嚴(yán) 俊, 盧國豐, 王 純, 閔 新

(上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院1. 腫瘤科; 2. 病理科, 上海201800)

惡性腹水是腫瘤細(xì)胞浸潤或分泌引起的腹腔內(nèi)非正常的液體累積，是多種惡性腫瘤發(fā)展晚期的常見并發(fā)癥之一。研究報(bào)道[1,2]惡性腹水可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，其平均生存期約為20周。目前，惡性腹水的治療方法包括穿刺療法、利尿劑療法及腹腔分流術(shù)。其中腹腔分流術(shù)及腹腔注射化療藥物的方法較為常見。然而，腹腔注射化療藥物治療腹水的有效率僅40%～60%，可能與腫瘤細(xì)胞化療藥物抵抗性或血管生成密切相關(guān)。因此，緩解腫瘤患者惡性腹水是目前臨床亟待解決問題。

腹膜毛細(xì)血管通透性增加是產(chǎn)生惡性腹水的重要原因之一; 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)對于刺激血管生成，增加血管通透性起到重要作用[2]。因此，抗VEGF治療可能是治療惡性腹水的理想方式之一。內(nèi)皮抑素(endostatin)是VEGF的有效抑制劑。早期內(nèi)皮抑素由O'Reilly[3]從小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中分離得到，是膠原蛋白XVIII的羧基末端蛋白水解片段。內(nèi)皮抑素可顯著抑制VEGF引起的上皮細(xì)胞增生及抑制血管生成和腫瘤生長[4]。然而, 膠原蛋白XVIII穩(wěn)定性較差，生化活性較低，且造價(jià)昂貴，在臨床應(yīng)用受到了極大限制。恩度(Endostar)是大腸桿菌中表達(dá)和純化的改良性內(nèi)皮抑素[5]。與內(nèi)皮抑素相比，恩度在N端增加了9個(gè)氨基酸序列，從而提高了穩(wěn)定性和生物活性。并且恩度通過大腸桿菌表達(dá)生產(chǎn), 可顯著降低生產(chǎn)成本。在2005年恩度被中國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于非小細(xì)胞肺癌的治療[6]。恩度在治療各種晚期惡性腫瘤方面取得了臨床療效[7,8]。

順鉑(Cisplatin, CDDP)是一種含鉑的抗癌藥物，即順式-二氯二氨合鉑(II)，棕黃色粉末，屬于細(xì)胞周期非特異性藥物。順鉑主要通過與腫瘤細(xì)胞DNA單鏈內(nèi)兩點(diǎn)或雙鏈發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，抑制癌細(xì)胞DNA復(fù)制過程，殺傷腫瘤細(xì)胞。目前在對腹水治療方面，順鉑廣泛用于腹腔熱灌注化療，該方法可將有效濃度順鉑持續(xù)分布到腹腔的各個(gè)部位，有利于抗癌藥物與游離癌細(xì)胞充分接觸; 但其療效還依賴于腫瘤的體積大小以及腫瘤類型[9]。

目前，關(guān)于恩度聯(lián)合順鉑治療惡性腹水的有效性證據(jù)仍較為有限，本研究擬確定恩度新型適應(yīng)癥，為其用于治療惡性腹水相關(guān)的晚期癌癥提供理論依據(jù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

選取肝癌細(xì)胞系H-22(購自中科院上海科學(xué)研究所細(xì)胞庫)體外培養(yǎng)。將H-22細(xì)胞復(fù)蘇，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(購自美國Thermol-Fisher公司)的RPMI1640培養(yǎng)基，并將細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2孵箱中培養(yǎng)待用。

1.2 惡性腹水動(dòng)物模型建立

試驗(yàn)選用100只6～7周齡雌性BALB/c小鼠[(購于上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司, SCXK(滬)2013-0016)]。飼養(yǎng)于屏障設(shè)施[SYXK(滬)2017-0011], 自由飲水, 給予滅菌小大鼠專用飼料。將處于對數(shù)生長期的H-22細(xì)胞制成混懸液，腹腔注射給予入8只BALB/c小鼠(3×105個(gè)細(xì)胞/200 μL)體內(nèi)。待小鼠體內(nèi)腹水較多時(shí)以頸椎脫臼法處死動(dòng)物, 抽取腹水,臺酚藍(lán)染色計(jì)數(shù)，PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×106個(gè)細(xì)胞/mL, 每只小鼠腹腔注射200 μL備用細(xì)胞, 共接種90只動(dòng)物。

1.3 分組及動(dòng)物處理

將構(gòu)建成功的荷瘤鼠隨機(jī)分為5組, 每組18只,腹腔注射給藥容量為0.2 mL，給藥期間隔日測量腹圍及體質(zhì)量。給藥用恩度(重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液)購自山東煙臺先聲麥得津生物工程股份有限公司，順鉑購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司(國藥準(zhǔn)字: H20040B13)。所用恩度及順鉑用藥劑量參考產(chǎn)品說明書。具體分組見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

1.4 腹水體積、蛋白濃度、紅細(xì)胞數(shù)量、腫瘤細(xì)胞檢測

實(shí)驗(yàn)期間，隔日稱取動(dòng)物體質(zhì)量，治療結(jié)束后，每組取6只小鼠，用無菌離心管采集腹水樣品，并進(jìn)行蛋白濃度、紅細(xì)胞數(shù)量、腫瘤細(xì)胞的檢測，其余動(dòng)物觀察各組荷瘤壽命，以對照組全部死亡為實(shí)驗(yàn)結(jié)束的節(jié)點(diǎn)。蛋白濃度檢測使用全自動(dòng)生化檢測儀進(jìn)行檢測。

1.5 腹水瘤細(xì)胞中VEGF、Bax，Bcl-2和HIF-1a水平檢測

轉(zhuǎn)膜后，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜在5%BSA中封閉1h，加入適量一抗孵育過夜，之后用PBST洗膜3次，與適量二抗孵育1h，充分洗膜后加入顯影液，使用曝光機(jī)進(jìn)行拍攝。

Western blotting采用Quantity One分析軟件，用矩形選擇工具框選目的條帶, 計(jì)算灰度值, 用條帶框的值減去等大的背景框灰度，得到條帶的灰度值。分別用各實(shí)驗(yàn)組的數(shù)值比照未經(jīng)任何處理的空白小鼠相應(yīng)條帶灰度值，得到標(biāo)準(zhǔn)化的條帶濃度。

1.6 腹水瘤細(xì)胞中VEGF mRNA水平檢測

1.6.1 引物合成 采用Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程公司合成。引物名稱、擴(kuò)增靶基因號及對應(yīng)引物序列見表2。

1.6.2 RNA提取 采用RNA提取試劑盒(購自北京TIANGEN生化，dp419)進(jìn)行提取。

1.6.3 反應(yīng)體系 采用20 μL反應(yīng)體系: 2×Real time PCR Master Mix 10 μL, 模板 1 μL，引物 MIX 2 μL，DEPC 水 7 μL。

1.6.4 PCR 過程 95℃ 5 min→ 95 ℃ 15 s → 60℃30 s → 72℃ 30 s → 45 ℃→ 95℃, 40 個(gè)循環(huán)。

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.6.5 定量方法 以β-actin作為內(nèi)參，各樣本中VEGFmRNA的ct值與同一樣本中的β-actinRNA ct值相減。采用相對定量法，以2-△△Ct公式計(jì)算各樣本中的VEGFmRNA表達(dá)量。

(1) 坡體地質(zhì)條件。項(xiàng)目區(qū)屬構(gòu)造剝蝕高山峽谷的上緩下陡形臺階狀地貌，自然邊坡高約400 m，其上部較緩邊坡坡度約40°，下部陡崖坡度約70°～80°，崖頂與坡腳高差約190 m，坡向50°，線路以大橋的形式從坡腳通過，橋面高出河道約6 m。坡體主要由志留系茂縣群(Smx4)絹云母千枚巖和夾少量條帶—薄層狀變質(zhì)細(xì)砂巖構(gòu)成。由于坡體位于桃坪倒轉(zhuǎn)背斜核部，造成坡體褶皺、擠壓破碎帶發(fā)育。邊坡優(yōu)勢產(chǎn)狀345°∠77°，屬陡傾斜交結(jié)構(gòu)邊坡。項(xiàng)目區(qū)地震動(dòng)峰值加速度0.20 g，地震基本烈度Ⅷ度。下半球赤平投影見圖9，工程地質(zhì)斷面圖見圖10。

1.7 荷瘤小鼠腹水中腫瘤細(xì)胞凋亡檢測

收集各組小鼠腹水約5 mL，加入紅細(xì)胞裂解液，孵育10 min后2 000 r/min離心5 min，收集腫瘤細(xì)胞，并用PBS洗滌2次。加入500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC及Propidium Iodide混勻，室溫避光孵育10 min，采用流式細(xì)胞儀檢測。

1.8 小鼠生存期觀察

記錄每只小鼠生存時(shí)間，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并按下列公式計(jì)算小鼠生命延長率: 生命延長率=(治療組平均生存時(shí)間/對照組平均生存時(shí)間-1)×100%

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用 SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析。連續(xù)變量采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用One-way ANOVA，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用藥物相互作用指數(shù)(coefficient of drug interaction，CDI)來反映兩藥聯(lián)合抑制腹水的作用。根據(jù)以下公式計(jì)算各組小鼠腹水抑制率及CDI，兩藥聯(lián)用CDI值＜1，說明恩度及順鉑具有協(xié)同作用。腹水抑制率=(1-給藥組平均腹水量/生理鹽水組平均腹水量)×100%;CDI=恩度順鉑聯(lián)合給藥腹水抑制率/(單獨(dú)恩度組腹水抑制率×單獨(dú)順鉑組腹水抑制率)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量及腹圍分析

給藥期間各組小鼠體質(zhì)量變化曲線見圖1。重復(fù)測量ANOVA分析顯示, 各實(shí)驗(yàn)組給藥期間體質(zhì)量增長速度均顯著低于生理鹽水組(P=0.012)，其中恩度聯(lián)合順鉑組1小鼠體質(zhì)量增長速度顯著低于單純恩度組(P=0.006)、單純順鉑組(P=0.019)和恩度聯(lián)合順鉑組2(P=0.004)。給藥期間各組小鼠腹圍變化曲線見圖2。重復(fù)測量ANOVA分析顯示，各實(shí)驗(yàn)組給藥期間腹圍增長速度均顯著低于生理鹽水組(P=0.001), 其中恩度聯(lián)合順鉑組1小鼠腹圍增長速度顯著低于單純恩度組(P＜0.001)、單純順鉑組(P=0.034)小鼠和恩度聯(lián)合順鉑組2(P＜0.001)。

2.2 小鼠平均腹水量及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)

各組小鼠腹水量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A，P＜0.01), 兩兩分析顯示, 生理鹽水組小鼠腹水量顯著高于單純恩度組(P=0.02)、單純順鉑組(P＜0.01)、恩度順鉑聯(lián)合組1(P＜0.01)和恩度順鉑聯(lián)合組2(P=0.01);恩度聯(lián)合順鉑組1小鼠腹水量顯著低于單純恩度組(P＜0.01)、單純順鉑組(P＜0.01)和恩度聯(lián)合順鉑組2(P=0.02)。各組小鼠腹水中紅細(xì)胞數(shù)量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B,P＜0.01)，兩兩分析顯示，生理鹽水組小鼠腹水中紅細(xì)胞量顯著高于各實(shí)驗(yàn)組(均P＜0.01); 恩度聯(lián)合順鉑組1小鼠腹水中紅細(xì)胞含量顯著低于單純恩度組(P＜0.01)和單純順鉑組(P＜0.01)。

圖1 給藥期間各組小鼠體質(zhì)量變化曲線

圖2 給藥期間各組小鼠腹圍變化曲線

2.3 各組小鼠腹水中腫瘤細(xì)胞數(shù)量及凋亡情況

圖3 各組小鼠腹水量及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)

各組小鼠腹水中腫瘤細(xì)胞數(shù)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4A，P＜0.01), 兩兩分析顯示, 生理鹽水組鼠腹水中腫瘤細(xì)胞數(shù)量顯著高于單純恩度組(P=0.01)、單純順鉑組(P＜0.01)、恩度順鉑聯(lián)合組1(P＜0.01)和恩度順鉑聯(lián)合組(P=0.01)，單純順鉑組腹水中腫瘤細(xì)胞數(shù)量與恩度順鉑聯(lián)合組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4B,P＜0.01)，兩兩分析顯示，生理鹽水組小鼠腹水中腫瘤細(xì)胞凋亡率顯著低于順鉑、恩度順鉑聯(lián)合組1和恩度順鉑聯(lián)合組2(均P＜0.01)，但與單純恩度組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 各組小鼠腫瘤細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

各實(shí)驗(yàn)組腹水腫瘤細(xì)胞Bcl-2及HIF1α表達(dá)量均低于生理鹽水組，Bax表達(dá)量均高于生理鹽水組。單純恩度組Bcl-2及HIF1α表達(dá)量變化低于單獨(dú)順鉑組和聯(lián)用順鉑各組(圖5)。

2.5 各組小鼠腫瘤細(xì)胞中VEGF蛋白及VEGF mRNA水平

細(xì)胞中VEGF水平，PCR方法檢測各組小鼠腹水腫瘤細(xì)胞中VEGFmRNA水平，結(jié)果顯示，單純恩度組、恩度聯(lián)合順鉑組1和恩度聯(lián)合順鉑組2小鼠腹水腫瘤細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)量和VEGFmRNA水平均顯著低于生理鹽水組及單純順鉑組，單純順鉑組VEGF蛋白表達(dá)量和VEGFmRNA水平顯著低于生理鹽水組。

2.6 小鼠平均生存時(shí)間

對各組小鼠生存時(shí)間進(jìn)行分析，Logrank分析顯示恩度聯(lián)合順鉑對于小鼠的生存時(shí)間有顯著延長作用(P＜0.001，圖7)。

2.7 順鉑及恩度聯(lián)合作用

根據(jù)以下公式計(jì)算各組小鼠腹水抑制率及CDI，結(jié)果見表3。兩藥聯(lián)用CDI值＜1，說明恩度及順鉑具有協(xié)同作用。

圖4 各組小鼠腹水中腫瘤細(xì)胞數(shù)及腫瘤細(xì)胞凋亡情況

圖5 各組小鼠腹水腫瘤細(xì)胞中Bcl-2、Bax及HIF1α水平

圖6 各組小鼠腹水腫瘤細(xì)胞中VEGF蛋白及VEGF mRNA水平比較

圖7 各組小鼠生曲線

3 討論

研究表明，惡性患者的胸腔積液和腹水中可檢測到高濃度VEGF[10,11]，腫瘤細(xì)胞所釋放的VEGF可造成血管大量生成、血管通透性增加[12,13]。同時(shí)，由于腹水中含有大量腫瘤細(xì)胞，腹水滲漏也有可能造成腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，減少惡性腹水生成并減少腹水中腫瘤細(xì)胞數(shù)量是治療惡性腹水重點(diǎn)。據(jù)報(bào)道[6-9]恩度對于惡性腹水有明顯的抑制作用，而對于腹水中腫瘤細(xì)胞殺傷作用較為溫和; 順鉑可與腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)合，顯著殺傷腫瘤細(xì)胞。為此，本研究采用順鉑與恩度聯(lián)合用藥，旨在研究恩度聯(lián)合順鉑是否可以影響惡性腹水的生成、減少腹水中腫瘤細(xì)胞并延長生存期。

表3 各組腹水抑制率及CDI值

本試驗(yàn)采用小鼠為模型。結(jié)果顯示，恩度和順鉑單獨(dú)使用均可減少小鼠產(chǎn)生的腹水體積，同時(shí)降低腹水中腫瘤細(xì)胞和RBC的數(shù)量，延長注射恩度小鼠的生存時(shí)間，而兩者聯(lián)用效果更好。同時(shí)，先前研究[14]也表明恩度僅能抑制腹水的形成，不能抑制腫瘤的生長。本研究中單獨(dú)使用恩度，不能造成腫瘤凋亡，然而單獨(dú)使用順鉑或者聯(lián)合使用順鉑和恩度，可以顯著增加腹水中腫瘤細(xì)胞的凋亡率。此外，單獨(dú)使用恩度或順鉑組小鼠腹水量及腹水中紅細(xì)胞比例明顯低于對照組小鼠。這說明恩度和順鉑可以有效減少紅細(xì)胞滲漏入腹水; 同時(shí)，聯(lián)用恩度及順鉑組小鼠腹水量、腹水中紅細(xì)胞比例及生存期均顯著優(yōu)于單獨(dú)用藥組小鼠，說明恩度和順鉑聯(lián)用可有效抑制腹水產(chǎn)生，減少腹水中紅細(xì)胞滲透率，延長動(dòng)物生存期。

已有研究表明，內(nèi)皮抑制素的作用與VEGF有關(guān)，VEGF是血管生成的重要調(diào)節(jié)劑[15]，而恩度正是通過與內(nèi)皮抑制素相似的機(jī)制產(chǎn)生抗血管生成的效應(yīng)。與內(nèi)皮抑制素不同，恩度增加了9種氨基酸，從而可以有效提高蛋白質(zhì)的半衰期，并與鋅結(jié)合[16]。當(dāng)被蛋白水解作用激活時(shí)，內(nèi)皮抑制素可通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化及促進(jìn)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗血管生成活性。也有研究證明，內(nèi)皮抑制素可通過與腫瘤細(xì)胞表面受體(如整合素受體)結(jié)合來起到直接的抗腫瘤作用。體外數(shù)據(jù)顯示，內(nèi)皮抑素抑制癌細(xì)胞生長和遷移，阻止G1期癌細(xì)胞，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。此外，它是一種廣譜和低毒多靶點(diǎn)血管生成抑制劑，可抑制多達(dá)65種類型的腫瘤[17]，在治療各種晚期惡性腫瘤方面取得了臨床療效[6,7]。臨床證據(jù)顯示，恩度結(jié)合化療藥物，可在抑制腫瘤發(fā)展中發(fā)揮協(xié)同作用。此外，在廣泛非小細(xì)胞肺癌的患者中聯(lián)合使用恩度和鉑類化療藥物，不會增加鉑類化療藥物的毒性。本研究中恩度及順鉑聯(lián)合給藥優(yōu)于單獨(dú)給藥，分析其原因可能有兩點(diǎn): 首先是順鉑可以直接作用于腫瘤細(xì)胞，從而誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的壞死，而恩度可以降低小鼠腹膜滲透性，減少血管生成; 其次，恩度可以促進(jìn)腫瘤血管功能正?；?，改善局部微環(huán)境，更加有效地促進(jìn)順鉑被輸送到腫瘤組織，從而更有效殺滅腫瘤細(xì)胞。

聯(lián)用恩度及順鉑組小鼠腹水量、腹水中紅細(xì)胞比例及生存期均顯著優(yōu)于單獨(dú)用藥組小鼠，說明恩度和順鉑聯(lián)用具有協(xié)同作用，可有效抑制腹水產(chǎn)生，減少腹水中紅細(xì)胞滲透率，延長小鼠生存期。其中每日給予恩度效果優(yōu)于隔日給予恩度。

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