王慧軍，楊新超,2，王柯，張建華，毛忠貴*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫, 214122) 2(濟(jì)南大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 濟(jì)南，250022)

酒精是我國大宗發(fā)酵產(chǎn)品之一，2020年年產(chǎn)將達(dá)到1 000萬t[1]。但是廢水污染問題變得更加嚴(yán)重，已經(jīng)成為限制酒精工業(yè)發(fā)展的重要因素。以木薯酒精生產(chǎn)工藝為例，其廢液處理工藝比較復(fù)雜，步驟多、投資大，運行和維護(hù)費用高，還需進(jìn)入城市污水處理系統(tǒng)做深度處理。江南大學(xué)毛忠貴教授團(tuán)隊于2006年提出的“酒精-沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)工藝”詮釋了一條全新的解決思路[2-3]。在該工藝中(圖1)，木薯原料中的淀粉經(jīng)過液化、糖化、發(fā)酵、蒸餾等技術(shù)手段轉(zhuǎn)化為成品酒精，而蒸餾過程產(chǎn)生的70%左右的廢水經(jīng)過厭氧消化(沼氣發(fā)酵)轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)能源——沼氣，沼氣發(fā)酵后的沼液經(jīng)過水資源化處理，達(dá)到資源化指標(biāo)后與30%的酒糟(酒糟，主要成分為木薯原料中不能被酵母菌利用的纖維素、半纖維素、果膠等生物質(zhì)，釀酒酵母代謝主要副產(chǎn)物，如小分子有機(jī)酸、甘油、異戊醇，以及雜菌產(chǎn)生的乙酸、乳酸、丙酸等)清液混合，回用作為工藝用水，實現(xiàn)廢水零排放目標(biāo)；沼氣替代煤炭作為能源物質(zhì)，通過“熱電聯(lián)產(chǎn)”技術(shù)獲得綠色能源，回供于生產(chǎn)中的各個工序。該工藝相較于傳統(tǒng)工藝具有顯著優(yōu)勢：(1)削除了占地面積大、運行費用高的好氧消化處理；(2)消除了污水深度處理費用；(3)實現(xiàn)廢水回用，節(jié)約大量水資源；(4)原料利用率提高約2%；(5)可消除發(fā)酵過程外觀氮源(如尿素)的添加，進(jìn)一步降低輔料成本。

經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，乙酸銨是混合水中主要的氮源物質(zhì)。本研究通過比較乙酸銨與硫酸銨、氯化銨2種氮源物質(zhì)對酒精發(fā)酵的影響，揭示了酒精-沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)工藝對酒精發(fā)酵效果影響的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)：湖北宜昌安琪酵母有限公司；木薯：吳江永祥酒精制造有限公司；耐高溫α-淀粉酶(100 000 U/mL)和糖化酶(10 000 U/mL)：無錫杰能科公司。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)基(g/L)

葡萄糖20，酵母膏8.5，NH4Cl 1.3，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.06，pH自然，115 ℃滅菌15 min。

1.2.2 液化液制備與酒精發(fā)酵

按1∶3(g∶mL)的比例將木薯粉(平均粒徑0.45 mm)與配料水混合，加入耐高溫α-淀粉酶(15 U/g木薯粉)。加熱料液至90 ℃，維持100 min。自然降溫到室溫，用去離子水彌補(bǔ)液化過程損失的水分。分裝至250 mL三角瓶中，滅菌(115 ℃，15 min)。降溫到室溫，在超凈臺添加糖化酶(150 U/g木薯粉)、種子培養(yǎng)基[φ(種子液)=10%]和氮源(含氮質(zhì)量濃度400 mg/L)進(jìn)行酒精發(fā)酵。在30 ℃培養(yǎng)箱中靜置。

1.2.3 上罐酒精發(fā)酵

分批發(fā)酵在工作體積為3 L的5 L罐發(fā)酵罐(Baoxing Corp，China)中進(jìn)行。將約300 mL的預(yù)培養(yǎng)種子接種到2.7 L無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中。培養(yǎng)期間通過pH電極(Mettler Toledo)檢測pH變化，發(fā)酵溫度30 ℃。接種后每隔2 h取樣檢測，間歇攪拌。首先，分別以乙酸銨和硫酸銨作為氮源，進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)酵過程不調(diào)控pH；然后再以硫酸銨為氮源，調(diào)控發(fā)酵過程pH，使之與乙酸銨為氮源時pH變化趨勢一致。

1.2.4 分析方法

總糖測定：斐林試劑滴定法[4]。

酒精濃度測定：蒸餾法[5]。

甘油測定：HPLC法。色譜條件：Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm，9 μm，Hercules，CA)；RI檢測器(Shodex RI-101，Japan)和UV檢測器(Dionex，USA)；流動相為5 mmol/L H2SO4；柱溫65 ℃；流速0.6 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

酵母細(xì)胞數(shù)測定：血球板計數(shù)法。

采用SPSS Statistics 19(IBM，USA)進(jìn)行方差分析(Fisher’s least significant difference，LSD)，當(dāng)p<0.05時認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同氮源對木薯酒精發(fā)酵效果的影響

在酒精發(fā)酵過程中，每產(chǎn)生1分子乙醇就伴隨著1分子CO2的產(chǎn)生，因此可以通過酒精發(fā)酵過程發(fā)酵體系的失重情況來直接反映酒精發(fā)酵速率，并且可間接反映酒精產(chǎn)率。從發(fā)酵失重曲線來看(圖2-a)，當(dāng)以乙酸銨為氮源時，在39 h時，發(fā)酵體系失重不再增加，說明此時酒精發(fā)酵已結(jié)束；而以硫酸銨和氯化銨分別為氮源時，酒精發(fā)酵延遲到48 h才結(jié)束。這說明以乙酸銨為氮源的酒精發(fā)酵速率明顯高于以硫酸銨和氯化銨分別為氮源的酒精發(fā)酵。此外，以乙酸銨為氮源的酒精發(fā)酵的總失重也明顯高于以硫酸銨和氯化銨分別為氮源的酒精發(fā)酵，間接表明乙酸銨可以提高酒精發(fā)酵的酒精產(chǎn)率。此外，相較于硫酸銨和氯化銨(pH 3.6)，乙酸銨作為氮源時發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液pH也維持在相對較高的水平(4.20)(圖2-b)。與此相反，當(dāng)以乙酸銨為氮源時殘總糖濃度相對較低(圖2-d)。由于培養(yǎng)基中含有的木薯渣，酵母的干重很難測量，因此使用血細(xì)胞計數(shù)器來計數(shù)酵母細(xì)胞以評估釀酒酵母的生長。圖2-c的結(jié)果表明當(dāng)使用乙酸銨作為氮源時，獲得較低的生物量，這與高發(fā)酵率是由于高生物量產(chǎn)生的這一理論相悖[6]。

如圖3-a所示，乙酸銨為氮源時的酒精體積分?jǐn)?shù)比硫酸銨和氯化銨為氮源時的酒精體積分?jǐn)?shù)高4%左右，該結(jié)果與總失重結(jié)果相一致。不同氮源還會影響酒精發(fā)酵過程的最主要副產(chǎn)物甘油的產(chǎn)生。圖3-b顯示，以硫酸銨和氯化銨為氮源的酒精發(fā)酵的甘油產(chǎn)量相似，但比以乙酸銨為氮源的酒精發(fā)酵的甘油產(chǎn)量高約24%。

圖3 不同氮源對酒精發(fā)酵過程酒精產(chǎn)量(a)和甘油產(chǎn)量(b)的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on ethanol production (a) and glycerol production (b) in ethanol fermentation

根據(jù)上述結(jié)果初步推測，相較于硫酸銨和氯化銨，乙酸銨通過降低副產(chǎn)物甘油的合成以及發(fā)酵殘總糖的濃度，使得發(fā)酵體系中更多的碳源轉(zhuǎn)化為主產(chǎn)物酒精。那么，乙酸銨是如何降低甘油的合成以及殘總糖的濃度則是需要進(jìn)一步解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。酒精發(fā)酵過程中，酵母產(chǎn)生甘油的目的是用于維持胞內(nèi)的氧化還原平衡和滲透壓平衡，此外當(dāng)釀酒酵母所處培養(yǎng)基的pH發(fā)生變化時，也會影響釀酒酵母對甘油的合成。當(dāng)氨氮作為氮源時，酵母利用氨氮合成氨基酸，同時生成NADH。為了避免胞內(nèi)的NAD+/NADH比例失衡，釀酒酵母必須通過甘油產(chǎn)生途徑將NADH重新氧化為NAD+[7]。但是，實驗所用3種氮源同為銨鹽，且濃度相當(dāng)，所以推測pH是造成2類氮源下甘油合成差異的主要原因。

為了證明這一推測，首先分別監(jiān)測了乙酸銨、硫酸銨為氮源時，酒精發(fā)酵過程pH的變化情況，在此基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)硫酸銨為氮源時發(fā)酵體系pH，使之與乙酸銨為氮源時pH變化趨勢一致，比較兩種條件下，酒精發(fā)酵效果。如圖4-a所示，當(dāng)硫酸銨作為氮源時，發(fā)酵過程pH的下降速度和幅度明顯高于以乙酸銨為氮源時的發(fā)酵，發(fā)酵10 h時pH就下降到最低值pH 3.28，而對于乙酸銨，發(fā)酵18 h pH下降到最低值pH 3.94。在酒精發(fā)酵過程，發(fā)酵液pH的下降主要是由釀酒酵母通過營養(yǎng)傳遞過程分泌質(zhì)子、吸收不同的離子、生成CO2和有機(jī)酸等過程引起的[8]。當(dāng)銨鹽作為氮源時，釀酒酵母通過等離子膜ATPase產(chǎn)生的電化學(xué)等離子膜電勢將氨氮從培養(yǎng)基中吸收至胞內(nèi)，細(xì)胞為了保持胞內(nèi)pH穩(wěn)定必須將等摩爾質(zhì)子排至胞外，這就造成發(fā)酵液pH的下降[9-10]。硫酸銨和乙酸銨同為銨鹽，但是硫酸根為強(qiáng)酸鹽，而乙酸根為弱酸鹽，發(fā)酵過程乙酸鹽會與乙酸構(gòu)成緩沖體系，在乙酸的pKa(4.75)附近產(chǎn)生較強(qiáng)的緩沖作用，致使發(fā)酵液pH下降速度和幅度相對較低，而發(fā)酵培養(yǎng)基中相對高的pH有利于糖化酶發(fā)揮作用，使得殘總糖的濃度較低。然而，以硫酸銨為氮源時，即使調(diào)節(jié)發(fā)酵體系pH使之與乙酸銨為氮源時pH變化趨勢一致，酒精發(fā)酵過程甘油產(chǎn)量不僅沒有下降，反而有所升高(圖4-b)。這說明硫酸銨為氮源時甘油產(chǎn)量較乙酸銨為氮源時低的現(xiàn)象并不是由較低的發(fā)酵pH所引起。

圖4 乙酸銨和硫酸銨為氮源時酒精發(fā)酵過程pH變化情況(a)、原始pH和調(diào)節(jié)pH條件下硫酸銨對甘油產(chǎn)量影響(b)Fig.4 Evolutions of pH throughout the ethanol fermentation with the ammonium acetate and ammonium sulfate as nitrogen source (a) and effects of ammonium sulfate on glycerol production under original pH and adjusted pH (b)

2.2 乙酸銨中乙酸根對酒精發(fā)酵的影響

乙酸銨所帶乙酸根除了對酒精發(fā)酵過程pH的變化趨勢產(chǎn)生影響外，可能也是影響釀酒酵母甘油合成的因素。因此，研究了不同氮源條件下，乙酸添加對于酒精發(fā)酵過程的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)以硫酸銨為氮源時，酒精發(fā)酵速率相對較低；而在此基礎(chǔ)上添加乙酸則可提高酒精發(fā)酵速率(相對于前者發(fā)酵時間縮短了約20.83%)并且與乙酸銨為氮源時的發(fā)酵速率相當(dāng)。硫酸銨為氮源時，添加乙酸還會提高發(fā)酵結(jié)束時pH，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)酵殘總糖較硫酸銨為唯一氮源時偏低，但是仍高于以乙酸銨為氮源的酒精發(fā)酵，這與上文所述殘總糖與發(fā)酵pH密切相關(guān)的結(jié)論一致。另外，向以硫酸銨為氮源的發(fā)酵體系中添加乙酸，可顯著提高酒精產(chǎn)量并降低甘油產(chǎn)量，并且與以乙酸銨為氮源時的發(fā)酵水平相當(dāng)。上述結(jié)果說明，向發(fā)酵液中添加乙酸可以提高釀酒酵母酒精發(fā)酵效果，與硫酸銨和氯化銨相比，乙酸銨作為氮源對酒精發(fā)酵的正面影響主要是原因在于乙酸銨中乙酸根的存在。

圖5 不同氮源對酒精發(fā)酵過程失重(a)、發(fā)酵結(jié)束pH(b)和殘總糖(c)的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on weight loss (a),final pH (b) and residual total sugar (c) in ethanol fermentation

圖6 不同氮源對酒精發(fā)酵過程酒精產(chǎn)量(a)和甘油產(chǎn)量(b)的影響Fig.6 Effects of different nitrogen sources on ethanol production (a) and glycerol production (b) in ethanol fermentation

圍繞乙酸對釀酒酵母的影響及釀酒酵母對乙酸的響應(yīng)機(jī)制，國內(nèi)外學(xué)者開展了大量的研究工作，主要得到了如下結(jié)論或推論：(1)低pH(

3 結(jié)論

酒精-沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)工藝的應(yīng)用不僅可為酒精發(fā)酵提供足夠的氮源，還可提高酒精產(chǎn)率，降低副產(chǎn)物甘油的生成。本文研究表明，回用水中乙酸銨是一種有效的酒精發(fā)酵氮源物質(zhì)，相較于硫酸銨和氯化銨，它可縮短酒精發(fā)酵時間、提高酒精產(chǎn)率及減少副產(chǎn)物甘油合成。因此，乙酸銨是造成酒精-沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)工藝對酒精發(fā)酵效果產(chǎn)生正面影響的主要因素。

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