金納米粒子模擬過(guò)氧化物酶的初步研討

劉競(jìng)文，關(guān)樺楠，張家成

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150076）

金納米粒子是目前所發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)貴金屬納米材料。帶正電荷或者帶負(fù)電荷的金納米粒子，其金納米粒子表現(xiàn)出類(lèi)似的過(guò)氧化物酶的催化活性[1-2]。Wang S等人[3]研究表明，模仿過(guò)氧化物酶的催化能力是來(lái)自黃金納米粒子的本身。修飾的金納米粒子表面改變修飾劑和底物的結(jié)合能力，最終控制了納米粒子的催化活性。

金納米粒子在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)等領(lǐng)域有著較為廣泛的應(yīng)用，而且與葡萄糖氧化酶、葡萄糖催化能力極其相似。基于有過(guò)氧化物酶性質(zhì)的雙金屬合金納米粒子Ag@M（M-Pt，Au和Pd），也有一些酶的性質(zhì)[4]。以弱還原劑還原雙金屬離子制備了銀基雙金屬中空-介孔納米材料，其催化活性可以通過(guò)不同比例的2種金屬調(diào)整，這是除了規(guī)定的大小和酶的催化能力外模擬調(diào)節(jié)有效方法。

天然酶因其催化效率高和反應(yīng)特異性較強(qiáng)，在醫(yī)藥、化工、食品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。然而，天然酶容易受環(huán)境的影響而失去催化活性。此外，制備、純化和貯藏時(shí)浪費(fèi)時(shí)間比較多。因此，研究和開(kāi)發(fā)具有催化活性的來(lái)源豐富、價(jià)格低廉及穩(wěn)定的仿照酶具有重要意義。納米材料因其表面效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)而在許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[5-6]。氧化物納米材料與碳基納米材料、貴金屬納米材料已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并摹仿了酶的特性。與天然酶（Natural enzyme） 相比較，仿照酶具有催化活性高、穩(wěn)定性好、可控合成的成本低等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。基于此，試驗(yàn)采用的葡萄皮浸泡液進(jìn)行綠色還原法制備金納米粒子，對(duì)其進(jìn)行表征，并窺探金納米粒子的過(guò)氧化物酶仿照酶活性，確定仿照酶催化體系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙氧水、碳酸鉀、硼氫化鈉、乙酸、乙醇，上海振興化工一廠提供；氯金酸，天津市華東試劑廠提供，以上試劑均為分析級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

H-7500型透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社產(chǎn)品；LDJ 9600型振動(dòng)磁強(qiáng)計(jì)，北京翠海佳誠(chéng)磁電科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品；BT-9300H型激光粒度分布儀，美國(guó)麥克儀器公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 金納米粒子的制備與表征

將100 g的葡萄皮浸泡于水溫為80℃的200 mL去離子水中，自然冷卻至室溫。將浸泡液于離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心3 min，抽取上清液作為母液（即100%工作液）。用去離子水將母液分別濃縮且獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%，20%，10%，1%的母液葡萄皮工作液200 mL，置冰箱4℃條件下保存（不超過(guò)2 d），在室溫條件下，將提前在4℃預(yù)冷的氯金酸溶液（20 mL，1%，W/V） 置于反應(yīng)皿中，伴隨磁力攪拌器溫和攪動(dòng)；2 min后，迅速加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（50%，20%，10%，1%） 的工作液5 mL，立即觀察各個(gè)試管中顏料的變化，即系統(tǒng)溶液顏料由黃色變?yōu)樽仙僮優(yōu)榫萍t色，當(dāng)溶液顏料出現(xiàn)酒紅色時(shí)，攪拌速度加快，20 min后結(jié)束反應(yīng)，并將反應(yīng)液放在冰箱4℃條件下保存。

吸取1 mL的金納米粒子溶膠后加入到比色皿中，立即再加入2 mL的去離子水，然后混合均勻，放于紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)中，掃描金納米粒子的吸收光譜，確定最大吸收峰波長(zhǎng)（520～550 nm），比較不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的浸泡液所制備金納米粒子的可見(jiàn)光吸收光譜，從而初步判別金納米粒子的粒徑與含量。溶液中金納米粒子的粒度分布情況由激光粒度儀來(lái)窺探。觀察金納米粒子的表觀形貌用透射電子顯微鏡。

1.3.2 單要素優(yōu)化金納米粒子模擬酶催化體系

（1）H2O2濃度對(duì)催化體系的影響。將1 mL的金納米粒子溶膠加入到盛有5m L的HCl-NaAc緩沖液（pH值5） 的離心管中，再依次加入200 μL的四甲基聯(lián)苯胺溶液（TMB，25 mmol/L)）和500 μL的H2O2（0.05，0.10，0.25，0.50，1.00 mol/L），混合均勻后，將反應(yīng)體系放置于40℃的水浴鍋中，水浴10 min后取出（水浴行程中每過(guò)1 min溫和倒轉(zhuǎn)1次），吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空缺，測(cè)定于波長(zhǎng)652 nm處吸光度，重復(fù)試驗(yàn)3次。

（2）催化溫度對(duì)催化體系的影響。將1 mL金納米粒子溶膠加入到盛有5 mL的HCl-NaAc緩沖液（pH值5） 的離心管中，再依次加入200 μL的四甲基聯(lián)苯胺溶液 （TMB，25 mmol/L） 和 500 μL的H2O2（1.00 mol/L），混勻后，將反應(yīng)體系放置于不同催化溫度（30，35，40，45，50℃） 水浴鍋中，水浴10 min后（水浴行程中每過(guò)1 min溫和倒轉(zhuǎn)1次）取出，靜置1 min，吸取上清液3 mL，蒸餾水為空缺，測(cè)定于波長(zhǎng)652 nm處吸光度，重復(fù)試驗(yàn)3次。

（3）催化時(shí)間對(duì)TMB濃度體系的影響。將1 mL金納米粒子溶膠加入到盛有5 mL HCl-NaAc緩沖液（pH值5） 的離心管中，再依次加入200 μL的四甲基聯(lián)苯胺溶液（TMB，25 mmol/L） 和500 μL的H2O2（1.00 mol/L），混勻后，將反應(yīng)體系放置于40℃水浴鍋中，水浴不同催化時(shí)間（5，10，15，20，25 min）后取出（水浴行程中每過(guò)1 min溫和倒轉(zhuǎn)1次），靜置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空缺，測(cè)定于波長(zhǎng)652 nm處吸光度，重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.3.3 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化金納米粒子模擬酶催化體系

分別窺探H2O2濃度（A）、催化溫度（B） 和催化時(shí)間（C）對(duì)整個(gè)試驗(yàn)體系的影響，每種要素設(shè)計(jì)3個(gè)水平（根據(jù)單要素試驗(yàn)優(yōu)化得出），選用L9（34）正交表優(yōu)化試驗(yàn)方案。

因素程度見(jiàn)表1。

表1 因素程度

第3列為空列，作為誤差來(lái)源，撥取直觀闡述法確定要素影響的主次依序及優(yōu)選方案，采用方差闡述法確定要素對(duì)體系的影響程度。根據(jù)正交設(shè)計(jì)表，分別制備不同的處理，將1 mL金納米粒子溶膠加入到盛有5 mL的HCl-NaAc緩沖液（pH值5） 離心管中，再依次加入200 μL的四甲基聯(lián)苯胺溶液（TMB，25 mmol/L） 和 500 μL 的 H2O2（單因素優(yōu)化結(jié)果），混勻后，將反應(yīng)體系放置于水浴鍋中（催化溫度為單因素優(yōu)化結(jié)果），水浴一段催化時(shí)間（單因素優(yōu)化結(jié)果）后取出（水浴行程中每過(guò)1 min溫和倒轉(zhuǎn) 1次），靜置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空缺，測(cè)定于波長(zhǎng)652 nm處吸光度，目標(biāo)越大越好，重復(fù)試驗(yàn)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 金納米粒子的表征

在金納米粒子眾多的制備方法中，最常見(jiàn)的就是化學(xué)還原制備法，其原理是向一定濃度的金離子溶液中加入化學(xué)還原劑，將三價(jià)態(tài)的金離子還原為零價(jià)態(tài)的金，從而制備出金納米粒子。借鑒此原理，選擇含有豐富還原性物質(zhì)的葡萄皮浸泡液制備金納米粒子。葡萄皮浸泡液含有豐富的抗壞血酸和黃酮類(lèi)物質(zhì)，具有良好的還原性，可以制備金納米粒子。

葡萄皮浸泡母液及不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)葡萄皮浸泡液制備的納米粒子溶膠見(jiàn)圖1。

在試驗(yàn)的操作行程中可以清晰地看到，反應(yīng)溶液由黃色變?yōu)樽仙僮優(yōu)榫萍t色，說(shuō)明有金納米粒子的生成。為了探究不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)葡萄皮浸泡液所制備金納米粒子的性能區(qū)別，將對(duì)所制備的金納米粒子進(jìn)行體系的表征。

圖1 葡萄皮浸泡母液及不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)葡萄皮浸泡液制備的納米粒子溶膠

紫外-可見(jiàn)吸收光譜是研討膠體金的常用方法，紫外-可見(jiàn)光譜對(duì)高分散和締合態(tài)存在的金屬顆粒有完全不同的響應(yīng)，通過(guò)闡述其譜圖，可以得到有關(guān)顆粒大小和形狀等重要信息。在波長(zhǎng)520 nm附近出現(xiàn)的吸收峰，可被指認(rèn)為金納米顆粒的等離子共振紫外吸收特征峰，此吸收峰的位置、形狀與顆粒的大小、形狀與分散狀態(tài)密切相關(guān)。根據(jù)Mie理論，金納米粒子會(huì)在波長(zhǎng)520 nm左右出現(xiàn)明顯的吸收峰。

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)葡萄皮浸泡液制備金納米粒子的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜見(jiàn)圖2。

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)葡萄皮浸泡液制備金納米粒子的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜

根據(jù)圖2中的結(jié)果顯示，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的浸泡液所制備的金納米粒子在粒徑和含量上具有較明顯的區(qū)別。紫外-可見(jiàn)光吸收光譜的結(jié)果表明，4種質(zhì)量分?jǐn)?shù)葡萄皮浸泡液所制備的金納米粒子在波長(zhǎng)530～569 nm范圍內(nèi)具有明顯的吸收峰，根據(jù)吸光度值初步判斷，都獲得了金納米粒子。1%，10%，20%浸泡液所制備的金納米粒子，在波長(zhǎng)540 nm附近出現(xiàn)了特征吸收峰。但是，伴隨著浸泡液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而峰值逐漸下降，說(shuō)明金納米粒子生成的數(shù)量伴隨浸泡液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高而在減少，原因可能是葡萄皮中除含有還原性物質(zhì)之外還含有高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的大分子物質(zhì)（如氨基酸或者有機(jī)酸等），這類(lèi)物質(zhì)反而抑制了金種的生長(zhǎng)，造成金種的聚集，使其無(wú)法獲得合適粒徑的金納米粒子。與此同時(shí)，50%浸泡液所制備的金納米粒子吸收峰發(fā)生偏移，說(shuō)明金納米粒子整體粒徑變大，催化性能下降，不宜用于下一步試驗(yàn)。

分別在1%，10%，20%的3個(gè)浸泡液質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，所合成金納米粒子的粒徑大小區(qū)別較大。根據(jù)吸收峰波長(zhǎng)位置，初步判定3種質(zhì)量分?jǐn)?shù)浸泡液所制備出的金納米粒子粒徑都在可接受的范圍內(nèi)，由小到大依次為1%，10%，20%浸泡液質(zhì)量分?jǐn)?shù)。因此，選擇這3種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的浸泡液所制備的金納米粒子參與下面的試驗(yàn)。

針對(duì)篩選的3種質(zhì)量分?jǐn)?shù)葡萄皮浸泡液所制備出的金納米粒子，采用透射電子掃描顯微鏡觀察其外觀形貌和粒徑大小。

透射電子掃描顯微鏡圖片見(jiàn)圖3。

圖3 透射電子掃描顯微鏡圖片

由圖3可知，3種質(zhì)量分?jǐn)?shù)浸泡液所制備出的金納米粒子形狀均一，基本呈現(xiàn)圓球形。其中，1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)浸泡液所制備出的金納米粒子分散度最好，基本沒(méi)有聚集；而10%和20%質(zhì)量分?jǐn)?shù)浸泡液所制備出的金納米粒子都呈現(xiàn)出不同程度的聚集，衡量金納米粒子的聚集情況決定了金納米粒子的穩(wěn)定性。由激光粒度儀測(cè)定結(jié)果可知，1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)浸泡液所制備出的金納米粒子平均粒徑約為7 nm；10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)浸泡液所制備出的金納米粒子平均粒徑約為10 nm；20%質(zhì)量分?jǐn)?shù)浸泡液所制備出的金納米粒子平均粒徑約為8 nm。根據(jù)粒徑越小、活性越強(qiáng)的原理，選擇1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葡萄皮浸泡液所制備的金納米粒子參與模擬酶活性試驗(yàn)。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果闡述

2.2.1 H2O2濃度對(duì)催化體系的影響結(jié)果

由于TMB的反應(yīng)產(chǎn)物為深藍(lán)色，且反應(yīng)產(chǎn)物越聚越大，所以顏色越深說(shuō)明模擬酶催化活性越大，根據(jù)此特點(diǎn)來(lái)測(cè)定于波長(zhǎng)652 nm處H2O2濃度的吸光度，并確定用吸光度作為單因素優(yōu)化的評(píng)定目標(biāo)，窺探不同H2O2濃度對(duì)催化體系的影響。

H2O2濃度對(duì)催化體系的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，H2O2濃度對(duì)催化體系有直接影響。H2O2濃度在0.05～0.25 mol/L時(shí)，隨著H2O2濃度的增長(zhǎng)催化效率越來(lái)越高。H2O2濃度在0.25～1.00 mol/L時(shí)，對(duì)反應(yīng)催化效率越來(lái)越低。在模擬酶催化體系中H2O2濃度取 0.10，0.25，0.50 mol/L。

2.2.2 催化溫度對(duì)催化體系的影響結(jié)果

圖4 H2O2濃度對(duì)催化體系的影響結(jié)果

采用單因素變量法選定模擬酶活性試驗(yàn)不同因素的最適程度。首先，選取穩(wěn)定H2O2濃度（1.0 mol/L），催化時(shí)間30 min時(shí)。由于TMB的反應(yīng)產(chǎn)物為深藍(lán)色，且反應(yīng)產(chǎn)物越聚越大，所以顏色越深說(shuō)明催化活性越大，通過(guò)測(cè)定于波長(zhǎng)652 nm處的吸光度，并以吸光度作為單因素優(yōu)化的評(píng)定目標(biāo)，窺探不同催化溫度對(duì)催化體系的影響。

催化溫度對(duì)催化體系的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 催化溫度對(duì)催化體系的影響結(jié)果

由圖5可知，催化溫度在30～40℃時(shí)，隨著催化溫度的增長(zhǎng)，催化效率越來(lái)越高，40℃時(shí)催化效率達(dá)到最高值，隨后隨著催化溫度上升而下降，說(shuō)明納米金的催化能力在40℃最強(qiáng)。選取35，40，45℃為正交因素。

2.2.3 催化時(shí)間對(duì)催化體系的影響結(jié)果

采用單因素變量法選定模擬酶活性試驗(yàn)不同因素的最適程度。選取穩(wěn)定H2O2濃度（1.0 mol/L），催化溫度40℃，由于TMB反應(yīng)產(chǎn)物有深藍(lán)色，所以通過(guò)測(cè)定于波長(zhǎng)652 nm處的吸光度，并以吸光度作為單因素優(yōu)化的目標(biāo)。以吸光度為衡量目標(biāo)，窺探不同催化時(shí)間對(duì)催化體系的影響。

催化時(shí)間對(duì)催化體系的影響結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 催化時(shí)間對(duì)催化體系的影響結(jié)果

由圖6可知，隨著催化時(shí)間的增長(zhǎng)催化效率越來(lái)越高，但最終趨于平緩。出于經(jīng)濟(jì)效益的考慮，在5～10 min時(shí)，對(duì)反應(yīng)催化效率越來(lái)越低。在模擬酶催化體系中催化時(shí)間取15，20，25 min。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化模擬酶催化反應(yīng)體系

試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇3個(gè)較好程度，其中選取H2O2濃度（A）、催化溫度（B） 和催化時(shí)間（C）對(duì)整個(gè)試驗(yàn)的影響。以于波長(zhǎng)652 nm處的吸光度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）做正交試驗(yàn)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，再通過(guò)極差闡述確定最佳工藝條件。

正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2闡述可得，使用DPS軟件進(jìn)行極差闡述得出數(shù)據(jù)，根據(jù)試驗(yàn)各因素模擬催化酶體系的影響力，其影響主次因素依序?yàn)锳＞B＞C，即H2O2濃度＞催化溫度＞催化時(shí)間。而通過(guò)極差分析來(lái)確定最優(yōu)方案組合，最優(yōu)方案組合為A2B1C2，即H2O2濃度0.25 mol/L，催化溫度35℃，催化時(shí)間20 min。綜上所述，催化時(shí)間是影響模擬酶催化體系的主要因素，H2O2濃度和催化溫度對(duì)模擬酶體系也有一定的影響。

3 結(jié)論

采用綠色合成法制備金納米粒子，并采用單因素試驗(yàn)及正交表設(shè)計(jì)優(yōu)化金納米粒子模擬酶催化活性體系，為探究催化溫度、催化時(shí)間和H2O2濃度對(duì)試驗(yàn)體系的影響，得到如下的試驗(yàn)結(jié)果：

（1）不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)浸泡液所制備的金納米粒子在粒徑和含量上具有較明顯的區(qū)別，1%，10%，20%質(zhì)量分?jǐn)?shù)浸泡液所制備出的金納米粒子粒徑分別為 7，10，8 nm。

（2）通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的結(jié)果，試驗(yàn)得出各要素模擬催化酶體系的影響，其主次依序?yàn)锳＞B＞C，即H2O2濃度＞催化溫度＞催化時(shí)間。通過(guò)極差闡述來(lái)確定最優(yōu)的方案組合，最優(yōu)方案組合為A2B1C2，即H2O2濃度0.25 mol/L，催化溫度35℃，催化時(shí)間20 min。綜上所述，反應(yīng)時(shí)間是影響模擬酶催化體系的主要因素。

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