桂枝茯苓丸對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥血管生成的抑制作用及機制研究

林立鵬 劉澤濱 吳曉賓

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis)是一種婦科常見病，但目前對其發(fā)病機制沒有較好的敘述，不過目前認為其依賴于血管生成和血液供應(yīng)[1]。目前對子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制進行深入研究，而隨著研究不斷進行，社會各界基本已經(jīng)認定了子宮內(nèi)膜種植學(xué)說。桂枝茯苓丸本身具有活血化瘀功效，用于子宮內(nèi)膜異位癥治療，但其具體作用機制不明[2]。本研究主要通過大鼠在服用桂枝茯苓丸后體內(nèi)VEGF和HIF-1α變化情況，進行桂枝茯苓丸作用機制研究。

1 實驗材料

1.1 藥物和試劑

桂枝茯苓丸：由桂枝、牡丹皮、桃仁、茯苓、赤芍各9 g構(gòu)成[3]。

孕三烯酮：孕三烯酮膠囊(北京紫林藥業(yè)有限公司，2.5毫克/粒，批號：國藥準字H19980020)。

1.2 實驗對象

雌SD大鼠共40只，均選自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號SCXK(滬)2007-0005，飼養(yǎng)環(huán)境溫度在25 ℃，相對濕度60%，大鼠均自由進食、飲水[4]。飼養(yǎng)足月后，確保大鼠體重在180～200 g，建立大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型，此外無其他疾病，且大鼠均能正常攝取藥物。

1.3 儀器

電子天平(德國)、BX41型顯微鏡(日本)和ABI7500型實時定量PCR儀(美國)。

2 方法

2.1 造模分組以及給藥

共40只大鼠，其于按照標準分為4組。模型對照組不給予任何藥物；低劑量桂枝茯苓丸組每天給予0.5 g桂枝茯苓丸；高劑量桂枝茯苓丸組每天給予3.0 g桂枝茯苓丸；孕三烯酮組每天給予孕三烯酮2 g。其中桂枝茯苓丸ig,1天1次；孕三烯酮,ig，1周2次，共治療4周。治療4周后，將所有大鼠全部處死，并獲取每個大鼠異位子宮內(nèi)膜，將所有標本分為2份，進行PCR檢測[5]。

2.2 VEGF含量測量

采用ELISA法，處死大鼠后，切開腹膜，往大鼠腹腔內(nèi)注入生理鹽水，搖動大鼠，直至腹腔全部充滿。收集灌洗液，在4 ℃和500 r/min環(huán)境下離心10 min，利用上層清液測定VEGF含量[6]。

2.3 HIF-1α中mRNA的表達檢測

采用PCR法。將內(nèi)膜組織放入玻璃勻漿器，研磨至出漿。加入微量三氯甲烷，震蕩后靜置，在4 ℃和12 000 r/min環(huán)境中離心10 min。將上層清液移至新EP管中，加入異丙醇，混勻后靜置10 min，再次離心15 min，棄上清液。向沉淀物中加入1 mL DEPC水和乙醇混合液，再次離心，棄上清液。自然干燥后加水溶解，冷凍存儲[7]。

2.4 PCR檢測

根據(jù)實際和說明書，可得到下列引物列表，見表1。

表1 引物序列

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠VEGF表達

模型對照組VEGF陽性率表達最高，而高劑量桂枝茯苓丸VEGF陽性率表達最低，見表2。

表2 各組大鼠VEGF表達 (%)

注：1)數(shù)據(jù)明顯高于其他組，P<0.05；2)數(shù)據(jù)明顯低于其他組，P<0.05

3.2 各組大鼠HIF-1α表達

模型對照組HIF-1α最高，高劑量桂枝茯苓丸HIF-1α最低，見表3。

組別nHIF-1α模型對照組10139±271)低劑量桂枝茯苓丸10109±13高劑量桂枝茯苓丸1082±142)孕三烯酮組10114±8

注：1)數(shù)據(jù)明顯高于其他組，P<0.05；2)數(shù)據(jù)明顯低于其他組，P<0.05

4 討論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展出現(xiàn)，血管生成理論得到進一步發(fā)展，越來越多證據(jù)表明血管生成在子宮內(nèi)膜的生長修復(fù)中起到很大作用，而且在子宮內(nèi)膜異位癥的治療和發(fā)展中占據(jù)重要位置[8]。新生血管可以為子宮內(nèi)膜異位病灶提供所需氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，血管生成是子宮內(nèi)膜病灶增殖和種植的必要條件。單核巨噬細胞在免疫反應(yīng)中起到重要作用，能夠反饋免疫應(yīng)答。當(dāng)外來細胞進入人體后，單核巨噬細胞提供識別作用，也為向T細胞提呈抗原作用。在腹腔當(dāng)中，巨噬細胞會通過自身功能對外來細胞進行消除，以及對細胞碎片進行吞噬。在本次實驗研究中，可以發(fā)現(xiàn)巨噬細胞數(shù)量明顯增加，當(dāng)其功能被過度激活時，TNF-α、IL-8和VEGF水平也會大幅度增加。在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，影響腹腔中子宮內(nèi)膜上巨噬細胞增多的原因有以下幾個方面： ①子宮內(nèi)膜異位患者腹腔液成分與正常人有所差異，極有可能導(dǎo)致巨噬細胞活性程度增加；②子宮內(nèi)膜異位組織分泌的活性物質(zhì)導(dǎo)致巨噬細胞活性增強。而且在子宮內(nèi)膜異位患者當(dāng)中，巨噬細胞凋亡率會大大降低，而且生命周期會出現(xiàn)一定程度改變。在基因表達中，Bcl-2基因表達大大增強，而Bax基因表達受到抑制，會使細胞抗凋亡能力進一步增加。

IL-8與VEGF類似，都是單核巨噬細胞分泌的一種細胞因子。血管新生本身具備多個復(fù)雜步驟，需要多個生長因子和細胞因子參與，特別是VEGF，是刺激生長的關(guān)鍵因子[9]。在本次研究中發(fā)現(xiàn)，患有子宮內(nèi)膜異位癥大鼠腹腔液中VEGF的含量明顯高于正常大鼠。而且根據(jù)之前研究顯示[10-11]，子宮內(nèi)膜異位癥嚴重程度與腹腔液中分泌的VEGF含量呈正相關(guān)，而本次實驗中，模型對照組VEGF陽性率表達最高，而高劑量桂枝茯苓丸VEGF陽性率表達最高，而且經(jīng)過桂枝茯苓丸28 d治療后，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠腹腔液中VEGF含量出現(xiàn)下降趨勢。其次，在HIF-1α的mRNA檢測中發(fā)現(xiàn)，桂枝茯苓丸可以抑制VEGF表達。

桂枝茯苓丸是一種中成藥，也是一種理血劑，具有活血、化瘀、消癥等功效。該藥物主要包含桂枝、茯苓、丹皮、桃仁、芍藥等中藥材，其中桂枝主要可以能夠散寒止痛、溫經(jīng)驅(qū)寒、活血化瘀、溫養(yǎng)經(jīng)絡(luò)；茯苓可以健脾靜心、利水滲濕，有利于腰臍間血；丹皮、芍藥、桃仁也可以幫助患者活血化瘀，此外芍藥還具有養(yǎng)血活血的功效。子宮內(nèi)膜異位癥會經(jīng)歷一個缺氧環(huán)境，在HIF-1α和VEGF形成的通路之下，降低氧含量會促進血管生成因子的出現(xiàn)。而且在氧氣不足的條件下，環(huán)境會促進VEGF表達，而桂枝茯苓丸會調(diào)整異位病灶中HIF-1α表達水平。

子宮內(nèi)膜異位癥在轉(zhuǎn)移這一特點上與惡性腫瘤類似，其中，細胞基質(zhì)的降解和重建是關(guān)鍵因素。桂枝茯苓丸是治療子宮內(nèi)膜異位癥的傳統(tǒng)中藥方，無論是單獨使用還是與西藥結(jié)合使用，均能取得良好的治療效果，在短時間減輕/緩解內(nèi)子宮內(nèi)膜異位癥患者疼痛，縮小內(nèi)膜異位腫塊。此外，桂枝茯苓丸還能夠有效縮小異位內(nèi)膜組織。桂枝茯苓丸被患者服用后，可讓患者前列腺素得到有效平衡，縮小與正常人前列腺素差距。而且桂枝茯苓丸還有一定緩解子宮平滑肌痙攣的作用。在子宮內(nèi)膜異位患者中，桂枝茯苓丸能直接明顯的降低MMP-2和MMP-9在子宮內(nèi)膜異位組織中的表達，之后可以抑制子宮異位內(nèi)膜的侵襲、轉(zhuǎn)移和種植，從根本上解決子宮內(nèi)膜異位癥的致病原因，也從側(cè)面反應(yīng)出子宮內(nèi)膜異位癥多靶點特點。

孕三烯酮(Gestrinone)是一種中等強度激素類藥物，具有很強的抗雌激素活性和抗孕激素活性的作用，主要通過抗雌激素的方式治療子宮內(nèi)膜異位癥，約束病灶生長。在研究中發(fā)現(xiàn)，孕三烯酮能降低VEGF表達，限制病灶增長，其整體水平超過低劑量桂枝茯苓丸，但明顯低于高劑量桂枝茯苓丸。但孕三烯酮卻無法抑制HIF-1α表達，故而整體治療效果要低于大劑量桂枝茯苓丸。此外，在其他研究中還發(fā)現(xiàn)，其作用類似于黃體酮，均會使子宮內(nèi)膜失活并退化。通過以上結(jié)果，可以分析出，桂枝茯苓丸和孕三烯酮本身作用機制存在一定差異，桂枝茯苓丸不僅能夠降低VEGF水平，還能夠減少HIF-α表達，阻礙子宮內(nèi)膜異位病灶區(qū)生長，使其內(nèi)部血管生成出現(xiàn)阻礙，抑制子宮內(nèi)膜異位癥病情發(fā)展。而桂枝茯苓丸還具有一定對雌激素和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的作用，但更深層的作用機制還有待研究。

綜上所述，桂枝茯苓丸能抑制子宮內(nèi)膜異位癥血管生成，其機制與抑制VEGF和HIF-1α有關(guān)。

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