藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中花青苷變化規(guī)律的研究

◎ 陳小玲 ，李新生 ，2，黨 婭 ，2，3，裴金金 ，2，韓 豪 ，2，李 雯 ，劉彩芬

（1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723000；3.陜西省果業(yè)局藍(lán)莓研究所，陜西 漢中 723000）

藍(lán)莓又名越橘，杜鵑花科越橘屬植物。藍(lán)莓果風(fēng)味獨(dú)特，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值[1]。藍(lán)莓果酒因富含大量花青苷而具有很高的保健價(jià)值，深受人們關(guān)注與喜愛。但藍(lán)莓果酒的發(fā)酵過程容易造成花青苷流失，影響藍(lán)莓的營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。目前，雖然已有研究對(duì)果酒的生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化來達(dá)到改善果酒品質(zhì)的目的，但少有人以花青苷為指標(biāo)來改進(jìn)藍(lán)莓果酒發(fā)酵工藝參數(shù)。因此，本研究將以不同發(fā)酵條件為背景，探究藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中花青苷的變化規(guī)律，為藍(lán)莓酒在生產(chǎn)加工中減少花青苷的損失提供一定的思路和參考，為藍(lán)莓果酒的工藝參數(shù)優(yōu)化提供理論依據(jù)[3]。將花青苷含量這一指標(biāo)引入果酒釀造技術(shù)參數(shù)的篩選中具有一定的創(chuàng)新意義，它為藍(lán)莓果酒工藝參數(shù)優(yōu)化和品質(zhì)控制提供了技術(shù)指導(dǎo)，搭建了理論平臺(tái)，對(duì)保證藍(lán)莓品質(zhì)、提高農(nóng)產(chǎn)品附加值、豐富我國果酒市場及確保人們身體健康具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

兔眼藍(lán)莓，采于陜西省果業(yè)管理局秦巴山區(qū)藍(lán)莓研究所藍(lán)莓試驗(yàn)示范基地；安琪果酒專用酵母，安琪酵母股份有限公司；2b1酵母菌、a2酵母菌，陜西理工大學(xué)食品發(fā)酵與工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑

花青苷標(biāo)準(zhǔn)品；果膠酶，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；碳酸鈣、偏重亞硫酸鉀，天津永盛精細(xì)化工有限公司；蔗糖、瓊脂粉、蛋白胨、葡萄糖、酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；色譜純乙腈、色譜純甲醇，霍尼韋爾公司，色譜純甲酸，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；紫外分光光度計(jì)，（T6新世界）北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AUY120電子分析天平，島津公司；超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Waters公司；pH計(jì)。

1.3 藍(lán)莓果酒發(fā)酵工藝

實(shí)驗(yàn)所采用的果酒發(fā)酵工藝流程如圖1所示。

圖1 藍(lán)莓果酒發(fā)酵工藝流程圖

①樣品處理：挑選個(gè)體完好的新鮮藍(lán)莓用榨汁機(jī)進(jìn)行破碎、勻漿，使果肉破碎率達(dá)到90%以上。用紗布過濾，藍(lán)莓果汁制備樣品[4]。②酶解：加入果膠酶，將果汁置于60 ℃恒溫水浴鍋中2 h。③成分調(diào)整：以 蔗糖溶解調(diào)整果汁總糖，再用CaC03溶液調(diào)pH；加入0.01 g/L偏重亞硫酸鉀。④前發(fā)酵：從安琪葡萄酒干 酵母、釀酒酵母2b1釀酒酵母a2中挑選適合藍(lán)莓果汁發(fā)酵的酵母，加入不同實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行發(fā)酵，持續(xù)發(fā)酵約10 d左右。⑤后發(fā)酵：控制樣品在相同條件下繼續(xù)發(fā)酵， 時(shí)間20 d左右。

1.4 花青苷含量測(cè)定方法

分別取不同時(shí)期不同實(shí)驗(yàn)組的果酒樣品1 mL于離心管中，加入80%的乙醇溶液定容至10 mL，浸提6 h，4 000 r/min，20 ℃下離心10 min，后取上清液加入比色管中，用紫外分光光度計(jì)在530 nm處測(cè)出每個(gè)樣品中花青苷的吸光值，每組數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)3次，取平均值，繪制時(shí)間-花青苷吸光值曲線圖，得出藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中花青苷含量的變化規(guī)律[5]。

1.5 藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中花青苷含量變化規(guī)律

1.5.1 不同酵母菌對(duì)花青苷含量變化規(guī)律的影響

分別將a2酵母菌和2b1酵母菌、分離純化3次以上，并將其活化擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，之后分別接種到相同的藍(lán)莓果汁中，每隔兩天測(cè)1次發(fā)酵液中花青苷的吸光值，記錄數(shù)據(jù)，得出發(fā)酵過程中對(duì)花青苷含量影響最小的酵母菌種，并將該酵母菌作為最優(yōu)酵母，在之后的實(shí)驗(yàn)中均接種此酵母。

1.5.2 不同溫度對(duì)花青苷含量變化規(guī)律的影響

取200 mL新鮮藍(lán)莓汁于錐形瓶中，調(diào)整糖度為25°Bx，用CaC03調(diào)pH為3.3，加入0.01 g/L偏重亞硫酸鉀，接入5%的最優(yōu)酵母，分別控制發(fā)酵溫度在22、24、26、28、30 ℃，持續(xù)發(fā)酵l5 d，發(fā)酵過程中每隔兩天測(cè)1次發(fā)酵液中花青苷的吸光值。

1.5.3 不同初始糖度對(duì)花青苷含量變化規(guī)律的影響

取200 mL新鮮藍(lán)莓汁于錐形瓶中，分別調(diào)整起始糖度含量分別為21、23、25、27、29°Bx，調(diào)pH為3.3，加入0.01 g/L偏重亞硫酸鐘，接入5%的最優(yōu)酵母，控制發(fā)酵溫度26 ℃，持續(xù)發(fā)酵15 d，發(fā)酵過程中每隔兩天測(cè)1次發(fā)酵液中花青苷的吸光值。

1.5.4 不同酵母添加量對(duì)花青苷含量變化規(guī)律的影響

取200 mL新鮮藍(lán)莓汁于錐形瓶中，調(diào)整糖分在25°Bx，用0.3%的果膠酶在60 ℃下酶解30 min，再用CaC03調(diào)pH為3.3，加入0.01 g/L偏重亞硫酸鉀，分別接入1%、3%、5%、7%、9%的最優(yōu)酵母持續(xù)發(fā)酵15 d，發(fā)酵過程中每隔兩天測(cè)1次發(fā)酵液中花青苷的吸光值。

1.5.5 不同果膠酶濃度對(duì)花青苷含量變化規(guī)律的影響

取200 mL新鮮藍(lán)莓汁于錐形瓶中，調(diào)整糖分在25°Bx，分別加入0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的果膠酶，于60 ℃下水浴加熱30 min，接入量為5%的最優(yōu)酵母，用CaC03調(diào)pH為3.3，控制發(fā)酵溫度26 ℃，持續(xù)發(fā)酵15 d，發(fā)酵過程中每隔兩天測(cè)1次發(fā)酵液中花青苷的吸光值[6]。

1.5.6 不同初始pH對(duì)花青苷含量變化規(guī)律的影響

取200 mL新鮮藍(lán)莓汁于錐形瓶中，調(diào)整糖度為25°Bx，用0.3%的果膠酶在60 ℃下酶解60 min，再加入0.01 g/L偏重亞硫酸鐘，用CaC03分別調(diào)整pH為3.1、3.3、3.5、3.7、4.9。接入5%的最優(yōu)酵母，在26 ℃下連續(xù)發(fā)酵15 d。發(fā)酵過程中每隔兩天測(cè)1次發(fā)酵液中花青苷的吸光值。

1.6 藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中花青苷種類的變化規(guī)律

采用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定藍(lán)莓果酒中花青苷的種類[7]。

1.6.1 質(zhì)譜方法的建立

離子源，電噴霧離子源（ESI）；檢測(cè)模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；掃描方式，正離子掃描；脫溶劑氣流量，800 L/h；錐孔氣流量，50 L/h；毛細(xì)管電壓，3 kV；離子源溫度，110 ℃；脫溶劑氣溫度，400 ℃[8]。

1.6.2 色譜條件

色譜柱，ACQUITYUPLC HSS C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流速 0.3 mL/min；柱溫 40 ℃；進(jìn)樣量 10 μL。流動(dòng)相A為乙腈，B為0.6%甲酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫參數(shù)見表1。

表1 超高效液相色譜條件表

1.6.3 樣品的制備

果汁樣：取100 mL新鮮藍(lán)莓汁于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，35 ℃下蒸發(fā)至水分揮干，4 000 r/min，離心5 min后倒出上清液，再用6%甲酸溶液定容至100 mL容量瓶中，取2 mL樣品用微孔過濾膜（黃色）過濾后放在小瓶子里，進(jìn)樣測(cè)定。

果酒樣：分別取不同時(shí)期的果酒100 mL于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，揮干酒精和水分，4 000 r/min，離心5 min后倒出上清液，再6%甲酸溶液定容至100 mL容量瓶中，取2 mL樣品用微孔過濾膜（黃色）過濾后放在小瓶子里，進(jìn)樣測(cè)定，與對(duì)照組進(jìn)行比對(duì)，分析討論藍(lán)莓果汁在發(fā)酵過程中花青苷種類的變化，得出結(jié)論。

2 結(jié)果與討論

2.1 藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中花青苷含量的變化規(guī)律

2.1.1 不同酵母種類下花青苷含量的變化規(guī)律

由圖2可知，3個(gè)菌種發(fā)酵的藍(lán)莓果酒中花青苷含量都呈下降趨勢(shì)，其中a2酵母菌的穩(wěn)定性比2b1和安琪的好，對(duì)果酒發(fā)酵過程中花青苷的影響較小，且有利于發(fā)酵后期花青苷的保留，所以a2酵母菌確定為藍(lán)莓果酒發(fā)酵最適酵母菌，之后進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)均接種該酵母。

圖2 不同酵母種類下花青苷含量的變化規(guī)律圖

2.1.2 不同溫度下花青苷含量變化規(guī)律

溫度是影響酵母生長、繁殖與發(fā)酵的主要環(huán)境因素，酵母只能在一定的溫度范圍內(nèi)才能生長并起發(fā)酵作用[9]。如圖3所示，5個(gè)溫度梯度下，花青苷的含量都呈下降趨勢(shì)，第8～12 d時(shí)，5個(gè)溫度梯度樣品中花青苷含量都大幅下降。24 ℃時(shí)花青苷的下降趨勢(shì)緩慢且最終保留量高于其他幾個(gè)溫度梯度，為最適發(fā)酵溫度；30 ℃下花青苷含量下降最快，可能是由于溫度越高，花青苷越不穩(wěn)定，越容易分解，導(dǎo)致花青苷損失。

圖3 不同溫度對(duì)花青苷變化規(guī)律的影響圖

2.1.3 不同初始糖度下花青苷含量變化規(guī)律

糖是酵母菌生長繁殖的能量來源，起始糖度對(duì)果酒發(fā)酵產(chǎn)生重要的影響。從圖4可以看出，糖度對(duì)花青苷的影響程度較小，5個(gè)不同糖度梯度樣品花青苷變化曲線的離散程度較小，變化規(guī)律幾乎一致且都呈下降趨勢(shì)，第8 d后花青苷的含量下降加快。初始糖度過大反而抑制了酵母的生長和發(fā)酵，發(fā)酵緩慢導(dǎo)致產(chǎn)生酒精較慢，而適當(dāng)?shù)奶嵌确炊梢约涌炀凭漠a(chǎn)生，有利于更多花青苷的溶解，25°Bx下花青苷的保留率大于其他，為最適糖度。

圖4 不同糖度對(duì)花青苷變化規(guī)律的影響圖

2.1.4 不同酵母添加量下花青苷含量變化規(guī)律

菌種是保證發(fā)酵順利進(jìn)行的重要保證，如圖5所示，添加9%的酵母，在發(fā)酵的前4 d，由于發(fā)酵產(chǎn)生酒精，所以花青苷的含量較多，但第4 d后，花青苷的含量急劇減少，且最終保留率低，可能是因?yàn)榻臃N量過大，導(dǎo)致酵母細(xì)胞繁殖過快，消耗大量糖分，不利于酒精的積累；而接種量過小，如添加1%的酵母，則導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間延長，前期花青苷含量不高，后期含量趨于穩(wěn)定，且總體呈下降趨勢(shì)。從圖5中看出，5%的酵母是最適添加量。

圖5 不同酵母量對(duì)花青苷變化規(guī)律的影響圖

2.1.5 不同果膠酶濃度下花青苷含量變化規(guī)律

藍(lán)莓中含有豐富的果膠物質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致澄清困難、出汁率低等問題。試驗(yàn)表明，果膠酶的添加量對(duì)藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中花青苷含量的影響幾乎成正比，在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，果膠酶添加量越多則溶出的花青苷越多。但整個(gè)過程花青苷含量依然呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。如圖6所示，在發(fā)酵第2～6 d有小幅度的上升，可能是因?yàn)槊附馐垢嗟幕ㄇ嘬杖艹?，酶添加量越多，花青苷溶出越多，考慮到成本問題，選擇0.5%為最適加酶量。

圖6 不同果膠酶濃度對(duì)花青苷變化規(guī)律的影響圖

2.1.6 不同初始pH下花青苷含量變化規(guī)律

在適宜微酸性環(huán)境下，酵母菌生長、繁殖和發(fā)酵都很迅速，且花青苷在pH 2～4是最穩(wěn)定的[10]，如圖7所示，pH越高，越不利于花青苷的保留，pH 3.3時(shí)，花青苷保留率相對(duì)較高，但總體仍呈下降趨勢(shì)，隨著微生物對(duì)發(fā)酵液的降解，發(fā)酵液的pH會(huì)發(fā)生變化，在第8～14 d時(shí)，花青苷含量大幅下降。

圖7 不同pH對(duì)花青苷變化規(guī)律的影響圖

2.2 藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中花青苷種類的變化規(guī)律

通過超高效液相色譜柱對(duì)初始藍(lán)莓汁樣品進(jìn)行分離，并用PDA檢測(cè)器在530 nm處進(jìn)行測(cè)定，色譜圖中主要的峰有11個(gè)，可得藍(lán)莓中主要的花青苷類物質(zhì)為11種，其中保留時(shí)間分別為：2.58、2.85、3.10、3.41、3.52、3.65、3.79、4.05、4.38、4.61、4.93 min。如圖8 所示。

圖8 超高效液相色譜圖

通過UPLC/MS-MS對(duì)藍(lán)莓果酒樣品進(jìn)行全掃描，并用PDA檢測(cè)器在530 nm處進(jìn)行測(cè)定，可得藍(lán)莓中主要花青苷類物質(zhì)有11種，其中保留時(shí)間分別為：2.63、2.87、3.13、3.44、3.55、3.69、3.81、4.09、4.41、4.69、4.96 min。將色譜圖和質(zhì)譜全掃描圖譜對(duì)比可初步鑒定藍(lán)莓果酒中也有11種花青苷類化合物，如圖9所示。因此，在藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中花青苷種類基本不變。

圖9 UPLC/MS-MS全掃描圖

3 結(jié)論

在藍(lán)莓果酒發(fā)酵前20 d里，花青苷的變化規(guī)律如下：藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中花青苷的種類基本不變，含量總體呈下降趨勢(shì)；在發(fā)酵第2～6 d，花青苷含量略有上升，可能是發(fā)酵產(chǎn)生的酒精對(duì)花青苷進(jìn)一步的溶解，之后花青苷含量則一直呈下降趨勢(shì)，其中第8～12 d下降速度最快。在不同的發(fā)酵工藝中，對(duì)花青苷含量變化規(guī)律影響程度大小順序?yàn)椋簻囟龋竟z酶濃度＞酵母添加量＞pH＞初始糖度。其中，在溫度為26 ℃、pH 3.3、酵母添加量為5%時(shí)，花青苷的保留率較高，為最適發(fā)酵條件；果膠酶的濃度對(duì)花青苷的影響幾乎成正比，考慮成本問題，則選取濃度為0.5%，更有利于花青苷的保留；糖度過大或者過小都不利于酒精積累，從而降低花青苷的溶解，其中25°Bx為最適條件。

[1]李 丹.中國藍(lán)莓業(yè)的現(xiàn)狀及出口前景探析[D].大連：東北財(cái)經(jīng)大學(xué)，2011.

[2]丁原春，范文廣，韓 雙，等.不同發(fā)酵工藝對(duì)藍(lán)莓酒中花青素含量的影響[J].保鮮與加工，2014，14（6）：47-50.

[3]莊惠婷.發(fā)酵石榴酒及其抗氧化性研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[4]柳曉晨，張秀玲，李賽男，等.藍(lán)莓類冰酒發(fā)酵工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2015，36（5）：144-148，155.

[5]黨 婭.藍(lán)莓花青苷提取及組分分析研究[J].中國調(diào)味品，2015，40（5）：76-81.

[6]葉萬軍.野生藍(lán)莓混濁型果汁穩(wěn)定性的研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.

[7]韓 豪，江 海，張志健，等.超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)定性分析黑豆皮中花青苷類物質(zhì)[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40（8）：194-200.

[8]韓 豪，李新生，江 海，等.UPLCMS/MS定性分析黑米中花青苷類物質(zhì)[J].食品工業(yè)科技，2014，35（17）：289-293，297.

[9]燕 嬌.酸漿果酒釀造工藝研究[D].晉中：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[10]蓋禹含，張東升，李亞東，等.藍(lán)莓酒釀造酵母的篩選研究[J].食品科技，2010，35（6）：50-53.