王丹麗，蔣榮霞，劉夢婕，連喜軍※

（1. 天津商業(yè)大學理學院，天津 300134；2. 天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

0 引 言

冷凍是延長含小麥、甘薯、馬鈴薯和玉米淀粉等的食品貨架期的有效方法[1-2]。高壓濕熱解凍法是食用冷凍食品前通常采用的處理方法。在凍融處理過程中通常有2種方法可以控制淀粉類食品的品質，一種是選擇凍融處理的最佳條件，這樣可以最大的程度減少凝膠淀粉中的質量損失并避免食品變質，比如脫水收縮、回生以及凝膠淀粉中的質地變化[3-6]；另一種方法是培育含容易斷裂側鏈少的植物品種。許多植物中都含有淀粉，其中谷類淀粉（小麥和玉米）及根類淀粉（甘薯和馬鈴薯）應用最為廣泛[7-9]。Zhao等[10]通過研究4種常用淀粉（包括小麥淀粉，玉米淀粉，馬鈴薯淀粉和木薯淀粉）凍融穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)小麥淀粉的穩(wěn)定性最差，因為其凝膠淀粉在凍融過程失水最多。文獻報道冷凍時間和貯存溫度對含淀粉類食物的品質有很大的影響[11]。De-Kock等[12]報道含淀粉食品的硬度隨著冷凍速度的增加而增大，而更低的冷凍溫度和更長的冷凍時間會使食品粘性下降。與在較低的溫度下融化相比，在更高溫度下融化的淀粉凝膠具有更低的脫水收縮值[13]。凍融處理的淀粉表現(xiàn)出高的酶解敏感性[14]。高的酶解敏感性可能歸因于淀粉的多孔性[15]、直鏈淀粉含量的變化或支鏈鏈長分布的變化[14-17]。然而，在高壓下，凍融是否會導致凝膠淀粉鏈的斷裂尚不清楚，而這一點可以通過測定淀粉糊中直鏈含量的變化反映出來。當凝膠淀粉被冷凍時，凝膠中形成的冰與水相比，體積會變大。形成冰的作用力可能會使淀粉顆粒破裂，從而使支鏈從顆粒中釋放出來，這些支鏈在高壓濕熱解凍時會斷裂成直鏈或多糖，因此凝膠淀粉中直鏈的含量會隨著解凍時間而發(fā)生變化。到目前為止，鮮有文獻開展此類研究，大多文獻涉及凍融作用對淀粉的脫水收縮或回生的影響[18-19]。Tao等[14]將凍融處理后直鏈淀粉含量的下降歸因于直鏈淀粉析出或凍結壓力導致碘液對直鏈淀粉雙螺旋的吸附力變弱。這種不確定的解釋需要更詳細試驗的來證明。因此，本文的目標是研究加熱溫度、加熱時間、冷凍時間和解凍時間對淀粉糊中直鏈淀粉含量的影響，找出使直鏈淀粉含量達到最大值的冷凍時間。這一時間將是特定淀粉在食品加工中最長的冷凍時間。另外，通過觀察未冷凍和凍融后淀粉的微結構，更好的理解淀粉特性和凍融處理之間的關系?；诓煌矸蹆鋈谶^程鏈長分布的變化，推斷了所研究淀粉鏈的最可能的斷裂方式。本文為含小麥、甘薯、馬鈴薯和玉米淀粉食品凍結工藝的選擇提供了相關理論基礎。

1 材料和方法。

1.1 材料

小麥，甘薯，馬鈴薯和玉米淀粉（直鏈質量分數(shù)分別為19.3%，25.5%，22.4%和27.2%）由石家莊中心糖業(yè)有限公司提供。正丁醇和酒精購買至天津市富宇精細化工有限公司。普魯蘭酶(酶委員會編號：3.2.1.41；5 000 U/mL），麥芽糖，麥芽三糖，麥芽四糖，麥芽五糖，麥芽六糖，麥芽七糖購至美國Sigma-Aldrich有限公司。

1.2 試驗儀器

高效體積排阻柱色譜系統(tǒng)（high performance size exclusion column chromatography system，HPSEC），該系統(tǒng)配有多角度激光光散射檢測器（multi-angle laser light scattering detecotr，MALS），折光率檢測器（refractive index detector，RI）。串聯(lián)雙柱（300 mm×7.5 mm，PL aquagel-OH MIXED，8 μm凝膠色譜柱，英國，什羅普郡Polymer有限公司）。DAWN DSP-F型激光光度計，采用He-Ne激光（λ=623.8 nm）為光源。K-5貫流分析池（美國懷雅特技術公司，美國圣塔芭芭拉）。RID-10A型差示折光儀（日本島津公司）。0.4 μm薄膜濾器（Membrane Solutions有限責任公司）。高效陰離子交換色譜中HPAEC-PAD系統(tǒng)包含DIONEX （DX-600）離子色譜儀，ED 50電化學檢測器（以Pt為工作電極），AS 40自動采樣器（戴安公司，美國森尼韋爾）。OLYMPUS IX71型光學顯微鏡。掃描電鏡（型號為JEOL型1850，日本東京）。

1.3 方法

1.3.1 凝膠淀粉的凍融處理

將濃度為10%的淀粉水懸浮液加熱至95 ℃，持續(xù)攪拌以避免顆粒沉降。懸浮液在 95 ℃下分別保持 10、20和40 min，然后冷卻至26 ℃。將樣品在–18 ℃下分別冷凍 12，24和 48 h。隨后將樣品置于蒸汽壓力罐中，在110 ℃下分別解凍 20、40、60 min。對照樣品在95 ℃下不斷攪拌40 min后冷卻至26 ℃。然后將所有樣品在干燥箱中（干燥箱內空氣溫度為55～60 ℃）干燥至恒質量。

1.3.2 直鏈淀粉含量的測定

試驗采用正丁醇沉淀法分離和測定直鏈淀粉[20–22]。將5 g樣品溶解至100 mL 濃度0.05% NaCl溶液中釋放出凝膠化淀粉中的直鏈淀粉。將該溶液在室溫下持續(xù)攪拌2 h然后離心分離（3 040×g，5 min）。通過加入3倍體積的 1-丁醇，使上清液中的直鏈淀粉沉淀，然后通過離心分離（3 040×g，5 min）。將以上過程重復直至不再有沉淀析出。將所有沉淀收集并在55～60 ℃下的干燥箱中干燥至恒質量。直鏈淀粉含量計算公式如式（1）。

直鏈淀粉含量 =（沉淀質量/淀粉質量）×100% （1）

1.3.3 分子量分布曲線

分子量分布曲線的確定按文獻[23]所述。將樣品（100 g）加入80 mL的去離子水中，然后在沸水中加熱并攪拌20 min使樣品完全溶解。通過5 μm的醋酸纖維素濾膜過濾后，將溶解后的樣品放入高效體積排阻柱色譜系統(tǒng)中。流動相速度為 0.5 mL/min。流動相為含 0.02%NaN3的0.1 mol/L NaNO3溶液，該溶液通過0.4 μm薄膜濾器過濾。分子量計算時，比折光指數(shù)增量（dn/dc）值為0.150，數(shù)據(jù)處理采用ASTRA軟件（4.73.04版）。

1.3.4 鏈長分布曲線

樣品的鏈長分布利用配有脈沖電流檢測器的高效陰離子交換色譜測定（HPAEC-PAD）[23-24]。將樣品（100 mg）溶解在 30 mL 4.0 mol/L KOH中以阻止淀粉結團，用6.0 mol/L HCl將溶液的 pH調整至 6.0。將普魯蘭酶（0.5 U）分別加至每份溶液中，保持45 ℃下不斷攪拌并水解24 h。然后，將溶液在沸水浴中加熱10 min使酶失活。脫支的樣品溶液以 21 500×g加速度下離心后通過0.45 μm 的薄膜過濾器過濾，然后注入 HPAEC-PAD 系統(tǒng)。標準三電位波形采用以下周期和脈沖電位：T1=0.40 s，采樣時間為 0.20 s，E1=0.05 V；T2=0.20 s，E2=0.75 V；T3=0.40 s，E3=-0.15 V。數(shù)據(jù)通過戴安液相層析儀軟件收集。洗提液用蒸餾去離子水制備并用氦氣噴霧。洗脫液A包含200 mmol/L NaOH，洗脫液B在200 mmol/L NaOH中加入了50 mmol/L乙酸鈉。

1.3.5 原糊化淀粉和凍融淀粉的光學顯微照片

用接種針取少量糊化淀粉放于基片上并分散均勻。將基片在室溫下干燥后得到樣品的光學顯微照片，所有照片均被放大200倍。

1.3.6 樣品形貌分析

用無水乙醇將淀粉制備成懸浮液，取一滴懸浮液放在銀膠帶上（粘貼面朝下），將銀膠帶粘到一塊銅盤上并在表面噴金處理Au/Pd（60/40）。用掃描電鏡觀察樣品。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗分別選取了 4個因素：包括糊化溫度（60, 80,100 ℃），糊化時間（10, 20 40 min），冷凍時間（24, 48,72 h）及融化時間（20, 40, 60 min），每個因素分別取了3個變量。每個數(shù)據(jù)均取自 3個重復試驗的均值。利用方差分析和最小顯著差（least significant difference，LSD）分析數(shù)據(jù)的差異顯著性（Excel）。

2 結果和討論

2.1 凍融前后直鏈含量變化

為了減少凍融處理對淀粉脫水收縮的影響[3]，人們采用過多種方法[25-26]。雖然這些方法起到一定作用，但此類方法增加了產(chǎn)品的成本因而限制了其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應用。因此凍融處理時采用適當?shù)膮?shù)就尤為重要。直鏈淀粉分子重新排列組合是凍融淀粉老化的主要原因[27]，所以測定凍融處理過程中凝膠化淀粉中直鏈淀粉含量的變化是是控制老化的一個重要參數(shù)。

表1、表2、表3和表4給出了加熱溫度、冷凍時間和融化時間等因素對小麥、甘薯、馬鈴薯和玉米直鏈淀粉的影響。可以確定，在高壓濕熱條件下，隨著融化時間的延長，直鏈淀粉含量變化的趨勢是不確定的。

直鏈淀粉第一次增加是由于凍結-解凍過程更多淀粉球破裂導致更多直鏈淀粉從淀粉球中析出導致；第二次直鏈淀粉增加是由支鏈淀粉斷裂產(chǎn)生的，因為凍融解凍后直鏈淀粉的含量遠遠高于原淀粉中直鏈淀粉含量，經(jīng)我們測定，直鏈淀粉增加的樣品支鏈淀粉含量明顯減少了。通過對平均值計算分析，找到了直鏈淀粉含量最大值和最小值。

由表1看出，對小麥淀粉，直鏈淀粉含量的最大值和最小值分別約61.2%和6.0%，相應的加熱溫度、加熱時間、冷凍時間和解凍時間分別為60 ℃，20 min，48 h，60 min以及100 ℃，40 min，48 h，60 min。對于甘薯淀粉，最大值和最小值分別約69.8%和0.2%，相應的參數(shù)分別為100 ℃，10 min，48 h，60 min 以及 80 ℃，20 min，24 h，20 min。對于馬鈴薯淀粉，最大值和最小值分別約89.0%和0.7%，相應的參數(shù)分別為80 ℃，40 min，48 h，20 min以及80 ℃，40 min，24 h，40 min。對于玉米淀粉，最大值和最小值分別約 53.7%和 1.53%，相應的參數(shù)分別為100 ℃，40 min，72 h，60 min 以及 60 ℃，10 min，24 h，20 min。可以看出，支鏈淀粉斷裂為直鏈淀粉的困難程度依次為：玉米＞小麥＞甘薯＞馬鈴薯，因此玉米淀粉是最適合作為冷凍的食物。因為直鏈淀粉更易回生[28]，含有此類淀粉的冷凍食物在加工中應避開這些可以使直鏈淀粉含量達到最大值的參數(shù)。Wang等[29]認為在凍融處理過程中凝膠的彈性變化可以歸結為淀粉分子聚集的增加及水的塑化作用的減小。本文的結果表明前者可能是主要因素，因為直鏈淀粉含量的變化較大而且它比支鏈淀粉聚合的快。

表1 小麥淀粉在不同條件下凍融處理時直鏈淀粉含量的變化Table 1 Variations of amylose contents in wheat under different freezing-thawing treatments

表2 甘薯淀粉在不同條件下凍融處理時直鏈淀粉含量的變化Table 2 Variations of amylose contents in sweet potato under different freezing-thawing treatments

表3 馬鈴薯淀粉在不同條件下凍融處理時直鏈淀粉含量的變化Table 3 Variations of amylose contents in potato under different freezing-thawing treatments

表4 玉米淀粉在不同條件下凍融處理時直鏈淀粉含量的變化Table 4 Variations of amylose contents in maize under different freezing-thawing treatments

2.2 分子量分布圖

圖1為4種淀粉的分子量分布圖。

圖1 凍融前后4種淀粉的分子量分布圖Fig.1 Molecular weight distribution curve before and after freeze-thaw treatments

從圖1可以看出，小麥，甘薯，馬鈴薯和玉米4種淀粉在凍融處理前后的摩爾分子量分布分別為：6.9×105～77.9（前）2.7×104～77.9（后），7.4×105～77.9（前）7.4×105～77.9（后），6.9×105～77.9（前）8.5×103～77.9（后）和 6.9×105～77.9（前）3.7×103～77.9（后）。這一結果與 Hizukuri等[30]報道一致，但甘薯的分子量大大低于我們之前的報道[31]，這可能由于淀粉來源于不同植物?？梢钥闯?，沒有經(jīng)過凍融處理的淀粉有含有較多的大分子量鏈，而凍融后的淀粉有較多小分子量鏈。分子量分布曲線根據(jù)不同的分子質量分成不同的區(qū)域，歸一化面積與分子量 M的對數(shù)值 lnM之間的關系如圖 2所示。

圖2可以清晰表示出4種淀粉不同范圍分子量在凍融前后的變化趨勢。在凍融處理后，4種淀粉中低分子量部分均顯著的增加。小麥淀粉里低分子量鏈的含量超過70%，對于甘薯淀粉，凍融后該部分含量從34%增加到了53%，而馬鈴薯和玉米淀粉中該部分的含量在凍融處理后達到100%。這表明部分支鏈斷裂且鏈長變短導致淀粉分子量的減小。

2.3 鏈長分布

通過HPAEC測定淀粉在凍融前后的鏈長分布，結果如圖3所示。

圖2 歸一化面積與分子量M的對數(shù)值lnM關系圖Fig.2 Normalized area (%) to molecular weight log value lnM

圖3 4種淀粉凍融前后鏈長分布比較Fig.3 Chromatograms comparison of four kinds of starches before and after freeze-thawing treatments

所測結果與文獻[32]所述不同，該文獻只描述了支鏈的鏈長分布。本文樣品中不僅包含原有的直鏈，還包括用支鏈淀粉酶脫支得到的直鏈（如圖4）。

由圖 4可見，凍融處理后聚合度（葡萄糖的數(shù)目）變化明顯。高聚合度的多糖的含量降低而低聚合度的多糖明顯升高。

由圖4可以看出，在小麥淀粉中，5糖，6糖和7糖質量分數(shù)下降較多，分別下降了76.5%、71.3%和70.7%，而2糖的質量分數(shù)上升最多，上升了35.8%；在甘薯淀粉中，質量分數(shù)明顯減少的是10、11、13糖，分別減少了43.8%、46.7%和44.4%，而2糖、3糖和4糖質量分數(shù)增多，分別增加了389.4%、122.3%和109.4%。在馬鈴薯淀粉中，5糖和6糖下降較多，質量分數(shù)分別下降了58.4%和54.9%，同時2糖、3糖和4糖明顯增多，分別增加了72.9%、180.8%和57.9%。在玉米淀粉中，7糖、8糖和9糖下降較多，其質量分數(shù)分別下降了 85.0%、80.3%和79.4%，而3、4、5糖的質量分數(shù)增加較多，分別增加了101.5%、32.4%和212.8%。

圖4 凍融前后4種淀粉葡萄糖殘基數(shù)目分布比較Fig.4 Comparison of percentage of dextrose number distribution in four kinds of starch chains before and after freeze-thawing treatments

通過對 4種淀粉在凍融處理過程中葡萄糖數(shù)目的增減，推論出4種淀粉中支鏈淀粉鏈長的斷裂模式，如圖5所示。

對于小麥支鏈淀粉，凍融解凍過程支鏈淀粉中側鏈長度為5、6、7個葡萄糖殘基的側鏈對應3種可能的斷裂方式：2+2+1、2+2+2及2+2+2+1；對于甘薯支鏈淀粉，支鏈淀粉中側鏈長度為10、11和13個葡萄糖殘基的側鏈對應 3種可能的斷裂方式：3+3+4、2+2+3+4及2+2+2+3+4；對于馬鈴薯支鏈淀粉，支鏈淀粉中側鏈長度為5和6個葡萄糖殘基的側鏈對應3種可能的斷裂方式：2+3、2+4、3+3；而玉米支鏈淀粉中，支鏈淀粉中側鏈長度為7、8、9個葡萄糖殘基的側鏈對應3種可能的斷裂方式：2+5，3+5，和3+3+3（其中1表示1個葡萄糖；2表示含2個葡萄糖的麥芽糖、3表示含3個葡萄糖的麥芽多糖、4表示含4個葡萄糖的麥芽多糖和5表示含5個葡萄糖的麥芽多糖）。換句話說，培育合成特定鏈長側鏈少的植物品種（小麥為側鏈長度為 5、6、7葡萄糖；甘薯為側鏈長度為10、11、13葡萄糖；馬鈴薯為側鏈長度為5、6葡萄糖；玉米為側鏈長度為7、8、9葡萄糖）就有可能解決文獻[33]中出現(xiàn)的淀粉凍融后性質發(fā)生明顯變化的問題，因為這些淀粉中經(jīng)凍融處理容易發(fā)生斷裂的側鏈比較少。

圖5 依據(jù)鏈長分布得到的4種支鏈淀粉可能斷裂方式Fig.5 Possible breakage way of four amylopectins based on Chain length distribution researches

2.4 形態(tài)特性

通過顯微照片（圖6）和掃描電子顯微鏡（圖7）可以看出，原淀粉顆粒、未凍融顆粒（即凝膠淀粉）及凍融后淀粉在形態(tài)上發(fā)生了顯著的變化。對于未凍融處理的淀粉（圖 6a1-d1）凝膠化后淀粉顯微圖中存在很多溶脹但未破裂的顆粒，但是凍融處理后凝膠化淀粉（圖 6 a2-d2）中未脹破顆粒極少，僅在小麥和馬鈴薯淀粉有少量存在，說明這2種淀粉球更抗凍融處理。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是由于這2類淀粉的顆粒分布范圍較寬[34-35]，一些小顆粒膨脹但是很難破裂。有文獻報道，荸薺淀粉的顆粒結構只要經(jīng)過7次凍融處理后，幾乎全部破裂[29]。這一原因有待進一步研究，以便培育出具有抗凍融特性的新植物品種。

圖6 光學顯微照片F(xiàn)ig.6 Optical micrographs

圖7 為4種原淀粉、未凍融凝膠化淀粉和凍融后的凝膠化淀粉的SEM照片，其中，原淀粉（a1-d1; a2-d2）；未凍融凝膠淀粉（a3-d3），凍融后凝膠淀粉（a4-d4）。由圖7 a1-d1, a2-d2可見，原淀粉顆粒表面光滑，呈圓形或橢圓形，與文獻[36]一致。然而，由圖7 b2-1和圖7d2-1可以很明顯的看出，在放大倍數(shù)超過4 000倍后，甘薯和玉米淀粉顆粒表面變得粗糙，而這些粗糙的表面可能非常利于吸收水分從而使顆粒膨脹。在圖7a2-1，小麥淀粉顆粒嵌入了胚乳組織且更多的非顆粒物質出現(xiàn)。與凝膠淀粉（圖 7a3-d3）相比，凍融后淀粉（圖 7a4-d4）最顯著的區(qū)別是出現(xiàn)了分層的結構，而這與文獻[6]報道一致。

圖7 SEM照片F(xiàn)ig.7 Scanning electron micrograph

3 結 論

凍融處理后更多淀粉球破裂導致更多直鏈淀粉從淀粉球中析出導致第一次直鏈淀粉含量增加；支鏈淀粉斷裂成直鏈淀粉導致第二次直鏈淀粉含量增加。通過試驗找到了 4種淀粉凍融過程直鏈淀粉含量達到最大值時冷凍時間，即對小麥、甘薯和馬鈴薯淀粉為冷凍處理48 h，對玉米淀粉為 72 h。含有小麥、甘薯、馬鈴薯和玉米淀粉的淀粉類食物，其冷凍貯藏時間不應超過72 h。4種淀粉的易斷裂側鏈不同，表明具有相同葡萄糖基的鏈在不同淀粉顆粒中的空間結構和排列方式不同。冷凍時，有些空間排列的鏈容易斷裂，通過深入研究和控制這些側鏈的空間排列，有望大大提高淀粉質食品的凍融穩(wěn)定性品質。

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