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      丹參總酚酸誘導PC12細胞分化機制

      2018-06-01 07:12:02趙佳奇田雅娟李欽青楚世峰賀文彬
      中國藥理學與毒理學雜志 2018年2期
      關鍵詞:培養(yǎng)箱印跡存活率

      沈 楊*,張 琦*,趙佳奇,田雅娟,李欽青,楚世峰,賀文彬

      (1.山西省中醫(yī)藥研究院,山西太原 030012;2.山西中醫(yī)藥大學中醫(yī)腦病學山西省重點實驗室&腦藏象學山西省高等學校重點實驗室,山西太原 030619;3.中國醫(yī)學科學院藥物研究所,北京 100050)

      丹參(Radix Salviae Miltiorrhizae)屬于唇形科鼠尾草屬植物,又名大紅袍、紅根赤參、血丹參等,是我國常用的中藥之一,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,性苦,微寒,歸心、肝經(jīng)[1]。研究表明,丹參具有較強的清除氧自由基抗氧化的作用[2],對于因缺糖缺氧所致的神經(jīng)元細胞損傷具有一定的保護功效[3],其延緩衰老及改善記憶的作用也得到相應實驗的證實[4]。我們的前期研究表明,脂溶性丹參酮類成分丹參總酚酸(total salvianolic acids,Tsa)可通過抑制缺血側腦區(qū)的免疫炎癥反應和免疫細胞浸潤,改善外周免疫抑制,從而減輕腦卒中后繼發(fā)性炎癥反應,提高腦卒中患者的生活質(zhì)量[5],對于調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及營養(yǎng)神經(jīng)元具有一定的意義。

      PC12細胞是目前廣泛用于研究神經(jīng)細胞分化及凋亡的細胞模型[6-7],研究藥物對PC12細胞的促分化作用是神經(jīng)藥理學中證明藥物具有神經(jīng)可塑性的有力證據(jù)。有研究表明,神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)可促進PC12細胞增殖分化[8],并且其分化作用是通過激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)蛋白所產(chǎn)生的[9]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinas,MAPK)是研究細胞分化及損傷的常涉及的信號通路,其中ERK1/2與細胞增殖分化關系最密切[10]。但是,對于具有延緩衰老及改善記憶作用的丹參及其有效成分Tsa能否影響PC12細胞的增殖和分化,及其是否與ERK1/2蛋白相關,至今未見報道。

      許多中草藥,如人參[11]、靈芝[12]和菟絲子[13]等提取物均有類NGF的作用,能促進PC12細胞分化。因此,本實驗以Tsa處理PC12細胞,探討Tsa對PC12細胞的影響及其作用機制。

      1 材料與方法

      1.1 藥物、細胞株、試劑和主要儀器

      Tsa由中國醫(yī)學科學院藥物研究所提供;未分化的PC12細胞由中國醫(yī)學科學院藥物研究所陳乃宏教授惠贈;DMEM與N2培養(yǎng)基購自于美國Gib?co;NGF(蘇肽生,舒泰神北京生物制藥公司);馬血清、胎牛血清(Hyclone,美國);胰蛋白酶(武漢博士德公司);兔抗鼠微管相關蛋白質(zhì)2(microtubuleassociated protein2,MAP-2)多克隆抗體(Protein?tech,武漢三鷹);兔抗鼠ERK1/2、磷酸化ERK1/2(phosphorylated ERK1/2,p-ERK1/2)、兔抗鼠MAPK激酶1/2(MEK1/2)和p-MEK1/2單克隆抗體(Cell Signaling,美國);羊抗兔IgG二抗(武漢博士德);ECL Western蛋白印跡化學發(fā)光檢測試劑盒、免疫印跡檢測試劑盒(江蘇康維公司);U0126(Sigma,美國),其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

      Cytation5細胞成像微孔板檢測儀(BioTek,美國);CKX31SF、IX73顯微鏡(Olympus,日本);Thermo371培養(yǎng)箱,X1R低溫高速離心機(Thermo,美國);HHS-11-6電熱恒溫水浴鍋(上海博迅)。

      1.2 PC12細胞的培養(yǎng)

      PC12細胞于DMEM高糖培養(yǎng)基(含5%胎牛血清,5%馬血清,青霉素100 U ·L-1,鏈霉素100 mg ·L-1)37℃,5%CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天更換培養(yǎng)基,待單層培養(yǎng)細胞生長至80%以上后傳代培養(yǎng)。

      1.3 MTT法檢測PC12細胞存活

      取對數(shù)生長期的PC12細胞,以5×107L-1接種于96孔板,每孔100 μL置于37℃、CO2培養(yǎng)箱。細胞貼壁后,分為4組,每組3個復孔,分別為正常對照組、Tsa 0.01,0.1和1.0 μg·L-1,按分組加藥后置于培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)中培養(yǎng),24 h后,去上清液,分別加入10 μL MTT標記液(50 g·L-1),置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后,再加入120 μL的DMSO,37℃振蕩15 min,使藍紫色甲臜充分溶解,于酶標儀測定570 nm條件下吸光度A570nm值。實驗重復3次。細胞存活率(%)=實驗組A570nm/正常對照組A570nm×100%。

      1.4 氧糖剝奪(oxygen and glucose deprivation,OGD)損傷模型的建立和分組

      取對數(shù)生長期的PC12細胞,以5×107L-1接種于96孔板,每孔100 μL實驗分為正常對照組、OGD 模型組、OGD+Tsa 0.01,0.1和1.0 μg ·L-1組。按預實驗用含Na2S2O415 mmol·L-1的無糖Earle′s液建立PC12細胞的OGD損傷模型,即每孔用PBS沖洗3次后加入200 μL的Na2S2O4無糖Earle′s液,置于培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)中培養(yǎng)2 h,即OGD損傷模型。Tsa處理組于OGD損傷2 h后加入終濃度為0.01,0.1和1.0 μg ·L-1的Tsa,作用24 h后,進行MTT實驗,檢測細胞存活率。

      1.5 顯微鏡下觀察PC12細胞分化

      為排除血清促進PC12細胞分化的影響,實驗采用無血清的N2培養(yǎng)基進行實驗。以5×107L-1細胞接種96孔板,每孔100 μL實驗分為N2培養(yǎng)基對照組、Tsa 0.01,0.1和1.0 μg·L-1組、NGF 50 μg·L-1(陽性對照)組。每2 d換液1次,加入Tsa 24 h后,分析每組細胞突起生長情況,并做統(tǒng)計分析。在顯微鏡下隨機選擇每孔的3個視野,觀察細胞突起的生長情況,若細胞出現(xiàn)1個或多個突起,即視為細胞分化。細胞分化率(%)=每視野分化細胞數(shù)/該視野總細胞數(shù)×100%。實驗重復3次。

      1.6 Western蛋白印跡檢測MAP-2,p-ERK1/2,ERK1/2,p-MEK1/2和MEK1/2蛋白表達

      收集經(jīng)Tsa或NGF處理24 h的PC12細胞,并用PBS洗滌3次,加入200 μL裂解液,冰浴30 min(每10 min混勻一次),4℃下24476×g離心30 min,收集上清,貯于-20℃?zhèn)溆?。再加入上樣緩沖液,100℃煮沸10 min后取出。樣品的蛋白定量使用BCA Protein Assay Kit(武漢博士德公司)。聚丙烯酰胺凝膠電泳,選擇與相對分子質(zhì)量相符的分離膠濃度。蛋白轉印,應用電轉印法將電泳條帶轉移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。用5%牛血清白蛋白封閉PVDF膜非特異性抗原,加一抗(兔抗鼠MAP-2多克隆抗體1∶1000,p-ERK1/2、ERK1/2單抗 1∶1000,p-MEK1/2、MEK1/2單抗1∶1000)孵育、洗滌、加二抗(羊抗兔HRP-IgG 1∶2000)、孵育、洗滌。ECL化學發(fā)光顯影:用ECL試劑盒按說明書方法進行顯影曝光。采用GelPro 31對目的蛋白條帶進行積分吸光度(integrated ab?sorbance,IA)分析。待測蛋白相對表達水平用IA目標蛋白/IA內(nèi)參蛋白比值表示。

      1.7 Western蛋白印跡檢測MEK抑制劑U0126對ERK1/2蛋白表達的影響

      將細胞組分為正常對照組,U012610 μmol· L-1組,Tsa 1.0 μg ·L-1組及U0126+Tsa組。在實驗前加入MEK抑制劑U0126,2 h后加入Tsa,收集細胞樣本,實驗步驟同1.6。

      1.8 統(tǒng)計學分析

      計量資料以±s表示,應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件,采用單因素方差分析,組間比較采用t檢驗,以P<0.05為有統(tǒng)計學顯著差異。

      2 結果

      2.1 Tsa對PC12細胞存活的影響

      MTT結果顯示(圖1),Tsa 0.01,0.1和1.0 μg·L-1作用24 h后,與正常對照組相比,Tsa 1.0 μg·L-1組PC12細胞的存活率升高90%(P<0.01),Tsa 0.01和0.1 μg·L-1組細胞的存活率與正常對照組無統(tǒng)計學差異。提示Tsa 0.01,0.1和1.0 μg ·L-1對PC12細胞均無藥物毒性,Tsa 1.0 μg·L-1可促進細胞增殖。

      Fig.1 Effect of total salvianolic acids(Tsa)on survival rate of PC12 cells.PC12 cells were treated with Tsa for 24 h.±s,n=3.**P<0.01,compared with normal control group.

      2.2 Tsa對OGD損傷的PC12細胞的修復作用

      與正常對照組相比,OGD模型組細胞存活率明顯降低(P<0.01),提示造模成功。與模型組相比,Tsa 0.1和1.0 μg ·L-1組細胞存活率分別上升至(47.7±1.8)%和(63.2±13.0)%(P<0.05,P<0.01),Tsa 0.01 μg ·L-1組細胞存活率無明顯改變(圖2)。提示Tsa 0.1和1.0 μg ·L-1對OGD損傷的PC12細胞具有修復作用。

      Fig.2 Effect of Tsa on oxygen-glucose deprivation(OGD)injured PC12 cells.OGD injured PC12 cells were cultured by using Na2S2O415 mmol·L-1in Earle′s without sugar for 2 h.Then Tsa was added and acted for 24 h,respectively.±s,n=3. **P<0.01,compared with normalcontrolgroup; #P<0.05,##P<0.01,compared with OGD model group.

      2.3 Tsa對PC12細胞分化的影響

      N2培養(yǎng)基對照組的PC12細胞無明顯突起生成。Tsa處理PC12細胞24 h后,Tsa各濃度組的PC12細胞有多個細長突起生長(>1倍胞體直徑)(P<0.01),呈現(xiàn)神經(jīng)元形態(tài)特征(圖3)。提示Tsa能促進PC12細胞分化;但該作用與NGF 50 μg·L-1陽性對照組相比相對較弱(P<0.01)。

      Fig.3 Effect of Tsa on differentiation of PC12 cells.PC12 cells in N2 medium were untreated or treated with Tsa and NGF(positive control)for 24 h respectively.±s,n=3.**P<0.01,compared with N2 medium control group;##P<0.01,compared with NGF 50 μg·L-1group.

      2.4 Tsa對PC12細胞MAP-2,p-ERK1/2,ERK1/2,MEK1/2和p-MEK1/2蛋白表達的影響

      Western蛋白印跡結果顯示(圖4),Tsa作用于PC12細胞24h后,與正常對照組相比,Tsa1.0μg·L-1組 MAP-2蛋白表達升高(P<0.01)。Tsa 0.1和1.0 μg ·L-1組的p-ERK1/2蛋白表達升高(P<0.01),但Tsa各組ERK1/2總蛋白表達無統(tǒng)計學差異。

      Tsa作用PC12細胞24 h后,與正常對照組相比,Tsa各組p-MEK1/2蛋白的表達增加(P<0.05,P<0.01),但MEK1/2總蛋白表達無統(tǒng)計學差異。

      Fig.4 Effect of Tsa on expressions of microtubuleassociated protein2(MAP-2),extracellular signal-regu?lated kinase1/2(ERK1/2),phosphorylated ERK1/2(p-ERK1/2),mitogen-activated protein kinase kinase1/2(MEK1/2)and p-MEK1/2 in PC12 cells by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.A2,B2 and C2 were the semi-quantitative results of A1,B1 and C1,respectively.±s,n=3.*P<0.05,**P<0.01,compared with normal control group.

      2.5 MEK抑制劑U0126對Tsa誘導的PC12細胞ERK1/2蛋白磷酸化的影響

      U012610 μmol·L-1作用PC12細胞1 h 后,加入Tsa 1.0 μg ·L-1作用6 h,結果顯示(圖5),與正常對照組相比,Tsa 1.0 μg ·L-1組p-ERK1/2蛋白表達明顯升高(P<0.01),U0126抑制劑組p-ERK1/2蛋白表達明顯降低(P<0.01);與Tsa 1.0 μg ·L-1組相比,Tsa 1.0 μg ·L-1+U0126組p-ERK1/2蛋白表達明顯降低(P<0.01),提示抑制劑可抑制Tsa誘導的p-ERK1/2的表達。

      Fig.5 Effect of U0126 on expressions of ERK1/2 and p-ERK1/2 induced by Tsa 1.0 μg ·L-1.PC12 cells were pretreated with U012610 μmol·L-1and then treated with Tsa 1.0 μg·L-1 for 6 h.±s,n=3.**P<0.01,compared with corresponding normal con?trol group;##P<0.01,compared with corresponding Tsa 1.0 μg ·L-1 group.

      3 討論

      本研究發(fā)現(xiàn),Tsa可促進PC12細胞的增殖,對OGD損傷細胞具有修復作用。不同濃度的Tsa均能誘導PC12細胞突起生長,Tsa處理后均能激活PC12細胞MAP-2的表達,提示Tsa具有類NGF的作用。

      有研究表明,NGF能激活Raf/MEK/ERK信號通路從而導致PC12細胞分化增殖[14]。Raf/MEK/ERK通路是MAPK通路中的一條重要分支,可被各種生長因子激活,與促進細胞分化關系密切[10,15]。Western蛋白印跡檢測結果發(fā)現(xiàn),不同濃度Tsa均可激活p-ERK1/2及其上游p-MEK1/2蛋白。加入MEK抑制劑U0126后,發(fā)現(xiàn)p-ERK1/2的表達可被抑制,提示Tsa誘導PC12細胞增殖分化的作用方式可能與NGF相似,即是通過調(diào)控ERK1/2蛋白來激活MAPK信號通路。

      然而,在本研究中,Tsa雖對PC12細胞具有促進增殖分化的作用,但其促進分化的效果弱于NGF。傳統(tǒng)中藥配伍理論認為,將性能功效相類似的藥物配合使用可增強其療效,稱這種作用為“相須”。有研究者提出,除了單方以外,單味中藥作為組成方劑的原料,其在不同方劑中所表達的藥效不同[16];也有研究發(fā)現(xiàn),Tsa與三七總皂苷配伍后,其修復缺氧缺血心肌細胞的作用有所增強[17]。推測Tsa與其他藥物相須配伍后,或可起到協(xié)同增效作用,從而在促進細胞分化作用上與NGF達到同一水平。另外,本研究未將Tsa作用于原代細胞證明其誘導細胞分化,后續(xù)研究會將2種實驗進行對比,進一步證明Tsa的促分化作用。

      綜上所述,Tsa能促進PC12細胞的增殖及分化,其作用與NGF相似。

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