紅火炬郁金種球的抗寒生理及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的低溫保護(hù)效果

劉建新， 丁華僑， 徐笑寒

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究開(kāi)發(fā)中心，浙江杭州 311202)

紅火炬郁金(Curcumahybrida‘Red Torch’)是國(guó)內(nèi)花卉市場(chǎng)近年出現(xiàn)的球根花卉新品種[1]，與姜荷花同屬于姜黃屬(CurcumaLinnaeus)植物[2]，可作盆花、切花及園林花境應(yīng)用，具體株型如圖1-A所示，穗狀花序，苞片闊卵形蓮座狀排列，苞片深紅色。整個(gè)花期從7月中上旬至10月底，株高46～50 cm，全花長(zhǎng)33～39 cm，花序長(zhǎng)20 cm左右(全花長(zhǎng)去掉花莖、花梗以外的長(zhǎng)度)，花序?qū)?.0～7.5 cm，目前已在廣東、浙江、山東等地得到應(yīng)用。除劉建新等對(duì)其切花保鮮[3]、花莖延長(zhǎng)[1]做過(guò)研究外，尚無(wú)其他相關(guān)報(bào)道。紅火炬郁金是一種熱帶花卉，種球需要較高的溫度才能順利越冬，溫度較低則會(huì)導(dǎo)致種球凍壞。在我國(guó)的絕大部分地區(qū)，種球都無(wú)法自然越冬，因此有必要使用抗寒相關(guān)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑來(lái)提升種球的抗寒能力。脫落酸(abscisic acid，ABA)是抗寒基因表達(dá)的信號(hào)分子，對(duì)植物抗寒力的調(diào)控起重要作用，能提高植物的抗逆性[4-6]。水楊酸(salicylic acid，SA)是一種植物內(nèi)源信號(hào)物質(zhì)和植物激素，能抑制氣孔開(kāi)放，從而使葉片具有抗蒸騰的作用，進(jìn)而減少植物的水分蒸騰，提高植物的抗逆性[7-8]；多效唑(paclobutrazol，PP333)是一種高效、低毒的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可以抑制細(xì)胞縱向生長(zhǎng)、縮短莖節(jié)、降低株高、改善植物群體結(jié)構(gòu)、提高作物抗寒性、耐旱性和光合活性等[9-10]；6-BA(6-benzylaminopurine)的主要生理效應(yīng)除促進(jìn)細(xì)胞分裂、促進(jìn)芽的分化、促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)大、延緩葉片衰老等外[11]，也可提高植物的抗逆性[8]。如 0.5 mg/L 6-BA誘導(dǎo)香根草能提高香根草的抗寒性，使得香根草能在低溫下生長(zhǎng)良好[12]。油菜素內(nèi)酯(brassinolide，BR)浸種能增強(qiáng)花生對(duì)低溫的忍耐能力[13-14]。

本試驗(yàn)研究紅火炬郁金種球的抗寒生理，明確種球的所能耐受的低溫，并嘗試采用各種具有抗寒潛力的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理種球，以期找出能提升紅火炬郁金種球抗寒性的方法，為國(guó)內(nèi)的紅火炬郁金種球生產(chǎn)提供支持，促進(jìn)紅火炬郁金的推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用筆者所在單位生產(chǎn)的紅火炬郁金的成熟種球(圖1-B，上部為球莖，萌芽部位，為本試驗(yàn)的材料。下部多個(gè)橢圓形球?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)球，僅用于貯存營(yíng)養(yǎng))，該種球大小一致、無(wú)病蟲(chóng)害及外傷。取樣時(shí)，從種球的中間位置縱切開(kāi)，從中切取完整小片(包含外中內(nèi)各層組織，確保取樣代表性)。丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過(guò)氧化物酶(POD)活性、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性、脯氨酸含量、可溶性糖含量、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定用試劑盒均由蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供。相關(guān)試驗(yàn)皆于2016年在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究開(kāi)發(fā)中心完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同低溫脅迫對(duì)紅火炬郁金種球的生理生化指標(biāo)的影響 將紅火炬郁金種球分別置于24(常溫，對(duì)照組)、9、5、1、-3 ℃下48 h，然后取出存放于超低溫冰箱備用。

1.2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理對(duì)紅火炬郁金種球的生理生化影響 將紅火炬郁金種球用不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑分別浸泡處理24 h，再轉(zhuǎn)入1 ℃環(huán)境中冷脅迫48 h，然后取出存放于-80 ℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑包括 1 mg/L 脫落酸、11 mg/L(或 80 μmol/L)水楊酸、0.01 mg/L油菜素內(nèi)酯、0.08 mg/L 6-BA、100 mg/L多效唑等。另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(PCK)：清水浸泡24 h后，1 ℃環(huán)境中冷脅迫48 h，凍存?zhèn)溆?；陰性?duì)照(NCK)：水浸泡24 h后，常溫處理48 h，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 生理生化指標(biāo)檢測(cè) 相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定采用電導(dǎo)儀直接測(cè)定沸水加熱前后的電導(dǎo)率，然后再計(jì)算出相對(duì)電導(dǎo)率。束縛水含量的測(cè)定采用阿貝折光儀法[15]。用折光儀測(cè)定經(jīng)蔗糖透析前后的濃度，再計(jì)算出束縛水的含量。MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性、脯氨酸含量、可溶性糖含量、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行。所有測(cè)定重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

相關(guān)數(shù)據(jù)以Excel 2007軟件分析并生成圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同低溫脅迫下紅火炬郁金種球的生理生化變化

2.1.1 低溫脅迫下細(xì)胞受損程度分析 植物受到低溫危害時(shí)，細(xì)胞膜系統(tǒng)最先受到影響，細(xì)胞的質(zhì)膜透性增大，電解質(zhì)會(huì)有不同程度的外滲，導(dǎo)致電導(dǎo)率會(huì)有不同程度的增大[16]。膜透性的大小反映了細(xì)胞膜受損的程度，相對(duì)電導(dǎo)率與膜受傷害程度呈正相關(guān)，電導(dǎo)率越高說(shuō)明細(xì)胞膜受到的傷害越大[17]；束縛水是指在植物體內(nèi)和原生質(zhì)膠體緊密結(jié)合的水分，不易結(jié)冰和蒸騰，與植物的抗性有密切關(guān)系，束縛水含量相對(duì)增加可以增強(qiáng)植物的抗寒能力[18-19]。植物器官在逆境條件下往往發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，膜脂過(guò)氧化過(guò)程發(fā)生伴隨著MDA含量的增加，而MDA會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷生物膜。通常用MDA含量作膜脂過(guò)氧化指標(biāo)，表示細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度及對(duì)逆境反應(yīng)的劇烈程度[20]。本研究對(duì)低溫脅迫下細(xì)胞受損的3個(gè)指標(biāo)特征進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。圖2-A中紅火炬郁金種球在24 ℃時(shí)的相對(duì)電導(dǎo)率是最低的，而在9 ℃時(shí)電導(dǎo)率顯著升高，說(shuō)明種球此時(shí)已處于受低溫脅迫的狀態(tài)了，其后的5、1、-3 ℃大致相近，此時(shí)細(xì)胞膜受損較嚴(yán)重。圖 2-B所示，對(duì)照組(24 ℃)的束縛水含量是最高的。除對(duì)照組外，束縛水含量隨著溫度的降低(9 ℃降至1 ℃)而逐漸升高，在 -3 ℃ 時(shí)再降低。圖2-C顯示，低溫脅迫處理后(9 ℃降至1 ℃時(shí))，MDA含量變化并不明顯，而在-3 ℃時(shí)顯著增高，此時(shí)的細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度最高，受損最嚴(yán)重。結(jié)合這3個(gè)指標(biāo)可知，低溫脅迫條件下，種球在9 ℃環(huán)境下已經(jīng)處于逆境脅迫狀態(tài)了，1 ℃時(shí)束縛水含量增加得最為明顯，-3 ℃時(shí)膜脂氧化最嚴(yán)重。

2.1.3 低溫脅迫下細(xì)胞浸透調(diào)節(jié)系統(tǒng)變化 植物細(xì)胞遭受到傷害時(shí)，必須通過(guò)滲透調(diào)節(jié)保證一定的膨壓來(lái)維持正常的生理功能[24]。大多數(shù)植物遭受環(huán)境低溫脅迫時(shí)均在體內(nèi)積累脯氨酸、可溶性蛋白及可溶性糖等物質(zhì)[25]，這些物質(zhì)能有效降低細(xì)胞液的滲透勢(shì)，防止細(xì)胞過(guò)度失水，有利于提高植物抗寒性[26]。低溫脅迫時(shí)，脯氨酸能維持細(xì)胞水勢(shì)，促進(jìn)蛋白質(zhì)的水合作用，并能維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、物質(zhì)運(yùn)輸和滲透調(diào)節(jié)等[23-27]；可溶性糖可以提高細(xì)胞液濃度，降低水勢(shì)，增加保水能力，具有冰凍保護(hù)劑的作用[23]?？扇苄缘鞍子休^強(qiáng)的親水性，可束縛更多的水分，減少原生質(zhì)內(nèi)結(jié)冰而傷害致死的概率[27-29]。如圖4-A所示，低溫脅迫狀態(tài)下，脯氨酸的含量先增加后降低，5 ℃時(shí)最高，其余各低溫處理都較對(duì)照組(24 ℃)低；圖4-B所示，低溫脅迫下，各處理的可溶性糖含量在5 ℃時(shí)升到最高狀態(tài)，然后再降低；圖4-C所示，9 ℃低溫時(shí)開(kāi)始發(fā)生脅迫，可溶性蛋白質(zhì)的含量達(dá)到最高狀態(tài)，然后逐漸降低，在-3 ℃時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)。

2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理對(duì)紅火炬郁金種球抗寒性的影響

從圖5-A中可以看出，清水浸泡24 h后，常溫處理48 h的陰性對(duì)照(NCK)相對(duì)電導(dǎo)率最低，而同樣清水浸泡后1 ℃低溫處理48 h的陽(yáng)性對(duì)照(PCK)的相對(duì)電導(dǎo)率最高，其他各植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的相對(duì)電導(dǎo)率都介于這兩者之間，都比PCK低，說(shuō)明這些植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理對(duì)細(xì)胞膜都有一定的保護(hù)作用，其中以SA和BR的相對(duì)電導(dǎo)率較高，保護(hù)效果相對(duì)較差，6-BA處理的最低，保護(hù)效果最好，ABA次之。圖5-B 所示，各植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理后的束縛水含量基本上都處于NCK和PCK之間，BR和6-BA處理的含量較低，與PCK較為接近；ABA和PP333的束縛水含量較高，效果較好。圖5-C所示，各植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的MDA含量依次是SA>PP333>ABA>BR>6-BA，說(shuō)明SA處理的膜脂氧化程度最高，6-BA處理的膜脂氧化程度最低。綜上所述，各植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑都能一定程度上緩解低溫脅迫帶來(lái)的傷害。

2.3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理對(duì)低溫脅迫下抗氧化酶系統(tǒng)的影響

如圖6-A所示，除PP333外，各處理的SOD活性都介于NCK和PCK之間，從高到低依次是ABA>SA>BR>6-BA>PP333，ABA處理的效果最好，PP333處理的最差；圖6-B所示，各處理的CAT活性從高到低依次是BR>ABA>6-BA>PP333>SA，BR、ABA和6-BA處理的效果較好，而PP333和SA處理的CAT活性大致接近，但都比PCK活性弱；圖6-C所示，各處理的POD活性都介于NCK和PCK之間，從高到低依次是SA>PP333>BR>6-BA>ABA。可見(jiàn)，各處理植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在低溫脅迫狀態(tài)下促進(jìn)生成的抗氧化酶種類各有所側(cè)重，如ABA處理，以促進(jìn)SOD和CAT為主；SA處理以促進(jìn)SOD和POD為主；BR處理以促進(jìn)CAT和POD為主；6-BA 處理以POD為主；PP333處理以POD為主，對(duì)SOD和CAT則產(chǎn)生明顯的抑制作用。

2.4 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理對(duì)低溫脅迫下細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)變化

如圖7-A所示，各植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的脯氨酸含量出現(xiàn)了分化，SA和ABA處理的PRO含量明顯超出了PCK處理，其余的BR、6-BA和PP333處理的PRO含量都有不同程度的降低。圖7-B所示，各處理的可溶性糖含量也出現(xiàn)了分化，SA處理的含量是最高的，BR處理的反而降低了。圖 7-C 所示，各處理的可溶性蛋白質(zhì)含量都比PCK對(duì)照明顯增加，增加較明顯的是ABA和6-BA處理。可見(jiàn)，各處理植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在低溫脅迫狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)各有所側(cè)重，SA和ABA處理的細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)綜合表現(xiàn)較優(yōu)，6-BA處理明顯地促進(jìn)了可溶性蛋白質(zhì)的含量，但卻抑制了PRO的含量。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同低溫脅迫下紅火炬郁金種球的生理生化變化

根據(jù)受損程度分析，紅火炬郁金種球在9 ℃左右時(shí)已經(jīng)處在受逆境脅迫狀態(tài)了，-3 ℃時(shí)脅迫程度最高，根據(jù)抗氧化酶系統(tǒng)可知，各抗氧化酶的表現(xiàn)趨勢(shì)大致一致，即隨著溫度的降低，酶活性逐漸增強(qiáng)，超過(guò)耐受極限后再逐漸降低。但各酶活性變化的極點(diǎn)溫度并不一致，POD活性在5 ℃時(shí)最高，CAT活性在1 ℃時(shí)最高，而SOD的活性在-3 ℃時(shí)達(dá)到最高狀態(tài)。滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)中，可溶性蛋白質(zhì)含量在9 ℃達(dá)到最高，可溶性糖及PRO含量在5 ℃時(shí)達(dá)到最高。SOD活性和MDA含量的變化趨勢(shì)大致一致，即在低溫脅迫狀態(tài)下，都隨著溫度的降低而增加，都在-3 ℃時(shí)達(dá)到最高，推測(cè)SOD活性的增強(qiáng)主要用來(lái)處理膜脂過(guò)氧化產(chǎn)生的MDA。MDA是膜脂過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物，而SOD為酶防御系統(tǒng)的核心酶[30]，提高SOD活性可使細(xì)胞內(nèi)的活性氧維持在一個(gè)較低的水平，從而達(dá)到抵御低溫的作用[30]。在細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)的變化中，低溫脅迫狀態(tài)下，PRO、可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)趨勢(shì)較為明顯，都呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)，但極點(diǎn)溫度并不一致，PRO含量和可溶性糖含量的最高點(diǎn)溫度都是5 ℃，而可溶性蛋白質(zhì)的最高點(diǎn)溫度則是9 ℃。因此，綜合種球受損程度及抗逆系統(tǒng)的反應(yīng)，紅火炬郁金種球保存過(guò)程中以不低于5 ℃為宜，9 ℃種球即已開(kāi)始受低溫脅迫了，而5 ℃時(shí)種球的多數(shù)抗逆機(jī)制都已處于極限抵制狀態(tài)，溫度如果進(jìn)一步降低則有可能會(huì)造成種球損害。

3.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理對(duì)紅火炬郁金種球抗寒性的影響

抗寒性植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑篩選試驗(yàn)表明，各植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理[包括脫落酸(ABA)、水楊酸(SA)、油菜素內(nèi)酯(BR)、6-BA、多效唑(PP333)等]對(duì)增強(qiáng)紅火炬郁金種球的抗寒性都有一定的作用。根據(jù)細(xì)胞受損程度分析，6-BA和ABA處理的細(xì)胞完整性較好(相對(duì)電導(dǎo)率較低)，而且膜脂氧化程度也較低(MDA含量較低)，它們對(duì)種球的保護(hù)效果是最好的。SA和PP333雖然也能一定程度上保護(hù)膜的完整性，但膜脂的氧化程度很高，甚至高于不加任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的PCK(陽(yáng)性對(duì)照)。

為分析各植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)的總體效用，將SOD、POD和CAT的活性各按1 ∶1 ∶1的均等權(quán)重累加，并構(gòu)建一個(gè)不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的總抗氧化酶活性圖(圖8，PCK的總抗氧化酶活性定為1)，各植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的總抗氧酶活性都有明顯增加，按從大到小順序依次是BR>SA>PP333>6-BA>ABA>PCK，與各植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的相對(duì)電導(dǎo)率的存在明顯的一致性(圖5-A)，說(shuō)明各處理都明顯促進(jìn)了抗氧化酶的生成，其生成的產(chǎn)量與膜的受損程度存在明顯的正向關(guān)系。此外，這些植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的總抗氧化酶活性都遠(yuǎn)低于正常條件下未經(jīng)低溫脅迫處理陰性對(duì)照(NCK)。結(jié)合NCK組的超低相對(duì)電導(dǎo)率可知，保持合適的溫度是種球貯藏過(guò)程的關(guān)鍵，低溫條件下抗寒相關(guān)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理雖能一定程度上增加種球的抗寒性，但都有一定的滯后性，進(jìn)行反射性、應(yīng)激性的修復(fù)工作。細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)方面，各植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理所促進(jìn)相關(guān)物質(zhì)含量也各有側(cè)重，但在可溶性蛋白含量方面都表現(xiàn)出明顯一致的促進(jìn)效應(yīng)。

綜上所述，紅火炬郁金種球在9 ℃時(shí)開(kāi)始受低溫逆境脅迫，-3 ℃時(shí)脅迫程度最高；而各抗氧化酶的表現(xiàn)并不一致，POD活性在5 ℃時(shí)最高，CAT活性在1 ℃時(shí)最高，而SOD在-3 ℃時(shí)活性達(dá)到最高狀態(tài)。滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)中，可溶性蛋白質(zhì)含量在9 ℃時(shí)達(dá)到最高，可溶性糖及PRO含量在5 ℃時(shí)達(dá)到最高。綜合種球受損程度及抗逆系統(tǒng)的反應(yīng)，種球保存過(guò)程中以不低于5 ℃為宜。此外，各抗寒相關(guān)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理[包括脫落酸(ABA)、水楊酸(SA)、油菜素內(nèi)酯(BR)、6-BA、多效唑(PP333)等]對(duì)增強(qiáng)紅火炬郁金種球的抗寒性都有一定的作用，其中6-BA和ABA處理對(duì)種球的保護(hù)效果較好。

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