龐士慧，鐘國(guó)瑞，謝水林，李浩健，鄒淑香，賈 英，戴仁科，黃黎珍，2

（華南理工大學(xué)1.生物科學(xué)與工程學(xué)院，2.發(fā)酵和酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006）

原代肝細(xì)胞被認(rèn)為是體外藥物代謝及藥物肝毒性研究的金標(biāo)準(zhǔn)模型。然而，目前供體肝組織來(lái)源有限，且不同供體存在差異，原代肝細(xì)胞傳代次數(shù)有限且細(xì)胞內(nèi)藥物代謝酶表達(dá)不穩(wěn)定，這些都限制了原代肝細(xì)胞的廣泛應(yīng)用。而肝源性的HepG2細(xì)胞因在體外穩(wěn)定培養(yǎng)，操作簡(jiǎn)便，成為目前應(yīng)用廣泛的藥物代謝及肝毒性體外細(xì)胞模型［1］，但HepG2細(xì)胞內(nèi)大部分藥物代謝酶基因表達(dá)水平較低或不表達(dá)［2-3］。因此，提高HepG2細(xì)胞內(nèi)多藥物代謝酶的水平并使其穩(wěn)定表達(dá)，將為藥物代謝及代謝致肝毒性研究提供較理想的細(xì)胞模型。

目前，在細(xì)胞水平介導(dǎo)藥物代謝酶高效穩(wěn)定表達(dá)研究常用的方法一般為病毒載體法（慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒等）。Xuan等［4］利用慢病毒載體系統(tǒng)結(jié)合藥物篩選，構(gòu)建了一系列單個(gè)藥物代謝酶穩(wěn)定表達(dá)的HepG2細(xì)胞系。但是慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)存在操作復(fù)雜、插入片段長(zhǎng)度有限等缺陷［5］，導(dǎo)致其在多基因穩(wěn)定表達(dá)領(lǐng)域的應(yīng)用受限。而piggy?Bac（PB）轉(zhuǎn)座子是一種高效穩(wěn)定表達(dá)體系，其在轉(zhuǎn)座酶的作用下將靶基因特異性地插入宿主基因組內(nèi)高頻“TTAA”位點(diǎn)［6］。同時(shí)，大量研究表明，PB轉(zhuǎn)座子整合位點(diǎn)偏好于基因組轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域，且不插入基因表達(dá)框內(nèi)，更有利于插入基因的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)［7-8］。此外，與病毒載體相比較，PB轉(zhuǎn)座子還具有操作簡(jiǎn)便、負(fù)載量大等優(yōu)點(diǎn)［9］，因此，PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是大片段基因或多基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的一種較理想工具。本實(shí)驗(yàn)室前期研究亦發(fā)現(xiàn)，采用PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將細(xì)胞色素P4503A4（cytochrome P4503A4，CYP3A4）基因?qū)際epG2細(xì)胞，所獲的肝細(xì)胞系中CYP3A4基因拷貝數(shù)達(dá)到每細(xì)胞（30.5±1.1）拷貝，并持續(xù)傳代培養(yǎng)＞2年仍能穩(wěn)定表達(dá)［10］。

目前，多基因穩(wěn)定共表達(dá)的策略主要有單啟動(dòng)子聯(lián)合2A串聯(lián)表達(dá)［11］和多個(gè)單基因病毒或載體共感染2種方案［12］。由此在PB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)多基因穩(wěn)定共表達(dá)研究中，通常采用多個(gè)單基因轉(zhuǎn)座子共轉(zhuǎn)染和2A介導(dǎo)多基因單轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染2種策略。Sato等［13］采用多個(gè)單基因轉(zhuǎn)座子共轉(zhuǎn)染策略將7個(gè)單基因轉(zhuǎn)座子共轉(zhuǎn)染豬胚胎成纖維細(xì)胞，經(jīng)多個(gè)藥物同時(shí)篩選后，獲得的抗性單克隆細(xì)胞中可實(shí)現(xiàn)7個(gè)基因穩(wěn)定共表達(dá)。但多種藥物篩選過(guò)程可能會(huì)加重細(xì)胞毒性及增加篩選操作的復(fù)雜性。相比之下，基于2A串聯(lián)單轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)多基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)，2A具有結(jié)構(gòu)短小、高剪切效率和上下游基因表達(dá)平衡等優(yōu)點(diǎn)，且通過(guò)多個(gè)2A串聯(lián)可方便實(shí)現(xiàn)大量基因串聯(lián)共表達(dá)。如黃惠等［14］通過(guò)采用2A介導(dǎo)單轉(zhuǎn)座子策略轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)座酶實(shí)現(xiàn)表達(dá)框2A串聯(lián)的延伸因子1α（elongation factor1α，EF1α）促發(fā)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）和嘌呤霉素（puromycin，Puro）抗性（EF1ɑ-EGFP-2A-Puro）高效轉(zhuǎn)座子，且2A可有效切割GFP-Puro融合蛋白，從而獲得GFP和Puro穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞株。應(yīng)用相似的方法，Zhang等［15］將不同亞型2A及內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)IRES分別串聯(lián)2～5個(gè)基因，構(gòu)建單啟動(dòng)子多基因共表達(dá)的轉(zhuǎn)座子，轉(zhuǎn)染小鼠細(xì)胞后各基因均穩(wěn)定共表達(dá)。表明結(jié)合轉(zhuǎn)座子負(fù)載量大及高效整合的優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用2A串聯(lián)多基因單轉(zhuǎn)座子策略亦可實(shí)現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定協(xié)調(diào)共表達(dá)。

為研究PB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)不同亞型藥物代謝酶穩(wěn)定共表達(dá)的最優(yōu)方案，本研究采用上述2種多基因共表達(dá)策略，分別構(gòu)建2種體系的多基因表達(dá)PB轉(zhuǎn)座子，一種是單啟動(dòng)子聯(lián)合2A串聯(lián)表達(dá)的轉(zhuǎn)座子，另一種為多個(gè)單基因轉(zhuǎn)座子混合物，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定篩選和多次傳代培養(yǎng)后，檢測(cè)其獲得的抗性單克隆細(xì)胞中藥物代謝酶mRNA、蛋白質(zhì)及酶活性水平，并比較分析其差異，獲得PB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)不同亞型藥物代謝酶穩(wěn)定共表達(dá)的較優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案，為建立體外藥物代謝及其肝毒性研究細(xì)胞模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

HepG2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)上海細(xì)胞庫(kù)。N端標(biāo)記EGFP質(zhì)粒（N terminal attachment of EGFP plasmid，pEGFP-N2，4.7 kb）由中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院惠贈(zèng)；2A串聯(lián)的重組CYP3A4和2C19 PB轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒（pPBCYP3A4-2A-2C19，10.2 kb）由本實(shí)驗(yàn)室先前保存；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、青霉素-鏈霉素溶液及磷酸鹽緩沖液（PBS）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine?LTX和Neon?Transfection System購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；GenJetTMIn VitroDNA Transfection（Ver.Ⅱ）購(gòu)自美國(guó)SignaGen公司；MTT（四甲基偶氮唑鹽）購(gòu)自廣州齊云生物技術(shù)有限公司；RT-PCR試劑盒和qRCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；兔抗人CYP3A4單克隆抗體、兔抗人CYP2C19單克隆抗體、兔抗人CYP2C8單克隆抗體、兔抗人β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)由PB供體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒構(gòu)成（圖1）。PB供體質(zhì)粒（圖1A，美國(guó)SBI公司）的CMV啟動(dòng)子下游存在多克隆位點(diǎn)，用于插入目的基因；EF1α啟動(dòng)子啟動(dòng)篩選標(biāo)記GFP和Puro表達(dá)。人 CYP3A4 cDNA（Gene ID：1576），CYP2C19 cDNA（Gene ID：1557），CYP2C8 cDNA（Gene ID：1558），CYP2A6 cDNA（Gene ID：1548）和OATP1B1 cDNA（Gene ID：10599）分別擴(kuò)增純化回收，經(jīng)NheI和NotI雙酶切后克隆至PB供體質(zhì)粒，獲得重組轉(zhuǎn)座子質(zhì)?！瞤PB-CYP3A4，pPBCYP2C8，pPB-CYP2A6，有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B1的PB轉(zhuǎn)座子（organic anion transporting polpeptide 1B1 PB transposon plasmid，pPB-OATP1B1）〕。輔助質(zhì)粒表達(dá)轉(zhuǎn)座酶super PB轉(zhuǎn)座酶（即pPB-轉(zhuǎn)座酶，圖1B，美國(guó)SBI公司）。

1.3 piggyBac轉(zhuǎn)座子高效轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞方法的建立

1.3.1 3種方法介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)染和細(xì)胞分組

Fig.1 PiggyBac（PB）transposon system-piggy Bac donor plasmid（A）and helper plasmid（B）.Amp：ampicillin;ITR：interted terminal repeat;CMV:cytomegalovirus;PUC Ori:PUC origin;EF1α:elongation factor 1alpha;GFP:green fluores?cent protein;Puro：puromycin;SV40:simian virus40.

Lipofectamine?LTX和GenJetTMIn VitroDNA Transfection Reagent（Ver.Ⅱ）介導(dǎo)轉(zhuǎn)染：將1×105個(gè)細(xì)胞鋪板至24孔培養(yǎng)板，24 h后細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。取1 μg質(zhì)粒（pEGFP-N2、pPB-CYP3A4-2A-2C19，分別與 2.5 μL Lipo LTX Reagent和3 μL GenJetTMReagent轉(zhuǎn)染試劑混合，進(jìn)行HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染〔詳細(xì)步驟參見(jiàn)Lipofectamine?LTX和GenJetTMIn VitroDNA Transfection Reagent（Ver.Ⅱ）Protocol〕。

Neon?Transfection System 電轉(zhuǎn)：取1 μg質(zhì)粒（pEGFP-N2或pPB-CYP3A4-2A-2C19）分別加至10 μL緩沖液R重懸的HepG2細(xì)胞懸液，混勻后轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，參數(shù)為1230 V、20 ms、3次脈沖；電轉(zhuǎn)后移至預(yù)熱的含10%胎牛血清、無(wú)抗生素DMEM培養(yǎng)基的24孔板中培養(yǎng)（詳細(xì)步驟參見(jiàn)Neon?Transfection System Protocol）。

將轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞分為6組：pEGFP-N2+GenJet組，pEGFP-N2+Lipo組，pEGFP-N2+Neon?組，pPBCYP3A4-2A-2C19+GenJet組，pPB-CYP3A4-2A-2C19+Lipo組和pPB-CYP3A4-2A-2C19+Neon?組。

1.3.2 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

3種方法分別介導(dǎo)小片段質(zhì)粒pEGFP-N2和大片段重組質(zhì)粒pPB-CYP3A4-2A-2C19轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)情況，并通過(guò)流式細(xì)胞儀（Guava easy Cyte HT system；Millipore，Bedford，MA，美國(guó)）檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率

將細(xì)胞接種于96孔板中，待匯合度達(dá)80%～90%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。設(shè)置實(shí)驗(yàn)處理組、無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組（無(wú)質(zhì)粒DNA）、陰性對(duì)照組（無(wú)任何處理細(xì)胞組）及調(diào)零組（無(wú)細(xì)胞組），各設(shè)5個(gè)復(fù)孔（n=5）。轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)細(xì)胞活性。檢測(cè)前棄舊液，每孔加入10 μL MTT 5 g ·L-1溶液，37℃、5%CO2溫箱孵育4 h后向每孔加入100 μL DMSO，37℃振蕩5 min使沉淀物溶解，選用SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices，Sunnyvale，加拿大）測(cè)定490 nm處吸光度值（A490nm）。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A490nm-調(diào)零組A490nm）（/陰性對(duì)照組A490nm-調(diào)零組A490nm）×100%。

1.4 兩種多藥物代謝酶基因轉(zhuǎn)座子策略的HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采用1.3所獲得的高效低毒轉(zhuǎn)染方法，進(jìn)行2種多基因轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染策略的比較。轉(zhuǎn)染前1 d以每孔0.6×106個(gè)細(xì)胞鋪板至6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別進(jìn)行3組細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。第一組：?jiǎn)位蜣D(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染（1.5 μg pPB-CYP3A4和0.5 μg pPB轉(zhuǎn)座酶共轉(zhuǎn)染）；第二組：2A串聯(lián)多基因轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染（1.5 μg pPB-CYP3A4-2A-2C19和0.5 μg pPB轉(zhuǎn)座酶共轉(zhuǎn)染）；第三組：多個(gè)單基因轉(zhuǎn)座子混合物共轉(zhuǎn)染（0.4 μg pPB-CYP3A4，0.4 μg pPB-CYP2C8，0.4 μg pPB-CYP2A6，0.3 μg pPBOATP1B1和0.5 μg pPB轉(zhuǎn)座酶共轉(zhuǎn)染）。

轉(zhuǎn)染48 h后，采用無(wú)限稀釋法進(jìn)行單克隆細(xì)胞的篩選。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞每皿20～30細(xì)胞接種至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿；并用含Puro 8 mg·L-1的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行藥物篩選，隔天更換培養(yǎng)基。連續(xù)加藥篩選2周后，單克隆細(xì)胞集落開(kāi)始形成。通過(guò)熒光倒置顯微鏡（日本Olypus IX71）觀察并挑取表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞克隆，進(jìn)行單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并將其傳代培養(yǎng)30次，以進(jìn)行下一步的分析檢測(cè)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)代謝酶基因mRNA水平

收集3組PB重組轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞并傳代培養(yǎng)多次的抗性單克隆細(xì)胞，均按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit說(shuō)明書(shū)提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)CYP3A4，CYP2C19，CYP2C8，CYP2A6和OATP1B1序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物見(jiàn)表1。采用SYBR Premix Ex TAqTMⅡ兩步法擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參照，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。采用Light Cycler?96（瑞士Roche）實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：2×One Step SYBR-Ex taq 10 μL，上游引物 0.8 μL，下游引物 0.8 μL，cDNA 1 μL和ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 10 s，65℃ 15 s，95℃ 1 s。反應(yīng)結(jié)束后，采用Light Cycler96 soft?ware（version 1.0.0.1240）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以各目標(biāo)基因2-ΔΔCt值表示各目標(biāo)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

Tab.1 Primer sequence for real-time quantitative PCR

1.6 Western蛋白印跡法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)代謝酶的表達(dá)

將3組PB重組轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞并傳代培養(yǎng)多次的抗性單克隆細(xì)胞棄去舊培養(yǎng)基，PBS清洗1次，RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗3次，每次10 min。分別加入相應(yīng)兔抗CYP3A4，CYP2C19和CYP2C8單克隆抗體（1∶1000），4℃過(guò)夜，TBST洗3次，每次10 min。加入兔抗β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（1∶1000），室溫孵育90 min，TBST洗3次，每次10 min。然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（1∶3000），室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。ECL顯影，觀察蛋白表達(dá)強(qiáng)度。用Image J分析軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行積分吸光度分析，以目標(biāo)蛋白條帶的積分吸光度值與對(duì)應(yīng)的β肌動(dòng)蛋白積分吸光度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 LC-MS/MS檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)代謝酶活性

將3組PB重組轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞并且傳代30次的抗性單克隆細(xì)胞以每孔2×105接種到12孔，培養(yǎng)24 h后用PBS洗滌3次，分別加入100 μmol· L-1相應(yīng)的藥物工作液放置37℃溫箱孵育1 h（睪酮檢測(cè)CYP3A4，美芬妥因檢測(cè)CYP2C19）。反應(yīng)結(jié)束后，將細(xì)胞放入-80℃急凍10～20 min終止反應(yīng)?？焖俳鈨龊髮⒘呀庖喝哭D(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，-80℃/37℃反復(fù)凍融3次，最后超聲破碎20 min，充分裂解細(xì)胞。取小部分樣品測(cè)定蛋白濃度，剩余樣品全部通過(guò)LC-MS/MS測(cè)定對(duì)應(yīng)代謝產(chǎn)物的量。將CYP3A4代謝產(chǎn)物6β-羥基睪酮、CYP2C19代謝產(chǎn)物4’-羥基美芬妥英和CYP2C8代謝產(chǎn)物N-脫乙基阿莫地喹分別經(jīng)HPLC（NANO?SPACE 1312，日本）-MS/MS（加拿大Applied Bio?systems/MDS Sciex，Concord，ON）檢測(cè)。流動(dòng)相（A）為含0.1%甲酸的乙腈-水（體積比為5∶95），有機(jī)相（B）為含0.1%甲酸的乙腈-水（體積比為95∶5）。采用正離子掃描方式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；質(zhì)譜分析反應(yīng)離子對(duì)分別為6β-羥基睪酮305.1/269.4，4’-羥基美芬妥英235.2/150.2，N-脫乙基阿莫地喹328.1/283.0和內(nèi)標(biāo)17α-羥基孕酮311.2/109.2。根據(jù)LC-MS/MS返回的數(shù)據(jù)，計(jì)算代謝產(chǎn)物的量（nmol），結(jié)合反應(yīng)時(shí)間（min）和蛋白質(zhì)總量（g）或細(xì)胞數(shù)（1×106細(xì)胞），計(jì)算代謝產(chǎn)物生成速率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，采用Origin7.5軟件作圖，以SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用最小顯著差異法（least-significant difference，LSD）檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1.1 轉(zhuǎn)染效率的比較

轉(zhuǎn)染48 h流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，介導(dǎo)pEGFP-N2轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞時(shí)，GenJetTM法獲得的轉(zhuǎn)染效率為（94.2±2.5）%，較Lipo?LTX法〔（84.1±1.3）%〕和Neon?電轉(zhuǎn)法〔（81.4±1.0）%〕高（P＜0.01）。介導(dǎo)pPB-CYP3A4-2A-2C19重組轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)，GenJetTM法轉(zhuǎn)染效率為（89.3±3.3）%，顯著高于Lipofectamine?LTX法〔（65.5±2.3）%〕和Neon?電轉(zhuǎn)法〔（18.8±4.0）%〕的轉(zhuǎn)染效率（P＜0.01）（圖2）。同時(shí)，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光表達(dá)情況也得到一致結(jié)果（圖3）。

GenJetTM法轉(zhuǎn)染大片段質(zhì)粒pPB-CYP3A4-2A-2C19（10.1 kb）和小片段質(zhì)粒pEGFP-N2（4.7 kb）至HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均可達(dá)90%左右，而Lipofectamine?LTX法和Neon?Transfection System電

2 結(jié)果

2.1 3種轉(zhuǎn)染方法介導(dǎo)HepG2細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的比較

Fig.2 Transfection efficiency of HepG2 cells with different transfection methods.N-terminal attachment of enhanced GFP plasmid（pEGFP-N2）and 2A peptide linked recom?binant PB transponase plasmid containing dual-genes encoding drug metabolzing enzyme cytochrome P4503A4 （CYP3A4）and CYP2C19（pPB-CYP3A4-2A-2C19）were transfected into HepG2 cells respectively by Lipofectamine? LTX reagent（Lipo LTX），GenJetTM（Ver.Ⅱ）reagent and Neon? Transfection System（Neon System）reagent for 48 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with GenJetTMgroup by LSD test；##P＜0.01，compared with core?sponding treatment in pPEGFP-N2 group by t test.

Fig.3 Fluorescent microscopy of HepG2 cells 48 h after transfection pEGFP-N2(A)and pPB-CYP3A4-2A-2C19(B).See Fig.2 for the treatment.BF：bright field.

轉(zhuǎn)法介導(dǎo)大質(zhì)粒pPB-CYP3A4-2A-2C19轉(zhuǎn)染時(shí)轉(zhuǎn)染效率均顯著下降（P＜0.01），且顯著低于GenJetTM法（圖2）。

2.1.2 細(xì)胞存活率的比較

MTT檢測(cè)結(jié)果表明，介導(dǎo)pEGFP-N2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞時(shí)，GenJetTM法細(xì)胞存活率顯著高于Lipofectamine?LTX法（P＜0.05），極顯著高于Neon?Transfection System法（P＜0.01）；介導(dǎo)pPB-CYP3A4-2A-2C19重組轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞時(shí)，GenJetTM法和Lipofectamine?LTX法細(xì)胞存活率無(wú)顯著差異，但均高于Neon?Transfection System法（P＜0.01）。無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組結(jié)果顯示，Neon?Transfection System轉(zhuǎn)染過(guò)程對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯毒性（P＜0.01）（圖4）。

Fig.4 Viability of HepG2 cells with different transfec?tion methods.See Fig.2 for the treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with negative control group by t test；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with GenJetTMgroup of each method by LSD test.

2.2 兩種piggyBac轉(zhuǎn)染方案介導(dǎo)藥物細(xì)胞內(nèi)代謝酶基因穩(wěn)定表達(dá)的比較

2.2.1 不同轉(zhuǎn)染方案對(duì)細(xì)胞內(nèi)代謝酶mRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中目的基因mRNA表達(dá)水平結(jié)果顯示，與野生型HepG2細(xì)胞相比，單基因轉(zhuǎn)座子組PB-CYP3A4轉(zhuǎn)染獲得的抗性單克隆細(xì)胞2號(hào)、3號(hào)和4號(hào)的CYP3A4水平均極顯著升高（P＜0.01）（圖5A）；2A串聯(lián)多基因轉(zhuǎn)座子組PB-CYP3A4-2A-2C19轉(zhuǎn)染獲得的抗性單克隆細(xì)胞19號(hào)、20號(hào)和21號(hào)的CYP3A4和CYP2C19 mRNA水平均明顯增加（P＜0.01）（圖5B）；多個(gè)單基因轉(zhuǎn)座子混合物組（PB-CYP3A4，PB-CYP2C8，PB-CYP2A6和PB-OATP1B1）共轉(zhuǎn)染獲得的抗性單克隆細(xì)胞5號(hào)、7號(hào)和8號(hào)的CYP3A4和OATP1B1 mRNA水平均顯著提高（P＜0.01），7號(hào)和8號(hào)克隆CYP2C8 mRNA水平明顯升高（P＜0.01），5號(hào)、7號(hào)和8號(hào)克隆CYP2A6 mRNA水平均未升高（圖5C）。

Fig.5 Relative expressions of drug-metabolizing enzyme genes mRNA CYP3A4，CYP2C19，CYP2A6，CYP2C8 and OATP1B1 in Puro-resistant cell clones by three piggy Bac（PB）recombinant transposons.A：single gene transposon(PB-CY3A4)transfection group；B：the 2A mediated multigene transposon(PB-CYP3A4-2A-2C19)transfection group；C：the mutiple single-gene transposon(PB-CYP3A4，PB-CYP2CB，PB-CYP2A6，PB-OATP1B1)transfection group.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with HepG2-WT of each group by t test.

2.2.2 不同轉(zhuǎn)染方案對(duì)細(xì)胞內(nèi)代謝酶蛋白表達(dá)的影響

Western蛋白印跡結(jié)果顯示，與HepG2野生型細(xì)胞相比，單基因轉(zhuǎn)座子組PB-CYP3A4轉(zhuǎn)染獲得的抗性單克隆細(xì)胞2號(hào)、3號(hào)和4號(hào)CYP3A4蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）（圖6A和6D）；2A串聯(lián)多基因轉(zhuǎn)座子組PB-CYP3A4-P2A-CYP2C19轉(zhuǎn)染獲得的抗性單克隆細(xì)胞19號(hào)、20號(hào)和21號(hào)CYP3A4蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）（圖6B1和6E），CYP2C19蛋白表達(dá)也明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）（圖6B2和6E）；多個(gè)單基因轉(zhuǎn)座子混合物組PB-CYP3A4，PB-CYP2C8，PB-CYP2A6和PB-OATP1B1共轉(zhuǎn)染獲得的抗性單克隆細(xì)胞5號(hào)、7號(hào)和8號(hào)CYP3A4蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）（圖6C1和6F），7號(hào)和8號(hào)細(xì)胞系CYP2C8蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）（圖6C2和6F）。

2.2.3 不同轉(zhuǎn)染方案中細(xì)胞內(nèi)代謝酶活性的影響

Fig.6 Protein expressions of drug-metabolizing enzyme genes CYP3A4，CYP2C19，and CYP2C8 in Puro-resis?tant cell clones by three PB recombinant transposons.

Fig.7 Metabolic rates of drug-metabolizing enzymes CYP3A4，CYP2C19 and CYP2C8 in Puro-resistant cell clones by three PB recombinant transposons.A：the single gene transposon（PB-CYP3A4）transfection group；B1 and B2：the 2A mediated multigene transposon（PB-CYP3A4-2A-2C19）transfection group；C1 and C2：the multiple single-gene transposon（PB-CYP3A4，PB-CYP2CB，PB-CYP2A6，PB-OATP1B1）transfection group.The activity of CYP3A4，CYP2C19 and CYP2C8 was showed by formation rate of 6β-hydroxytestosterone，4′-hydroxyme?phenytoin and N-desethylamodiaquine，respectively.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with HepG2-WT group by t test.

藥物代謝酶代謝活性水平驗(yàn)證結(jié)果顯示，單基因轉(zhuǎn)座子組PB-CYP3A4轉(zhuǎn)染獲得的單克隆細(xì)胞的代謝產(chǎn)物6β-羥基睪酮生成速率均高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞（P＜0.05，P＜0.01）（圖7A）；2A串聯(lián)多基因轉(zhuǎn)座子組PB-CYP3A4-2A-2C19轉(zhuǎn)染獲得的抗性單克隆細(xì)胞21號(hào)6β-羥基睪酮生成速率升高（P＜0.05）（圖7B1），而且4’-羥基美芬妥因生成速率也顯著高于HepG2-WT細(xì)胞（P＜0.05）（圖7B2）；多個(gè)單基因轉(zhuǎn)座子混合物組（PB-CYP3A4，PB-CYP2C8，PBCYP2A6，PB-OATP1B1）共轉(zhuǎn)染獲得的抗性單克隆細(xì)胞5號(hào)、7號(hào)和8號(hào)6β-羥基睪酮生成速率與HepG2-WT細(xì)胞均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖7C1），7號(hào)N-脫乙基阿莫地喹生成速率高于HepG2-WT細(xì)胞（P＜0.05）（圖7C2）。

3 討論

研究在前期成功獲得PB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的單基因CYP3A4穩(wěn)定高效表達(dá)HepG2細(xì)胞株基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探索PB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)HepG2細(xì)胞不同亞型藥物代謝酶穩(wěn)定共表達(dá)的策略。由于多個(gè)基因共表達(dá)涉及到大片段DNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染，與小片段DNA轉(zhuǎn)染相比較，DNA片段增大時(shí)轉(zhuǎn)染效率會(huì)顯著下降。因此，為了獲得較高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，本研究首先針對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行大片段DNA轉(zhuǎn)染方法的比較。選取GenJetTM，Lipofectamine?LTX和Neon?Transfection System 3種轉(zhuǎn)染方法將大小不同的質(zhì)粒pEGFP-N2（4.7 kb）和重組轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒pPB-CYP3A4-2A-2C19（10.2 kb）分別轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)顯示，GenJetTM法介導(dǎo)小片段和大片段質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)轉(zhuǎn)染效率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，分別高達(dá)（94.2±2.5）%和（89.3±3.3）%，其他2種方法介導(dǎo)大片段質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)效率均明顯下降；在細(xì)胞毒性方面，GenJetTM法毒性也較低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)選取的3種方法轉(zhuǎn)染pEGFP-N2質(zhì)粒至HepG2細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)染效率均＞80%，顯著高于隋娟等［16］利用 Lipofectamine 2000 和電穿孔轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率（分別為27.8%和51.5%）。因此，GenJetTM法可以成為PB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)不同亞型藥物代謝酶基因轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的有效方法。

為探討PB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)HepG2細(xì)胞不同亞型藥物代謝酶穩(wěn)定共表達(dá)的策略。本研究采取2A串聯(lián)多基因轉(zhuǎn)座子以及多個(gè)單基因轉(zhuǎn)座子共轉(zhuǎn)染2種策略，分別將2A串聯(lián)多基因轉(zhuǎn)座子PB-CYP3A4-2A-2C19和多個(gè)單基因轉(zhuǎn)座子混合物（PB-CYP3A4，PB-CYP2C8，PB-CYP2A6，PB-OATP1B1）轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，對(duì)2組獲得的具有抗性且表達(dá)綠色熒光的單克隆細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)水平比較。結(jié)果顯示，2A串聯(lián)多基因轉(zhuǎn)座子PB-CYP3A4-2A-2C19轉(zhuǎn)染獲得的陽(yáng)性單克隆細(xì)胞中藥物代謝酶基因CYP3A4和CYP2C19在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有顯著增加且表達(dá)水平相當(dāng)，表明2A能夠有效切割上下游功能蛋白且對(duì)特征性底物具有代謝功能。相比之下，多個(gè)單基因轉(zhuǎn)座子混合物（PB-CYP3A4，PBCYP2C8，PB-CYP2A6和PB-OATP1B1）共轉(zhuǎn)染獲得的抗性單克隆細(xì)胞中不同基因表達(dá)較隨機(jī)，且不同基因產(chǎn)生共表達(dá)時(shí)其表達(dá)水平亦不一。Kahlig等［17］通過(guò)利用多個(gè)PB轉(zhuǎn)座子共轉(zhuǎn)染體外建立鈉通道（SCN1A）細(xì)胞系時(shí)，也發(fā)現(xiàn)不同基因在蛋白表達(dá)水平不一。理論上可通過(guò)增加多種篩選標(biāo)記提高多基因共表達(dá)，但多種藥物會(huì)增加細(xì)胞毒性。如Balasubramanian等［18］研究發(fā)現(xiàn)，采用4個(gè)單基因轉(zhuǎn)座子混合物共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，進(jìn)行多個(gè)藥物篩選產(chǎn)生的細(xì)胞毒性明顯高于單一藥物篩選。因此，本研究表明2A串聯(lián)多基因轉(zhuǎn)座子的方案優(yōu)于多個(gè)單基因轉(zhuǎn)座子共轉(zhuǎn)染。

本研究中，2A串聯(lián)多基因單轉(zhuǎn)座子組陽(yáng)性單克隆細(xì)胞CYP3A4代謝產(chǎn)物生成速率（nmol· min-1·g-1蛋白，單克隆細(xì)胞20號(hào)：8.2±1.9；21號(hào)：8.3±1.8），低于單基因單轉(zhuǎn)座子組的代謝速率。與其他類(lèi)似質(zhì)粒及病毒介導(dǎo)的代謝酶轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞相比，代謝速率也較低［19］。而陽(yáng)性克隆中CYP2C19的酶活性也稍低于其他方法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞。但質(zhì)粒及病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因研究大多為單基因表達(dá)或瞬時(shí)表達(dá)。同時(shí)，與已報(bào)道原代肝細(xì)胞CYP3A4的6β-羥基睪酮生產(chǎn)速率（0.22～7280 nmol·min-1·g-1蛋白，表達(dá)不穩(wěn)定且個(gè)體差異較大）［20-21］相比較，本研究及其他方法介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的代謝酶活性水平均較低。分析原因，可能在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中尤其是多個(gè)基因穩(wěn)定共表達(dá)的細(xì)胞中，單個(gè)細(xì)胞的總蛋白數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而導(dǎo)致按照細(xì)胞總蛋白的量計(jì)算代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)速率存在一定的誤差。本實(shí)驗(yàn)前期研究也表明，用PB介導(dǎo)CYP3A4的細(xì)胞系中，藥物代謝所引起的細(xì)胞毒性敏感性顯著提高，可有效用于藥物代謝肝毒性的相關(guān)評(píng)估研究［10］。

因此，在介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)不同藥物代謝酶基因穩(wěn)定共表達(dá)研究中，轉(zhuǎn)座子高效整合及負(fù)載量大的特點(diǎn)與2A串聯(lián)的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)不同亞型藥物代謝酶在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定協(xié)調(diào)共表達(dá)，將為藥物代謝引起肝毒性的細(xì)胞水平研究及評(píng)估提供較理想的策略。

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