蔡玉剛，王 文，楊劍峰

（1.瀘州市公安局 四川瀘州 646000；2.四川警察學(xué)院 四川瀘州 646000；3.宜賓市公安局 四川宜賓 644000）

顛茄[1]，產(chǎn)于我國(guó)山東、江浙、廣東等地。含多種生物堿，毒性較大，經(jīng)常有誤服或超劑量使用造成死亡的案列。顛茄植株可入藥，主要用于治療盜汗、流涎、支氣管分泌過(guò)多、胃酸過(guò)多等癥狀。顛茄中含有多種生物堿，其主要成分是莨菪堿，和少量的東莨菪堿。莨菪堿在貯藏、加工、提制過(guò)程中逐漸轉(zhuǎn)化為消旋生物堿阿托品。因此，顛茄中毒案件中對(duì)莨菪堿的快速檢驗(yàn)有著非常重要的意義。

莨菪堿[2](hyoscyamine)亦稱(chēng)天仙子堿，是一種莨菪烷型生物堿。其分子式C17H23NO3(見(jiàn)圖1)。存在于許多中草藥中，如顛茄、北洋金花和曼陀羅。熔點(diǎn)108.5℃，比旋光度（左旋）。難溶于水，可溶于沸水和三氯甲烷。

圖1 莨菪堿結(jié)構(gòu)式

莨菪堿中毒的臨床表現(xiàn)[3]：莨菪堿與阿托品的中毒臨床表現(xiàn)相似，劑量小的中毒者先出現(xiàn)口渴咽干、皮膚潮紅干燥、瞳孔擴(kuò)大、脈率與心率增速、視物模糊、體溫升高、躁動(dòng)不安、排尿困難等，伴隨語(yǔ)言不清、呼吸頻率加快、煩躁不安、譫妄等。劑量大者可有幻覺(jué)、幻聽(tīng)、抽搐等，最終由興奮轉(zhuǎn)入抑制，出現(xiàn)昏迷、呼吸麻痹而死亡。莨菪堿(hyoscyamine)進(jìn)入體內(nèi)后[4]，被人體迅速吸收，血漿中莨菪堿濃度1～2h到達(dá)最高，血漿半衰期為2.43h，在0.02mg·kg-1劑量攝入后30min和2h之間發(fā)現(xiàn)心率增加。莨菪堿血液濃度＞1471ug/kg出現(xiàn)昏迷和呼吸衰竭等急性中毒反應(yīng)。

目前，國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)上可查的提取莨菪堿的方法有超聲波提取法、離子交換樹(shù)脂法、超臨界萃取法等[5]-[12]。檢驗(yàn)方法有放射-免疫法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。莨菪堿在光照條件下會(huì)迅速消旋變?yōu)榘⑼衅?，所以檢測(cè)檢材中的莨菪堿必須速度快，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）方法檢測(cè)具有效率高，靈敏度高，檢測(cè)限低等特點(diǎn)，適用于各種生物檢材中莨菪堿的檢測(cè)。本方法汲取了超聲波提取速度快、提取率高、低溫等特點(diǎn)和氣相色譜分離效率高，質(zhì)譜靈敏度高的特點(diǎn)，為顛茄中毒案件中莨菪堿的檢驗(yàn)鑒定提供有效的方法。

一、實(shí)驗(yàn)部分

（一）儀器與試劑

1.試劑及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)品：莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品由公安部物證鑒定中心提供。試劑：三氯甲烷、無(wú)水硫酸鈉（以上試劑均為分析純）。

2.儀器和設(shè)備。安捷倫7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS）；ThermoTDZ5高速離心機(jī)；超聲波型號(hào)：濟(jì)南巴克BKA-120B；恒溫水浴鍋型號(hào)：北京永光明醫(yī)療儀器有限公司XMTD—4000。

（二）操作及實(shí)驗(yàn)條件

1.操作步驟[1]-[4]。

（1）溶液配制。配制濃度為0.1mg/mL的莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)溶液三氯甲烷工作液，低溫保存，有效期6個(gè)月；配制2ug/ml莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)三氯甲烷溶液做為質(zhì)控，室溫保存，有效期3個(gè)月；配制4ug/ml、10ug/ml、30ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml莨菪堿三氯甲烷標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作液。

（2）檢材處理[12]。平行取胃內(nèi)容兩份各2克（2ml），分別加入無(wú)水硫酸鈉適量研磨使其呈干沙狀，然后加入三氯甲烷5毫升，分別放入超聲波振蕩器(功率1000W，頻率20kHz)，超聲波攪拌20min左右濾出提取液，重復(fù)操作1次，合并兩次提取液，在10000r/min高速離心條件下離心10min，合并有機(jī)相在35℃水浴鍋上濃縮揮至近干，用100ul三氯甲烷定容，供GC/MS檢驗(yàn)。

同時(shí)取等量空白相似檢材2份，1份添加2ug/ml莨菪堿三氯甲烷標(biāo)準(zhǔn)液2ml對(duì)照品作質(zhì)量控制檢材，另一份作空白比對(duì)檢材，與檢材平行操作。

2.試驗(yàn)條件[13]。

（1）超聲波提取條件。功率1000W，選用頻率：20kHz（不加熱）色譜柱：HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30m×0.32mm×0.25um)（弱極性或者極性柱）；

柱溫：200℃(1min）10℃/min 280℃（2min）；進(jìn)樣口溫度：280℃；接口溫度：250℃；載氣：高純氦，流速1 ml/min，分流比10：1。

（2）檢測(cè)器。EI，70eV，傳輸線(xiàn)溫度250℃，離子源溫度：230℃，四級(jí)桿溫度200℃，倍增器電壓自動(dòng)調(diào)諧，掃描方式：SCAN（線(xiàn)性測(cè)試掃描方式為：SIM）掃描范圍40-450amu，掃描起始時(shí)間（溶劑延遲）3min。

（三）檢驗(yàn)

分別取0.1mg/ml莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)溶液、2.1.2的檢材提取液、空白添加提取液及空白液供氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC/MS）檢驗(yàn)，每次進(jìn)樣1ul，各進(jìn)2次。

二、結(jié)果與討論

（一）線(xiàn)性關(guān)系考察

精密配制莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度分別為：4ug/ml、10ug/ml、30ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml，分別進(jìn)行測(cè)定。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以濃度（x，ug/ml）為橫坐標(biāo)做線(xiàn)性回歸，回歸方程為：y=1.3044x-1.623；r2=0.99997.結(jié)果表明，莨菪堿在濃度4-200ug/ml范圍內(nèi)峰面積與濃度呈線(xiàn)性相關(guān)。將莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成不同濃度供氣質(zhì)聯(lián)用儀檢驗(yàn)，最低檢測(cè)濃度為2ug/ml，信噪比為3：1。

（二）回收率

取空白人血2ml，加入一定量的莨菪堿，制備成莨菪堿濃度為30ug/ml和100ug/ml的樣品，采用2.1.2方法處理后供氣質(zhì)聯(lián)用檢驗(yàn)，結(jié)果兩種濃度下莨菪堿的回收率分別為84.38%和86.59%。

（三）結(jié)果評(píng)價(jià)

檢材提取液均檢出與0.1mg/ml莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)液保留時(shí)間一致的色譜峰（檢材提取液保留時(shí)間5.609min，莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)液保留時(shí)間為5.610min，圖2），且質(zhì)譜特征離子碎片及相對(duì)豐度比與莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)液一致（莨菪堿的特征離子：m/z124、m/z82、m/z103、m/z289圖3），空白對(duì)照樣品無(wú)干擾。陽(yáng)性結(jié)果可靠。

圖2 莨菪堿色譜圖

圖3 莨菪堿質(zhì)譜圖

（四）討論

1.微波提取法的選擇。由于莨菪堿在光照條件下容易消旋成為阿托品，所以在提取過(guò)程中必須要迅速。目前，國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)上可查的提取莨菪堿的方法有超聲波提取法、離子交換樹(shù)脂法、超臨界萃取法；超聲波提取法具有速度快、操作簡(jiǎn)單、提取率高、溫度低（可以讓莨菪堿保持活性），而離子交換樹(shù)脂法和超臨界萃取法在實(shí)際案件中存在操作較為復(fù)雜，相對(duì)提取時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，故選擇超聲波提取法。

2.色譜柱的選擇。莨菪堿結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)羥基，一個(gè)羧酸根，是一類(lèi)極性較大的物質(zhì)，選用弱極性柱或者中性柱分離比較好。本文考察了DP-1MS、HP-5MS、HP-INNOWAX和XO-17MS四種色譜柱，試驗(yàn)表明HP-5MS和HP-INNOWAX兩種柱子峰形較好，無(wú)拖尾現(xiàn)象、分離效果較好。

3.溶劑的選擇。莨菪堿難溶于水，可溶于沸水和三氯甲烷。而莨菪堿極容易消旋成為阿托品；阿托品極易溶于水，易溶于乙醇，不溶于三氯甲烷，故選擇三氯甲烷可以避免誤檢為阿托品成分。

（五）案例應(yīng)用

2013年11月20日，XX市XX縣公安局接群眾報(bào)案稱(chēng)：轄區(qū)出現(xiàn)一起集體中毒事件，11人出現(xiàn)不同程度的中毒癥狀，其中三人在送醫(yī)院搶救途中死亡，剩下8人經(jīng)醫(yī)院搶救情況趨于穩(wěn)定。經(jīng)法醫(yī)解剖和病理結(jié)論，死亡的三人均系呼吸衰竭死亡，排除疾病引起窒息死亡。筆者對(duì)常規(guī)的農(nóng)藥進(jìn)行篩查均為陰性；筆者在死者胃內(nèi)容中均檢出莨菪堿成分，經(jīng)查，中毒者均為親戚，在食用了草藥?kù)业臏蟀胄r(shí)均出現(xiàn)了相同的中毒癥狀，提取了湯鍋里的草藥原體，經(jīng)鑒定為顛茄原草。最終結(jié)論為誤食顛茄中毒導(dǎo)致死亡，平息了社會(huì)的恐慌。