白茅根總黃酮提取工藝及其抗氧化性研究

翁 梁， 李西騰

(江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品學(xué)院，江蘇淮安 223003)

白茅根為禾本科植物白茅[ImperatecylindriaBeauv. var.major(Nees) C. E. Hubb.]的根莖，又稱白花茅根、茅草根、甜草根等[1]，是我國傳統(tǒng)的中藥材。白茅根性甘、味寒，有涼血止血、清熱利尿之功效，臨床可用于治療熱病煩渴、血淋、水腫、黃疸等癥[2-3]。近幾年的研究顯示，白茅根的主要化學(xué)成分有三萜類化合物、有機(jī)酸、多糖、黃酮類物質(zhì)等[4]。藥理研究的結(jié)果表明，白茅根具有調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、降血糖、降血脂等作用[5]。

目前，國內(nèi)對白茅根活性成分提取工藝的研究多集中在多糖的提取，并做了大量系統(tǒng)的研究[6]。還有科技工作者對白茅根的綠原酸、總酚酸和總?cè)莆镔|(zhì)的提取進(jìn)行了研究[7-8]，但有關(guān)白茅根中總黃酮的提取工藝及其抗氧化活性的研究尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)采用乙醇溶液作為浸提劑，用水浴浸提法提取白茅根中的總黃酮，并對白茅根總黃酮體外抗氧化活性進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白茅根，購自安徽省亳州市志民藥業(yè)有限公司。蘆丁，購自上海恒遠(yuǎn)生化試劑有限公司。無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、維生素C等均為分析純，2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)為食品級，均購自江蘇省淮安國藥化學(xué)試劑有限公司。

粉碎機(jī)，購自上海隆拓儀器設(shè)備有限公司；UV765-可見分光光度計(jì)，購自上海精密科學(xué)儀器有限公司；電子精密天平，購自奧豪斯儀器(上海)有限公司；恒溫水浴鍋，購自上海喬躍電子有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照文獻(xiàn)[9]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取5 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品置于20 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液溶解并定容，分別吸取0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mL 置于10 mL比色管中，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，放置6 min，再加入0.3 mL 10%硝酸鋁鈉溶液，放置 6 min 后加入4.0 mL 5%氫氧化鈉溶液，加水至刻度線，搖勻，放置15 min，在510 nm處測吸光度，以蘆丁濃度(C)為橫坐標(biāo)、吸光度(D)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程D=0.309 6C+0.005 8，r2=0.999 1，表明在0～0.12 mg/mL范圍內(nèi)，蕓香苷濃度與吸光度具有線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

1.2.2 白茅根總黃酮提取方法 將白茅根于60 ℃烘干，粉碎過60目篩。準(zhǔn)確稱取1.0 g粉末樣品，加入乙醇溶液，置于水浴鍋中提取，提取3次，合并提取液。按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法顯色后，在510 nm波長處測量樣品溶液的吸光度。

白茅根總黃酮含量的計(jì)算公式：總黃酮含量=C×N×V/M。其中，C為樣品的吸光度代入回歸方程計(jì)算得到的總黃酮濃度，mg/mL；N為樣品稀釋倍數(shù)；V為加入乙醇提取液的體積，mL；M為粉末樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用水浴法，用乙醇溶液作為浸提劑，按料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度70%、提取溫度 60 ℃、提取時(shí)間60 min的基本提取工藝，以總黃酮提取量為指標(biāo)，確定其他條件不變，改變單因素的值，分別考察料液比[1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50(g ∶mL)]、乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)、提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)、提取時(shí)間(30、60、90、120、150 min)對白茅根總黃酮提取量的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間等4個(gè)因素，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，通過對白茅根總黃酮提取量和正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，確定最佳提取工藝。

1.2.5 抗氧化活性研究

1.2.5.1 DPPH自由基清除率的測定 將白茅根總黃酮提取液、BHT、維生素C配制成不同濃度的待測樣品液，再與0.01 mmol/L DPPH溶液混勻，室溫下反應(yīng)30 min，然后在 517 nm 波長處測定其吸光度[9]。

DPPH自由基清除率計(jì)算公式：清除率=(1-D/D0)×100%。式中，D為樣品溶液的吸光度，D0為用無水乙醇代替樣品溶液作為空白對照的吸光度。

1.2.5.2 白茅根總黃酮還原能力測定 采用普魯士蘭法[10]測定白茅根總黃酮的還原力，以普魯士蘭的生成量為指標(biāo)，在700 nm波長處測定其吸光度。試驗(yàn)用相同濃度的BHT、維生素C作為對照品，吸光度越大表示還原能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對白茅根總黃酮提取量的影響 按乙醇濃度70%、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間60 min，考察當(dāng)料液比分別為1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50(g ∶mL)時(shí)對白茅根總黃酮提取量的影響。由圖2可知，隨著料液比的變化，白茅根總黃酮提取量先升后降。當(dāng)料液比為1 g ∶40 mL時(shí)，總黃酮提取量最高，達(dá)到1.622 mg/g。隨后當(dāng)料液比為1 g ∶50 mL時(shí)，總黃酮提取量下降。

2.1.2 乙醇濃度對白茅根總黃酮提取量的影響 按料液比1 g ∶30 mL、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間60 min，考察當(dāng)乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%時(shí)對白茅根總黃酮提取量的影響。由圖3可知，隨著乙醇濃度逐漸增大，白茅根總黃酮的提取量也逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)提取量達(dá)到最大值，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)，總黃酮的提取量明顯下降。

2.1.3 提取溫度對白茅根總黃酮提取量的影響 按料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度70%、提取時(shí)間60 min，考察當(dāng)提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃時(shí)對白茅根總黃酮提取量的影響。由圖4可知，隨著提取溫度的升高，總黃酮提取量逐漸增加。當(dāng)提取溫度達(dá)到60 ℃及以上時(shí)，總黃酮提取量增加的較少且趨于平穩(wěn)。

2.1.4 提取時(shí)間對白茅根總黃酮提取量的影響 按料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度70%、提取溫度60 ℃，考察當(dāng)提取時(shí)間分別為30、60、90、120、150 min時(shí)對白茅根總黃酮提取量的影響。由圖5可知，提取時(shí)間在30～90 min內(nèi)，白茅根總黃酮提取量增加的較為明顯。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到90 min及以后時(shí)，總黃酮提取量趨于穩(wěn)定，增加量較小。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，正交試驗(yàn)的極差(R)表現(xiàn)為A>D>C>B，說明對白茅根總黃酮提取量的影響表現(xiàn)為料液比>提取時(shí)間>提取溫度>乙醇濃度。白茅根總黃酮最佳提取工藝組合為A2B3C3D3，即料液比為1 g ∶40 mL、乙醇濃度為80%、提取溫度為80 ℃、提取時(shí)間為150 min。根據(jù)表2方差分析的結(jié)果可知，料液比、提取時(shí)間、提取溫度對總黃酮提取量具有顯著影響(P<0.05)。

2.3 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 DPPH自由基清除率測定結(jié)果 由圖6可知，白茅根總黃酮對DPPH自由基有明顯的清除作用。在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，白茅根總黃酮對DPPH自由基清除作用隨著濃度的升高逐步增強(qiáng)，當(dāng)濃度為1.50 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到45.17%。但白茅根總黃酮對DPPH自由基的清除率明顯低于相同濃度的維生素C，略好于相同濃度的BHT，說明白茅根總黃酮具有較好的抗氧化作用。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 方差分析結(jié)果

注：“*”表示在0.05水平上影響顯著。

2.3.2 白茅根總黃酮還原能力測定結(jié)果 吸光度的變化反映樣品還原能力的強(qiáng)弱，吸光度越大，樣品的還原能力越強(qiáng)，還原能力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。由圖7可知，在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，白茅根總黃酮的還原能力隨著濃度的升高逐步增強(qiáng)，且還原力與濃度有線性關(guān)系。與相同濃度的維生素C相比，白茅根總黃酮的還原力明顯較差，但好于相同質(zhì)量濃度的BHT，說明白茅根總黃酮具有較好的抗氧化性。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)以乙醇溶液作為浸提劑，用水浴浸提法提取白茅根總黃酮，采用分光光度法測定總黃酮含量。結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為料液比1 g ∶40 mL、乙醇濃度80%、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間150 min。該提取工藝穩(wěn)定可靠，如若結(jié)合其他提取技術(shù)，能否進(jìn)一步提高總黃酮的提取量，還須再做深入研究。

試驗(yàn)測定白茅根總黃酮提取物清除DPPH自由基的能力及還原能力，并以相同濃度的BHT、維生素C作對照。結(jié)果表明，白茅根總黃酮清除DPPH自由基的能力及還原能力明顯小于相同濃度的維生素C，略高于相同濃度的BHT。說明白茅根總黃酮具有一定的抗氧化作用，但其抗氧化的具體成分還須做進(jìn)一步研究。

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