鐘倩雯,朱 安,王 旗,2,3
(1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)系,北京 100191;2.國家中醫(yī)藥管理局中藥配伍減毒重點(diǎn)研究室,北京 100191;3.食品安全毒理學(xué)研究與評價北京市重點(diǎn)實驗室,北京 100191)
柴胡是傘形科植物柴胡(Bupleurum chinenseDC.)或狹葉柴胡(Bupleurum scorzonerifoliumWilld.)的干燥根,味辛、苦,微寒,歸肝、膽、肺經(jīng),具有疏散退熱,疏肝解郁,升舉陽氣之功效,是臨床常用中藥,入多種復(fù)方[1]。柴胡皂苷(saikosaponins,SS)是柴胡的主要化學(xué)成分,也是主要藥效和毒性成分[2-3]??诜S,吸收入血的成分既包括SS,也包括其腸代謝產(chǎn)物柴胡次皂苷及柴胡皂苷元[4-6]。本研究將SS及其代謝產(chǎn)物作為柴胡發(fā)揮藥效/毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究。雖然現(xiàn)已有一些SS的機(jī)制研究,但SS及代謝產(chǎn)物作用的靶點(diǎn)蛋白仍無明確定論。
反向分子對接技術(shù)是以小分子化合物為探針,在具有三維結(jié)構(gòu)的靶點(diǎn)蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分子對接,通過空間和能量匹配搜尋可能與小分子結(jié)合的蛋白,能快速、高效地預(yù)測小分子理論上的蛋白作用靶點(diǎn)[7-8]。PharmMapper是一種常用的反向分子對接服務(wù)器,在藥物靶點(diǎn)研究中應(yīng)用較多。正向分子對接通過形狀相似性進(jìn)行互補(bǔ)匹配,從而準(zhǔn)確預(yù)測蛋白和小分子化合物的結(jié)合力(結(jié)合親和性)、結(jié)合方式(構(gòu)象)和結(jié)合位點(diǎn)。Sybyl X是常用的、預(yù)測準(zhǔn)確率較高的分子對接軟件。
本文以SS及其代謝產(chǎn)物(共30個化合物)為研究對象,以PharmMapper為工具,初篩SS及其代謝產(chǎn)物的潛在靶點(diǎn)蛋白。再用Sybyl X正向分子對接法進(jìn)行預(yù)測,分析SS及其代謝產(chǎn)物與潛在靶點(diǎn)蛋白間的結(jié)合模式。并用體外實驗驗證分子對接預(yù)測的部分潛在靶點(diǎn)蛋白。
本研究使用PharmMapper對SS及代謝產(chǎn)物的潛在靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行篩選。PharmMapper預(yù)測原理為反向藥效團(tuán)匹配法,通過對TargetBank(http://59.78.96.61:8080/targetbank/tarHome.do)、DrugBank(http://www.drugbank.ca/)、Binding DB(http://www.bindingdb.org/bind/index.jsp)和PDTD(http://www.dddc.ac.cn/pdtd/)4大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行快速檢索而獲得藥物靶點(diǎn)信息[7-8]。
本研究中SS類化合物結(jié)構(gòu)均以楊秀偉[4]主編的《中藥成分的吸收、分布、代謝、排泄、毒性與藥效》為基礎(chǔ),參考文獻(xiàn)[2-3,9]繪制,共包含30個化學(xué)成分,分別為SSa,SSb1,SSb2,SSc,SSd,SSg,SSh和SSi;柴胡次皂苷A,B1,B2,B3,C1,C2,C3,D,E1,E2,E3,F(xiàn),G和H;柴胡皂苷元A,B,C,D,E,F(xiàn),G和H。
在ChemDraw 15.0中,繪制SS及代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu),再在Chem3D 8.0中依據(jù)能量最小化原則將它們轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)。將所有SS及代謝產(chǎn)物在Sybyl-X 2.0中用Tripos力場進(jìn)行能量最小化,距離作為電介質(zhì)函數(shù),電荷為Gasteiger-Hückel原子電荷,以Powell能量梯度法優(yōu)化得到最低能量構(gòu)象,最大能量優(yōu)化次數(shù)為1000,能量收斂標(biāo)準(zhǔn)為0.005 kcal·mol-1,模仿自然體系中的分子穩(wěn)定構(gòu)象[10-11],以MOL2格式上傳PharmMapper服務(wù)器。
PharmMapper服務(wù)器中最大構(gòu)象設(shè)定為50,選擇人類蛋白靶點(diǎn)庫(共2241種),其他參數(shù)采用默認(rèn)。PharmMapper將SS類化合物與其數(shù)據(jù)庫中藥效團(tuán)自動匹配并進(jìn)行打分,得到打分值(fit score)。
打分值反映了配體構(gòu)型與藥效團(tuán)模型的匹配情況,用它來篩選反向?qū)拥慕Y(jié)果,得分越高說明SS類化合物與蛋白藥效團(tuán)模型匹配程度越好,得分高的蛋白作為SS類化合物的潛在靶點(diǎn)的可能性越大。
將PharmMapper中篩選得到的潛在蛋白靶點(diǎn)晶體結(jié)構(gòu)從PDB(Protein Data Bank)數(shù)據(jù)庫下載,導(dǎo)入SybylX 2.0軟件,依據(jù)軟件使用說明[10]并參考有關(guān)的分子對接文獻(xiàn)[11-12]對蛋白進(jìn)行處理,處理包括移除所有水分子,修補(bǔ)缺少側(cè)鏈原子的氨基酸殘基,處理主鏈末端使之帶電荷,添加氫原子,設(shè)定殘基的質(zhì)子化狀態(tài)以便與配體形成氫鍵,給配體指定Amber7-FF99原子類型,給水分子加Amber7-FF99電荷,為ASN和GLN殘基中的側(cè)鏈氨基酸定位以最大化氫鍵的形成。再利用Amber7-FF99力場優(yōu)化蛋白-配體復(fù)合物。當(dāng)?shù)鞍滋幚砗弥?,從初始蛋白?fù)合物中提取配體,確定對接位點(diǎn)。再創(chuàng)建protomol文件,設(shè)定對接口袋,需要根據(jù)實際情況修改閾值參數(shù)(調(diào)整探針的深入程度)和膨脹參數(shù)(調(diào)整蛋白的孔道形狀),保存為SFXC文件。對接采用的是半柔性對接方法。將優(yōu)化的SS及代謝產(chǎn)物與已處理的蛋白用Surflex-Dock模塊進(jìn)行對接。
Surflex-Dock中對接得分(total score)是以-log10為單位的模擬結(jié)合能,能反映配體與受體的結(jié)合親合力,綜合考慮了極性作用、疏水作用、熵和溶劑化等因素[13],用對接得分來評價分子對接結(jié)果:得分值越大,配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定,越有可能存在相互作用。對接分>7分,說明SS及代謝產(chǎn)物分子與靶點(diǎn)可能存在強(qiáng)的結(jié)合,>5分說明SS及代謝產(chǎn)物分子與靶點(diǎn)可能存在較好的結(jié)合[13]。
1.6.1 試劑和儀器
HepaRG為人源正常肝細(xì)胞株(廣州吉妮歐公司)。SSa(純度為98%,上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司)由山東大學(xué)孫蓉教授惠贈。William′E培養(yǎng)基(美國Caisson公司),青霉素-鏈霉素混合液和胎牛血清(美國Gibco公司),CCK-8檢測試劑盒(美國SAB公司),GST活性試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司),細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司),超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司),酶標(biāo)儀(德國BioTek公司),臺式高速大容量冷凍離心機(jī)(美國Sigma儀器有限公司),超聲破碎儀(德國Vir Tis公司)。
1.6.2 藥物配置
SSa用DMSO配成100 mmol· L-1儲備液,用無血清William′E培養(yǎng)基配成濃度分別為0,0.03,0.06,0.13,0.25和0.50 mmol·L-1工作液。DMSO濃度不高于0.5%。
1.6.3 CCK-8法測定HepaRG細(xì)胞存活率
將100 μL細(xì)胞懸液(1×104個細(xì)胞)接種于96孔板,于37°C,5%CO2孵育24 h,倒置顯微鏡下觀察。貼壁后棄去含血清培養(yǎng)基,PBS溶液清洗。加入 100 μL 含不同濃度 SSa(0.03,0.06,0.13,0.25和0.50 mmol·L-1)的無血清培養(yǎng)基,37°C處理細(xì)胞24 h。每孔加10 μL CCK-8溶液,37°C避光孵育2 h。設(shè)置僅有培養(yǎng)基和CCK-8溶液的無細(xì)胞空白孔和0.5%DMSO的對照孔。用酶標(biāo)儀測定450 nm波長下的吸光度(A450nm),按以下公式計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(處理孔A450nm-空白孔A450nm)(/對照孔A450nm-空白孔A450nm)×100%
1.6.4 測定HepaRG細(xì)胞GST活性
CDNB是谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)的經(jīng)典底物,GST A2對CDNB的催化活性較強(qiáng)[14],GST A2的活性可以由CDNB的反應(yīng)速率部分反映。將HepaRG細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶,置于37°C,5%CO2培養(yǎng)箱。對數(shù)生長期內(nèi)細(xì)胞分別用SSa 0,0.03,0.13和0.50 mmol· L-1處理24 h,每組收集3×106個細(xì)胞,冰浴超聲(300 W,超聲3 s,冷卻7 s,共3 min)破碎細(xì)胞,8000×g,4℃離心10 min后,取上清20 μL接種于96孔板待測。按照GST活性檢測試劑盒的要求在340 nm波長下檢測樣品。
GST酶活性單位定義為在25℃,每1×104個細(xì)胞每分鐘催化1nmol·L-1CDNB與GSH結(jié)合為1個酶活性單位。計算方法如下:GST(nmol·min-1在 1×104細(xì)胞中)=(A2-A1)÷ε÷d×109nmol×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T=460×(A2-A1)÷細(xì)胞數(shù)量。式中,ε:產(chǎn)物摩爾消光系數(shù),9.6×103L ·mol-1·cm-1;d:96 孔板光徑,0.5 cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,220 μL;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20 μL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,5 min。
1.6.5 統(tǒng)計學(xué)分析
采用SPSS 20.0(IBM)軟件中的Probit回歸方法計算HepaRG細(xì)胞活度的IC50。單因素方差分析(ANOVA)比較組間細(xì)胞內(nèi)GST酶活性差異,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
用PharmMapper對SS及代謝產(chǎn)物的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行篩選,將SS及代謝產(chǎn)物與人類蛋白數(shù)據(jù)庫中的藥效團(tuán)模型進(jìn)行匹配,按得分高低進(jìn)行排序。將每個SS及代謝產(chǎn)物得分最高的10個潛在靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行統(tǒng)計分析,考慮到SS、柴胡次皂苷和柴胡皂苷元之間結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的相似性更大,按照SS、柴胡次皂苷和柴胡皂苷元對潛在靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分類(表1)。本研究根據(jù)此排序推測SS及其代謝產(chǎn)物的潛在靶點(diǎn)蛋白,將排名靠前的、出現(xiàn)次數(shù)較多的蛋白認(rèn)為更可能是靶點(diǎn)蛋白。
從表1可以看到,靶點(diǎn)集中于12種蛋白,分別為GST A2、膽汁酸受體、胸苷酸合成酶、細(xì)胞維甲酸結(jié)合蛋白2、雌二醇17-β-脫氫酶1、原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pim1、雌激素受體、磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)、腺苷激酶、白細(xì)胞介素、殺菌滲透性增加蛋白和乙酰膽堿酯酶。
用分子對接驗證反向分子對接獲得的潛在靶點(diǎn)蛋白,結(jié)果如表2所示,反向分子對接篩選出的潛在靶點(diǎn)蛋白的分子對接得分也很高。總體來說,2種方法的結(jié)果基本一致。
Tab.1 Potential target proteins of saikosaponins(SSs)and their metabolites with high fit score screened by PharmMapper
Tab.2 Potential targets with high total score screened by Sybyl X
從分子對接的結(jié)果來看,得分>7的潛在蛋白靶點(diǎn)包括GST A2、磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)移蛋白、腺苷激酶、胸苷酸合酶、雌激素受體、雌二醇17-β-脫氫酶;得分>5的潛在蛋白靶點(diǎn)包括原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pim1、膽汁酸受體和細(xì)胞維A酸結(jié)合蛋白。其中,SSa與GST A2之間的對接得分最高(11.4970),它們之間可能存在強(qiáng)的結(jié)合。
對預(yù)測結(jié)合親和力最強(qiáng)的SSa與GST A2之間的結(jié)合模式進(jìn)行分析。圖1和圖2分別為用Sybyl X中Surflex-Dock模塊預(yù)測的對接模式及對接表面圖。結(jié)果顯示,分子對接后,SSa處于GST A2活性口袋內(nèi),與GST A2口袋腔穴中的多處氫鍵供體和受體形成氫鍵,如Arg130,Gly313,Arg314,Lys344,Asp352,Gln353和Leu507,且SSa與GST A2的形狀和疏水性匹配良好,因而SSa和GST A2形成的復(fù)合物穩(wěn)定性較好,相應(yīng)的得分較高,很可能存在相互作用。
Fig.1 Binding model between SSa and GST A2(1AGS).Green structure is SSa,red structure is GST A2(distance from SSa within 5?),yellow line means hydrogen bonding,and blue point means the atoms in GST A2 are connected to SSa.Label:names of the atoms.such as B/GLY313H means the atom is the hydrogen atom of No.313 glycine(GLY)in the B chain of GST A2.
Fig.2 Docking surface of GST A2(1AGS)and SSa.GST A2 is shown in streamer model.The green part is the lipophilic surface,and the tubular molecule in the lipophilic surface is SSa.
圖3結(jié)果顯示,SSa處理HepaRG細(xì)胞24 h后,計算得細(xì)胞的 IC50為 0.40 mmol·L-1。SSa 0.03,0.06,0.13,0.25和0.50 mmol· L-1抑制HepaRG細(xì)胞增殖,且呈一定的量效關(guān)系(R2=0.8848,P<0.05)。
Fig.3 Effect of SSa on HepaRG cell viability after 24 h exposure.±s,n=9.
表3結(jié)果顯示,SSa 0.03,0.13和0.50 mmol·L-1處理HepaRG細(xì)胞24 h,細(xì)胞內(nèi)GST活性隨著SSa濃度的升高而升高(P<0.01),且GST活性有趨于飽和的趨勢。
Tab.3 Effect of SSa on activity of GST in HepaRG cells
柴胡具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),用計算模擬的方法來預(yù)測其潛在作用靶點(diǎn),能節(jié)省大量的人力、物力和時間,并可為后續(xù)的實驗研究提供理論基礎(chǔ),為柴胡機(jī)制研究提供新的思路。
本研究通過反向分子對接預(yù)測了SS及其代謝產(chǎn)物的潛在靶點(diǎn)蛋白,包括有GST A2、膽汁酸受體、胸苷酸合酶、細(xì)胞維A酸結(jié)合蛋白、雌二醇17-β-脫氫酶、原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pim1、雌激素受體、磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)移蛋白、腺苷激酶、白細(xì)胞介素、殺菌滲透性增加蛋白和乙酰膽堿酯酶,它們參與脂質(zhì)代謝、谷胱甘肽代謝、膽汁酸代謝等過程,可能與柴胡的保肝作用/肝毒性有關(guān)。
隨著SS代謝,預(yù)測靶點(diǎn)蛋白發(fā)生一定的變化,SS及其代謝產(chǎn)物有相同的潛在靶點(diǎn)蛋白,如膽汁酸受體、細(xì)胞維A酸結(jié)合蛋白、胸苷酸合酶和雌激素受體;也有各自特異的靶點(diǎn)蛋白,如腺苷激酶僅為柴胡皂苷的潛在靶點(diǎn)蛋白。多個潛在靶點(diǎn)蛋白及其變化初步反映了中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。
從PharmMapper和Sybyl X的對接結(jié)果來看,GST A2可能為多種SS和柴胡次皂苷的潛在靶點(diǎn)蛋白,其中又以SSa與GST A2最可能存在相互作用。對接模式和對接表面圖顯示,SSa與GST A2的形狀和疏水性匹配良好。體外實驗證明SSa影響HepaRG細(xì)胞的GST酶活性。因而,GST A2可能是SSa的靶點(diǎn)蛋白之一。
GST在肝中含量很高,是一種Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶,能催化毒物與谷胱甘肽發(fā)生結(jié)合反應(yīng),使毒物極性增強(qiáng),易于排泄,從而解毒;可清除脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的氫過氧化物和活性氧,對細(xì)胞氧化損傷有重要保護(hù)作用[15-17]。
GST的C端功能域位于第87~210位氨基酸,是底物結(jié)合域[15-17]。本研究SSa與GST A2的對接模式顯示,SSa可與GST A2的A鏈底物結(jié)合域的Arg130和B鏈底物結(jié)合域的Gly313,Arg314,Lys344,Asp352,Gln353和Leu507結(jié)合,因此推測SSa可能為GST A2底物。
本研究體外實驗的結(jié)果表明,SSa 0.03,0.13和0.50 mmol·L-1處理HepaRG細(xì)胞24 h,能不同程度地導(dǎo)致肝細(xì)胞毒性,并誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)GST活性升高。GST活性升高說明肝細(xì)胞解毒能力和抗氧化能力增強(qiáng),可能是肝細(xì)胞對SSa導(dǎo)致的毒性的適應(yīng)性反應(yīng)[18]。
GST A2是人類肝中最主要的、活性最強(qiáng)的抗氧化酶之一,對氫過氧化物有很高的反應(yīng)活性[19]?,F(xiàn)有的SS導(dǎo)致肝毒性的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),柴胡總皂苷導(dǎo)致肝毒性與引起肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)有關(guān)[20]。從本研究體外實驗的結(jié)果可見,隨著SSa濃度升高,GST活性有趨于飽和的趨勢。若GST代謝飽和,肝細(xì)胞可能會發(fā)生過氧化損傷[15]。
分子對接屬于理論性模擬研究,有時計算模擬的結(jié)果與實驗結(jié)果可能會存在一定偏差,本研究中雖采用了兩種計算模擬方法預(yù)測SS及其代謝產(chǎn)物的靶點(diǎn)蛋白,在一定程度上降低了預(yù)測的假陽性,但預(yù)測結(jié)果仍需進(jìn)一步的實驗驗證,如體內(nèi)外酶活性實驗等。本研究用體外實驗證明了SSa影響GST活性,但對其他預(yù)測的潛在靶點(diǎn)尚未進(jìn)行實驗驗證。未來研究SS及其代謝產(chǎn)物的作用機(jī)制時,可以將本研究預(yù)測的靶點(diǎn)蛋白納入考慮。
在本研究中,用反向分子對接法對SS及其代謝產(chǎn)物的潛在靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行初步篩選,用分子對接驗證了反向分子對接的結(jié)果,預(yù)測了SS及代謝產(chǎn)物的潛在靶點(diǎn)蛋白。
此外,本研究從分子層面探究了SSa與GST A2間結(jié)合模式,用體外實驗證明了SSa產(chǎn)生肝細(xì)胞毒性、影響GST活性,說明GST可能是SSa肝毒性的靶點(diǎn)蛋白之一。
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