做法[16]，對CRE的防控亦提升至需法定申報(bào)防控級(jí)別并貫徹實(shí)施，這將大大推進(jìn)CRE感染防控的進(jìn)程。

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