孫曉敏，嵇　波，趙國(guó)楨，王　丹，嚴(yán)明娜，白紅新，戴　健，路雅雯，劉翼天，葛云鵬，蘇　杭，吳嬌娟，游　敏，程　凱

(北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)

人體體表之間、穴位與臟腑之間、臟腑與體表穴位之間存在著特定的聯(lián)系，這種“內(nèi)屬腑臟、外絡(luò)肢節(jié)”的經(jīng)穴-臟腑相關(guān)學(xué)說(shuō)是古人創(chuàng)立的經(jīng)絡(luò)學(xué)說(shuō)的核心內(nèi)容，也是針灸學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。關(guān)于經(jīng)穴-臟腑相關(guān)的研究多集中于經(jīng)穴感受刺激對(duì)疾病的調(diào)節(jié)方面，包括對(duì)比經(jīng)穴刺激前后臟腑相關(guān)參數(shù)的變化情況[1-2]，刺激不同穴位后比較調(diào)節(jié)臟腑的相關(guān)物質(zhì)等[3-5]。然而《靈樞·九針十二原》記載：“五臟有疾也，應(yīng)出十二原”。強(qiáng)調(diào)各經(jīng)穴對(duì)臟腑病理變化有相應(yīng)的反映。近年來(lái)也有關(guān)于經(jīng)穴反映內(nèi)臟生理和病理變化的研究，如基于臟腑癥狀的不同觀察相關(guān)經(jīng)穴的狀態(tài)[6]，也有人觀察臟腑出現(xiàn)病理性變化后經(jīng)絡(luò)線(xiàn)上經(jīng)穴部位感覺(jué)、形態(tài)和色澤情況[7]、經(jīng)皮氧分壓和微循環(huán)血流灌注變化[8]等，發(fā)現(xiàn)臟腑病變后相關(guān)經(jīng)穴會(huì)有特異性改變。但是關(guān)于臟腑處于不同狀態(tài)下相關(guān)經(jīng)脈不同穴位皮膚血流灌注量的變化研究較少，尤其是這種變化與低頻電針刺激經(jīng)穴和非經(jīng)穴及與治療次數(shù)關(guān)系如何，尚需要明確。本研究使用激光散斑襯比成像技術(shù)，檢測(cè)大鼠處于正常生理狀態(tài)、假手術(shù)狀態(tài)、心肌缺血損傷狀態(tài)、低頻電針“內(nèi)關(guān)”穴干預(yù)狀態(tài)和低頻電針?lè)茄ǜ深A(yù)狀態(tài)時(shí)，心包經(jīng)上“內(nèi)關(guān)”“郄門(mén)”和“天泉”穴區(qū)皮膚血流灌注量，并對(duì)比觀察治療1次和治療3次效應(yīng)的差別，探尋低頻電針經(jīng)穴和非穴通過(guò)對(duì)心肌損傷的調(diào)節(jié)后對(duì)心包經(jīng)不同穴位反映的影響及治療次數(shù)的干預(yù)效應(yīng)，豐富臟腑-經(jīng)穴相關(guān)理論，為臨床治療提供依據(jù)。

1　材料

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

7周齡清潔級(jí)Wistar大鼠60只，雄性，體質(zhì)量控制在200～230 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，室內(nèi)溫度維持在(24±1)℃，相對(duì)濕度保持(45±5)%，使用日光燈照射，12 h明暗交替，飼以普通清潔級(jí)大鼠飼料、自由飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)72 h后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為治療1次組和治療3次組，每大組再分為5小組，包括空白對(duì)照組、假手術(shù)組、心肌缺血損傷組(簡(jiǎn)稱(chēng)模型組)、低頻經(jīng)穴組和低頻非穴組。

1.2　主要試劑和儀器

20%烏拉坦(天津藥業(yè)焦作有限公司生產(chǎn)，批號(hào)06051121)；注射用青霉素鈉(哈藥集團(tuán)制藥總廠(chǎng)生產(chǎn)，批號(hào)CD1408008-1)。

一次性無(wú)菌注射器(山東新華安得醫(yī)療用品有限公司)；無(wú)菌紗布片(北京圣維爾醫(yī)療用品有限公司)；顯微持針鉗(三河市三友醫(yī)療器械廠(chǎng)，批號(hào)131001)；恒溫恒濕實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(SG-H1，南京盛光光電醫(yī)療儀器有限責(zé)任公司)；醫(yī)用冷光源(LG100-2，上海安信光學(xué)儀器制造有限公司)；BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(TM003-0024，成都泰盟科技有限責(zé)任公司)；動(dòng)物呼吸機(jī)(HX-300S，成都泰盟軟件有限公司)；激光散斑血流成像儀(瑞典，Perimed公司)；華佗牌無(wú)菌針灸針(0.20 mm×13 mm，蘇州醫(yī)療用品廠(chǎng)有限公司)；電針儀：二導(dǎo)HAN’s穴位刺激儀(LH202H，北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司)。

2　方法

2.1　模型制備

采用大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)制備心肌缺血損傷模型[9]，連接BL-420E+生物機(jī)能系統(tǒng)以檢測(cè)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電變化情況；假手術(shù)組：對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支只穿線(xiàn)，不結(jié)扎。結(jié)扎后結(jié)扎部位心肌顏色發(fā)紺，心電圖J點(diǎn)抬高，初步證實(shí)造模成功。排除術(shù)后死亡及造模不成功的大鼠。

2.2　取穴

根據(jù)大鼠形態(tài)和定位解剖特點(diǎn)，并參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[10]穴位標(biāo)準(zhǔn)， “內(nèi)關(guān)”位于前肢內(nèi)側(cè)，距腕關(guān)節(jié)約3 mm左右的尺橈骨縫間；“郄門(mén)”位于前肢內(nèi)側(cè)，距腕關(guān)節(jié)約7 mm左右尺橈骨縫間；“天泉”位于腋前橫紋頭下約5 mm左右；非穴為“環(huán)跳”穴外5 mm(后肢髖關(guān)節(jié)后上緣外5 mm)。在檢測(cè)各穴血流灌注量前，用水性筆標(biāo)定大鼠的各個(gè)穴位，檢測(cè)時(shí)用牙簽指示各檢測(cè)穴位，以確保穴位定位的準(zhǔn)確性。

2.3　處理方法

空白對(duì)照組、假手術(shù)組和模型組：常規(guī)飼養(yǎng)，只在電針處理時(shí)抓取并固定1次，以保證處理?xiàng)l件相同，1天或連續(xù)3天；低頻經(jīng)穴組：造模成功后，毫針直刺左側(cè)“內(nèi)關(guān)”穴約0.2 cm，在左側(cè)“內(nèi)關(guān)”穴外上方0.5 cm非穴處，皮下平刺1 mm，連接HANS/LH202型電針儀，頻率為2 Hz，電流強(qiáng)度以大鼠前肢微微顫動(dòng)為度(1 mA)，造模后每日電針處理1次，治療1天或連續(xù)治療3天；低頻非穴組：除電針穴位為非穴外，其余各項(xiàng)同低頻經(jīng)穴組。

2.4　指標(biāo)檢測(cè)

經(jīng)穴區(qū)域皮膚血流灌注量檢測(cè)：治療1次組于電針治療1次后、治療3次組于電針治療3次后進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)前24 h將大鼠雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”“郄門(mén)”和“天泉”穴區(qū)脫毛。調(diào)節(jié)工作環(huán)境，維持溫度(24±1)℃，相對(duì)濕度(55±5)%，并且無(wú)日光直射及明顯空氣對(duì)流。大鼠麻醉后取仰臥位固定于臺(tái)架上，充分暴露待測(cè)部位，PSI預(yù)熱后將大鼠置于激光鏡頭下，檢測(cè)時(shí)控制PSI掃描頭對(duì)準(zhǔn)待測(cè)部位，盡量保持大鼠的相對(duì)安靜。記錄各組檢測(cè)區(qū)域血流圖，用PIMSoft血流儀成像處理軟件進(jìn)行分析。打開(kāi)各組各檢測(cè)區(qū)域血流圖像，定義“內(nèi)關(guān)”“郄門(mén)”和“天泉”為感興趣區(qū)域(ROI)，選擇測(cè)量穴區(qū)面積1.5～2.5 mm2內(nèi)平均血流灌注量(PU)，依據(jù)盲法分別讀取的每個(gè)穴位血流值，求出每只大鼠“內(nèi)關(guān)”“郄門(mén)”和“天泉”區(qū)域血流灌注量數(shù)值。經(jīng)穴穴區(qū)血流灌注量記錄值計(jì)算方法：左、右側(cè)經(jīng)穴穴區(qū)血流灌注量的平均值為經(jīng)穴穴區(qū)血流灌注量記錄值，用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。見(jiàn)封三彩圖1。

心電圖檢測(cè)：血流灌注量檢測(cè)完成后，連接BL420E+生理記錄儀，針形電極分別插入大鼠左前肢(黃色電極)、右后肢(紅色電極)和左后肢(黑色電極)，開(kāi)始記錄各組大鼠心電圖的肢體II導(dǎo)聯(lián)。待心電圖的肢體II導(dǎo)聯(lián)處于平穩(wěn)狀態(tài)時(shí)，取3個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期，分別記錄心電圖中相鄰J點(diǎn)與QRS波起始點(diǎn)的差值作為初始“J點(diǎn)”差值，3個(gè)初始“J點(diǎn)”差值的平均值=“J點(diǎn)”差值，用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3　結(jié)果

3.1　各組大鼠心電圖中“J點(diǎn)”差值

分別縱向比較治療1次組或治療3次組。與空白對(duì)照組相比較，治療1次組和治療3次組的假手術(shù)組“J點(diǎn)”差值均無(wú)顯著差別(P>0.05)，而模型組“J點(diǎn)”差值均顯著升高(P<0.01)；與模型組相比較，治療1次組和治療3次組的低頻經(jīng)穴組“J點(diǎn)”差值均顯著降低(P<0.01)，但是低頻經(jīng)穴組J點(diǎn)差值仍高于空白對(duì)照組“J點(diǎn)”差值；低頻非穴組“J點(diǎn)”差值無(wú)明顯變化(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

橫向?qū)Ρ戎委?次組和治療3次組同一心肌狀態(tài)時(shí)“J”點(diǎn)差值，與治療1次后相比較，空白對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、低頻非穴組“J”點(diǎn)差值在治療3次后有升高趨勢(shì)。

表1　大鼠心電圖“J點(diǎn)”差值的變化

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01

3.2　各組大鼠心包經(jīng)經(jīng)穴皮膚血流灌注量的變化

電針治療1次后，分別縱向比較心包經(jīng)上“內(nèi)關(guān)”“郄門(mén)”和“天泉”穴區(qū)血流灌注量：與空白對(duì)照組相比較，假手術(shù)組3個(gè)穴區(qū)血流灌注量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而模型組3個(gè)穴區(qū)血流灌注量均顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，低頻經(jīng)穴組“內(nèi)關(guān)”和“郄門(mén)”穴區(qū)皮膚血流灌注量分別顯著升高(P<0.01或P<0.05)，而低頻非穴組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，低頻經(jīng)穴組或低頻非穴組“天泉”穴區(qū)無(wú)顯著變化(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　治療1次后心包經(jīng)經(jīng)穴皮膚血流灌注量的變化

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01，▲▲P<0.05

電針治療3次后，分別縱向比較心包經(jīng)上“內(nèi)關(guān)”“郄門(mén)”和“天泉”穴區(qū)皮膚血流灌注量：與空白對(duì)照組相比較，假手術(shù)組3個(gè)穴區(qū)無(wú)顯著差異(P>0.05)，而模型組3個(gè)穴區(qū)皮膚血流灌注量均顯著降低(P<0.01)；與模型組相比較，低頻經(jīng)穴組3個(gè)穴區(qū)皮膚血流灌注量顯著升高(P<0.01或P<0.05)，而低頻非穴組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　治療3次心包經(jīng)經(jīng)穴皮膚血流灌注量的平均值變化

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01，▲▲P<0.05

分別橫向比較“內(nèi)關(guān)”“郄門(mén)”和“天泉”穴區(qū)3次治療后與1次治療后皮膚血流灌注量情況，發(fā)現(xiàn)低頻經(jīng)穴組“內(nèi)關(guān)”穴區(qū)和“天泉”穴區(qū)皮膚血流灌注量均有升高趨勢(shì)，尤其是低頻經(jīng)穴組“天泉”穴區(qū)皮膚血流灌注量升高顯著(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

4　討論

臟腑處于生理狀態(tài)或病理狀態(tài)時(shí)，體表相關(guān)經(jīng)脈不同穴位的反映有一定的差異。如有研究發(fā)現(xiàn)人體處于生理狀態(tài)時(shí)，穴位電阻從井穴到合穴呈遞減趨勢(shì)[11]；當(dāng)人體處于病理狀態(tài)時(shí)，許多廣泛前壁心梗、下壁后壁心梗患者大陵至內(nèi)關(guān)段多表現(xiàn)為單個(gè)小米粒大小的結(jié)節(jié)[7]；電針穴位治療前后，相關(guān)經(jīng)脈不同穴位的經(jīng)皮氧分壓[8]、皮膚溫度[12]的變化存在差異。說(shuō)明機(jī)體狀態(tài)不同，其臟腑相關(guān)經(jīng)脈不同穴位的反應(yīng)存在差異。

激光散斑襯比成像(LSCI)無(wú)需跟蹤劑，不接觸組織，就能一次性采樣大范圍組織和器官的表面血流，把對(duì)血流灌注量的影響降至最低，逐漸成為針灸研究血流灌注量的新興技術(shù)。有研究使用LSI技術(shù)觀測(cè)電針對(duì)正常小鼠肝臟血流灌注量的影響[13]、電針對(duì)不同時(shí)間段酒精性肝損傷小鼠肝臟血流的干預(yù)作用[14]，直觀精確地反映了電針過(guò)程中肝臟表面血流灌注量的變化趨勢(shì)；也有研究使用LSI技術(shù)觀察不同針刺方法刺激健康人合谷穴對(duì)外周皮膚血流灌注量的影響[15]。然而，關(guān)于臟腑處于不同狀態(tài)對(duì)相關(guān)經(jīng)脈不同穴位血流灌注量的對(duì)比研究較少。因此，本研究借助心肌缺血損傷大鼠模型，比較心肌處于生理狀態(tài)、缺血損傷病理狀態(tài)、低頻電針刺激經(jīng)穴或非穴時(shí)，心包經(jīng)上“內(nèi)關(guān)”“郄門(mén)”和“天泉”穴區(qū)血流灌注量的變化情況，并橫向比較治療1次和治療3次后效應(yīng)的差別，探尋低頻電針經(jīng)穴和非穴通過(guò)對(duì)心肌損傷的調(diào)節(jié)后對(duì)心包經(jīng)不同穴位反映的影響及治療次數(shù)的干預(yù)效應(yīng)。

《靈樞·經(jīng)絡(luò)》載：“手心主之別，名曰內(nèi)關(guān)。去腕2寸，出于兩筋之間，別走少陽(yáng)，循經(jīng)以上系于心包，絡(luò)心系，心系實(shí)則心痛，虛則煩心?！闭f(shuō)明內(nèi)關(guān)穴為手厥陰心包經(jīng)絡(luò)穴，主治心痛、心悸、胸悶等心臟疾病。研究發(fā)現(xiàn)[16]針刺內(nèi)關(guān)穴可有效減少無(wú)癥狀心肌缺血患者的ST段壓低持續(xù)時(shí)間和壓低次數(shù)，能降低心率和體循環(huán)動(dòng)脈血壓；還有研究發(fā)現(xiàn)[17]，針刺“內(nèi)關(guān)”可緩解心肌缺血大鼠小動(dòng)脈痙攣，改善心肌缺血。本課題前期研究[12,18-19]也證實(shí)，電針“內(nèi)關(guān)”穴對(duì)急性心肌缺血大鼠的心電圖“J”點(diǎn)差值，心肌肌鈣蛋白、肌酸激酶以及心肌組織形態(tài)等有明顯的改善作用，一定程度上進(jìn)一步明確了針刺“內(nèi)關(guān)”穴改善大鼠急性心肌缺血的確切效應(yīng)。在本研究中，結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支后第1天和第3天，心電圖“J”點(diǎn)差值較空白對(duì)照組均顯著升高，提示大鼠處于心肌缺血損傷狀態(tài)；低頻電針“內(nèi)關(guān)”穴后，大鼠心電圖“J”點(diǎn)差值顯著下降，說(shuō)明低頻電針“內(nèi)關(guān)”穴對(duì)心肌缺血損傷有一定的修復(fù)作用，橫向比較治療3天和治療1天各組大鼠心電圖“J”點(diǎn)差值，治療3天時(shí)正常組、假手術(shù)組、模型組和低頻非穴組均高于治療1天，正常組和假手術(shù)組可能與大鼠麻醉后身體虛弱，進(jìn)食飲水較正常減少有關(guān)；模型組和低頻非穴組與心肌持續(xù)缺血有關(guān)。

本研究顯示大鼠處于生理狀態(tài)時(shí)， “內(nèi)關(guān)”“郄門(mén)”和“天泉”穴血流灌注量呈遞增趨勢(shì)，這與穴位循經(jīng)性理論相一致。皮膚血流灌注量變化由交感神經(jīng)調(diào)控，且以交感縮血管神經(jīng)支配為主[20]。在心肌缺血時(shí)，皮膚等交感神經(jīng)分布密集的器官內(nèi)血管會(huì)明顯收縮，以保證重要組織器官的血流供應(yīng)，此時(shí)皮膚血流灌注量減少[12]，因此，大鼠處于心肌缺血狀態(tài)時(shí)，“內(nèi)關(guān)”“郄門(mén)”和“天泉”穴皮膚血流灌注量顯著下降。

內(nèi)關(guān)是心包經(jīng)絡(luò)穴，臨床實(shí)踐表明以?xún)?nèi)關(guān)為主治療無(wú)癥狀心肌缺血有顯著療效[16]；郄門(mén)是手厥陰心包經(jīng)郄穴，與心臟存在特異性聯(lián)系；有電刺激貓左心下神經(jīng)發(fā)現(xiàn)左“天泉”穴區(qū)與左心下神經(jīng)有相對(duì)特異性聯(lián)系[21]；3個(gè)穴位分別位于心包經(jīng)上、中、下3個(gè)位置，所處位置具有層次性，所以選擇以上3個(gè)穴位觀測(cè)不同心肌狀態(tài)下心包經(jīng)經(jīng)穴血流灌注量的變化。低頻電針“內(nèi)關(guān)”穴治療1次時(shí)，“內(nèi)關(guān)”“郄門(mén)”穴血流灌注量較心肌缺血狀態(tài)時(shí)顯著升高，但“內(nèi)關(guān)”穴較“郄門(mén)”穴更接近空白對(duì)照組，這可能與郄門(mén)是心包經(jīng)郄穴，氣血變化最先反應(yīng)在經(jīng)脈深層有關(guān)。

針刺治病的時(shí)效關(guān)系是針灸臨床中普遍存在的問(wèn)題，有研究通過(guò)對(duì)中風(fēng)偏癱病人皮膚痛閾的針刺前后變化比較，證明日針2次的療效明顯優(yōu)于日針1次，療程一定時(shí)增加刺激量可提高療效[22]，在此基礎(chǔ)上又有研究證明日針3次的療效明顯優(yōu)于日2次[23]。本研究低頻電針“內(nèi)關(guān)”穴治療3次時(shí)，“內(nèi)關(guān)”“郄門(mén)”和“天泉”穴血流灌注量較心肌缺血狀態(tài)時(shí)顯著升高，而治療1次時(shí)“天泉”穴血流灌注量較心肌缺血狀態(tài)時(shí)無(wú)明顯變化，提示治療次數(shù)的增加影響針刺療效，治療3次對(duì)心肌缺血的改善程度優(yōu)于治療1次，但治療3次是否是最優(yōu)針刺方法，還需進(jìn)一步研究。

有研究表明電針心包經(jīng)的大陵、郄門(mén)、曲澤穴均有改善心動(dòng)過(guò)緩大鼠心率與心功能，而非穴未呈現(xiàn)此功能[24]。本研究對(duì)比觀察低頻電針“內(nèi)關(guān)”穴和非穴對(duì)心肌缺血大鼠心包經(jīng)上“內(nèi)關(guān)”“郄門(mén)”和“天泉”穴血流灌注量的變化，發(fā)現(xiàn)低頻電針“內(nèi)關(guān)”穴時(shí)，3個(gè)穴區(qū)淺血流灌注量較心肌缺血狀態(tài)時(shí)顯著升高，低頻電針?lè)茄〞r(shí)，3個(gè)穴區(qū)血流灌注量較心肌缺血狀態(tài)時(shí)無(wú)明顯變化，提示低頻電針經(jīng)穴可能通過(guò)抑制交感神經(jīng)的興奮性，舒張血管，從而提高相關(guān)經(jīng)脈同經(jīng)異穴血流灌注量，而低頻電針?lè)茄o(wú)此作用，進(jìn)一步證實(shí)了經(jīng)穴的針刺效應(yīng)優(yōu)于非經(jīng)穴，與以往研究相符。

綜上所述，大鼠心包經(jīng)上“內(nèi)關(guān)”穴皮膚血流灌注量更能特異性反映大鼠心肌狀態(tài)，與心肌缺血損傷后低頻電針刺激的穴位和治療次數(shù)有一定的相關(guān)性。